結(jié)縷草ZjNAC基因的克隆與表達(dá)分析

張胤冰，孫鑫博，樊波，韓烈保，張雪，袁建波，許立新*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2.河北省作物生長調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001)

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結(jié)縷草ZjNAC基因的克隆與表達(dá)分析

張胤冰1，孫鑫博2，樊波1，韓烈保1，張雪1，袁建波1，許立新1*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2.河北省作物生長調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001)

摘要：NAC類家族的基因是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，并且它在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。本研究以結(jié)縷草為研究材料，對結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫利用local blast的辦法克隆出1個(gè)NAC類轉(zhuǎn)錄因子。為深入探討和研究NAC類轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境生理上的作用奠定基礎(chǔ)。通過與水稻的OsNACs家族成員進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)合蛋白分析，QRT-PCR等的方式探索其生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因長度為1496 bp，包含1個(gè)完整開放閱讀框(ORF)，長度為1332 bp，編碼449個(gè)氨基酸，該蛋白含有1個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域。與水稻的NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹對比發(fā)現(xiàn)，它與OsNAC036近緣性最高，因此將該基因命名為ZjNAC036。QRT-PCR結(jié)果顯示，該基因在干旱情況下表達(dá)量呈上升趨勢，并且干旱處理8 h的時(shí)候，差異倍數(shù)最大，達(dá)到了50倍左右，而在鹽脅迫、低溫脅迫下沒有規(guī)律性變化。這表明ZjNAC036在干旱逆境生理上可能有重要的作用，而在高鹽及寒冷的逆境生理方面可能作用不大。

關(guān)鍵詞：結(jié)縷草；NAC轉(zhuǎn)錄因子；進(jìn)化樹；表達(dá)分析

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)，禾本科結(jié)縷草屬，原產(chǎn)于亞洲東南部，是一種耐高溫，耐干旱的C4類暖季型草坪草，由于其抗逆性強(qiáng)，耐踐踏，再生性強(qiáng)等優(yōu)良特性而成為了我國重要的草坪草種質(zhì)資源[1-3]。結(jié)縷草是異源四倍體植株，具有相當(dāng)小的基因組尺寸[4]，這些使得結(jié)縷草成為了重要的草坪模式植物。而干旱目前成為了全球共同關(guān)注的難題，我國也是如此，水資源短缺成為了限制植物生長發(fā)育，尤其是限制草坪草正常生長的重要因素[5-6]。因此，在園林綠化及運(yùn)動球場綠地的節(jié)水灌溉成為當(dāng)前研究草坪草的焦點(diǎn)，通過生物技術(shù)方法培育耐旱耐鹽新品種也成為一項(xiàng)重要的手段。

近年來，如TCP，MYB類的植物轉(zhuǎn)錄因子被廣泛研究，其中，NAC作為植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，是目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。研究表明，NAC家族基因參與多種植物的發(fā)育及形態(tài)建成，并且在植物的生長發(fā)育，器官發(fā)育以及各種生物，非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要的作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白都含有1個(gè)靠近N端的，高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，可以聯(lián)結(jié)DNA以及其他蛋白[7]。其命名來自于矮牽牛(Petuniahybrida)的NAM基因以及擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ATAF1，ATAF2，CUC2基因。最早發(fā)現(xiàn)是在矮牽牛的突變體中，這個(gè)突變體的胚胎不含有頂端分生組織，無法形成莖頂端分生組織，經(jīng)鑒定是一個(gè)NAM基因，與其他幾個(gè)未知基因共有1段保守的N端區(qū)域[8]。而后Aida等[9]在擬南芥的杯狀子葉突變體中克隆了CUC2基因，該基因編碼的蛋白N末端與矮牽牛NAM蛋白具有較高的同源性。這一基因在植物胚胎及花器官的發(fā)育中扮演了重要的角色。隨后在水稻(Oryzasativa)，小麥(Triticumaestivum)等物種中相繼發(fā)現(xiàn)，目前研究顯示，在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)了105個(gè)NAC成員，水稻中發(fā)現(xiàn)了75個(gè)NAC成員[10]，研究表明，NAC類轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育，器官建成方面發(fā)揮著十分重要的作用[11]。Yamaguchi等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥中的一個(gè)NAC domain的轉(zhuǎn)錄因子VND-INTERACTING2對擬南芥的木質(zhì)部導(dǎo)管分化起到負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)脅迫誘導(dǎo)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因在干旱、高鹽等非生物脅迫中直接或間接地參與調(diào)控作用[13]。Hu等[14]發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)SNAC1基因可以增強(qiáng)水稻的耐脅迫能力。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)SNAC2，ONAC045等可以增強(qiáng)水稻的耐低溫、干旱以及高鹽的能力[15-16]。擬南芥ATAF1基因受干旱、高鹽、ABA、病原菌等誘導(dǎo)表達(dá)，過量表達(dá)該基因能明顯提高植株耐旱性[17]。并且研究顯示ATAF2對某些擬南芥病程相關(guān)蛋白起抑制作用[18]。Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)ONAC045基因提高了水稻的耐干旱能力。過量表達(dá)ABA響應(yīng)基因OsNAC52，可以激活轉(zhuǎn)基因擬南芥下游基因的表達(dá)，從而提高了植物的耐旱性[19]。一個(gè)脅迫誘導(dǎo)基因ZmSNAC1在擬南芥中過量表達(dá)后，可以提高幼苗對脫水脅迫的耐受力[20]。在擬南芥中，過量表達(dá)高粱(Sorghumvulgare)的NAC基因SbSNAC1后，與野生型相比明顯提高了抗旱能力[21]。目前，從各種植物中克隆到了許多的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，并發(fā)現(xiàn)其參與并調(diào)控了許多植物非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制，尤其是干旱脫水脅迫，如擬南芥ATAF1，水稻SNAC1，煙草(Nicotianatabacum)NtNAC-R1[22]等，但是在草坪草日本結(jié)縷草中卻鮮有報(bào)道。

本研究利用local blast的辦法，從結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組比對得到了ZjNAC036基因序列，并通過RT-PCR等方法從日本結(jié)縷草中分離出了該基因。生物信息學(xué)預(yù)測了該基因的功能，并對該基因在脅迫處理下的時(shí)間及空間表達(dá)模式進(jìn)行了分析，研究其與抗旱的相關(guān)性，為結(jié)縷草抗旱性分子育種奠定技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)為該基因的進(jìn)一步研究與利用提供有效的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用的日本結(jié)縷草品種compadre，采自于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所。2014年6月種植于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所智能溫室[(25±1)℃，16 h光照，12000 lx, 8 h黑暗，相對濕度75%]中。先將種子播種于穴盤中，發(fā)芽3周后，將幼苗轉(zhuǎn)移至直徑15 cm，深14.5 cm的花盆中，土壤成分為沙土和蛭石(1∶1)。出苗8周后用150 mmol/L NaCl，4℃低溫及20% PEG6000分別處理材料。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置了8個(gè)取樣點(diǎn)，分別為0，1，2，4，8，12，24，48 h，取不同處理時(shí)間的葉片，液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol 總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)分別提取日本結(jié)縷草葉片的總RNA。用DNaseⅠ(Promega，美國)去除剩余的基因組DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用Nanodrop 2000 檢測其濃度及純度。以總RNA為模板，合成cDNA(全式金，AE301)，儲存于-20℃冰箱備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3ZjNAC基因的克隆

通過結(jié)縷草根部的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)初步分析，得到了一段含有NAC轉(zhuǎn)錄因子家族NAM 結(jié)構(gòu)域的序列，比對分析其包含有完整的ORF區(qū)。根據(jù)序列片段設(shè)計(jì)1對基因特異性引物，QS: 5′ATGGCGCAAACTAGCCTGCCTCC3′；QA:5′TTCCAGGTCAATCAGGGGAATGGG3′，以日本結(jié)縷草總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因，獲得包含有完整ORF的ZjNAC基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸110 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用DNA回收試劑盒回收，純化目的片段，與pMD?18-T載體(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，菌液PCR鑒定。

1.4測序與分析

經(jīng)鑒定的陽性克隆菌液送Invitrogen生命技術(shù)公司進(jìn)行測序。序列分析及同源性分析采用NCBI的blast在線分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)及DNAMAN等軟件分析。利用NCBI比對序列查找完整的ORF框。利用PBIL-IBCP在線預(yù)測ZjNAC036蛋白的二級結(jié)構(gòu)。Blastx搜索其他物種的相似蛋白，用DNAMAN進(jìn)行序列的多重比對，MEGA6軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.5ZjNAC的表達(dá)分析

利用BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對日本結(jié)縷草compadre的各種脅迫取樣點(diǎn)的cDNA模板進(jìn)行熒光相對定量分析。目的基因的擴(kuò)增引物為：Actin的擴(kuò)增引物為Actin-F: 5′GCTCAGTCCAAGAGAGGTATTCA3′，Actin-R: 5′TGATGCCAGATCTTCTCCATATC3′。qRT-PCR反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系。qRT-PCR 的反應(yīng)程序采用三步法，程序如下：50℃ 2 min；94℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s；58℃退火20 s；72℃延伸15 s；65℃ 5 s；95℃ 5 s；39個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理樣品設(shè)兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1結(jié)縷草ZjNAC036基因克隆與序列分析

圖1　ZjNAC036基因的PCR結(jié)果Fig.1　PCR product of ZjNAC036 gene

通過克隆和RT-PCR方法，從結(jié)縷草中克隆到ZjNAC036新基因。以結(jié)縷草的cDNA為模板，以ZjNAC-F，ZjNAC-R為引物擴(kuò)增目的基因，均獲得大小約為1000 bp的片段(圖1)。PCR產(chǎn)物回收純化后連接T1中間載體，經(jīng)測序分析結(jié)果顯示，該基因的全長為1496 bp，含有1332 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，共編碼449個(gè)氨基酸，相對分子量為50.13 kDa，理論等電點(diǎn)為4.15(圖2)。含有堿性氨基酸(H，K，R)42個(gè)；酸性氨基酸(D，E)72個(gè)。該蛋白中相對含量比較多的氨基酸為絲氨酸(Ser)39個(gè)；谷氨酸(Glu)37個(gè)，含量比較少的氨基酸為色氨酸(Trp)5個(gè)；半胱氨酸(Cys)9個(gè)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫分析該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，在N端包含有一個(gè)典型的NAM保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。經(jīng)NCBI/BLASTx分析表明該序列與玉米NAC類的基因相似度最高，達(dá)到79%，由此推測克隆得到的基因?yàn)镹AC類轉(zhuǎn)錄因子基因，后經(jīng)過與水稻的NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族成員的比對發(fā)現(xiàn)，該基因與水稻OsNAC036的親緣關(guān)系最近，故將結(jié)縷草的NAC家族基因命名為ZjNAC036。

利用PBIL-IBCP在線預(yù)測ZjNAC036蛋白的二

級結(jié)構(gòu)(圖4)，結(jié)果表明，ZjNAC036蛋白含有α螺旋28.51%，β轉(zhuǎn)角7.35%，無規(guī)則卷曲49.67%，延伸鏈14.48%。其中，無規(guī)則卷曲所占的比例最高，連接著其他二級結(jié)構(gòu)原件，如α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。利用HMMTOP在線軟件預(yù)測表明該蛋白沒有跨膜區(qū)域。

2.2ZjNAC036基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)Ooka等[10]發(fā)表的文章，獲得水稻中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族所有成員基因的序列號，然后從NCBI網(wǎng)站上檢索并獲得這些NAC家族基因序列，進(jìn)而構(gòu)建ZjNAC與水稻所有NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)的進(jìn)化關(guān)系表明，日本結(jié)縷草ZjNAC036與水稻的OsNAC036的同源性最高。

2.3ZjNAC036基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示(圖5)，以水處理的日本結(jié)縷草為對照，通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析了干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫下的結(jié)縷草葉片中ZjNAC036基因的時(shí)空表達(dá)。發(fā)現(xiàn)該基因在干旱脅迫處理的2～48 h間的表達(dá)量均高于對照水平，在處理4 h時(shí)基因的表達(dá)量顯著提高，8 h時(shí)達(dá)最大表達(dá)量。隨著處理時(shí)間的延長，12 h后，表達(dá)量下降；在鹽脅迫處理后的2 和24 h，表達(dá)量下調(diào)，其余時(shí)間段呈上升趨勢；在低溫脅迫下，該基因在1 和2 h時(shí)，表達(dá)量下調(diào)，而從3 到48 h，該基因表達(dá)量都高于對照。結(jié)果表明，ZjNAC036基因受干旱誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)，干旱條件下，表達(dá)量上調(diào)；而高鹽和低溫脅迫下，該基因并無明顯規(guī)律變化。

3討論

NAC類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類調(diào)控因子，一般通過與目標(biāo)基因的啟動子中特定的DNA序列相結(jié)合從而達(dá)到激活或抑制其靶基因的表達(dá)[23-24]。本研究通過電子克隆及RT-PCR的方法，獲得了日本結(jié)縷草的一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因：ZjNAC036，利用相關(guān)的生物信息學(xué)軟件對該基因的堿基序列及氨基酸序列進(jìn)行比對分析后，發(fā)現(xiàn)該基因上具有植物特異性的NAC轉(zhuǎn)錄因子特征，如蛋白的N端具有相對保守的NAC功能結(jié)構(gòu)域，因此推測該基因?qū)儆贜AC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。已有研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端存在一個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域一般由約150個(gè)氨基酸組成。而其C端是變化多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[7]。本研究中得到的ZjNAC036基因的蛋白序列，經(jīng)與其他物種比對分析后發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)錄因子在NAC結(jié)構(gòu)域處序列高度保守，尤其是與谷子(Setariaitalica)和玉米(Zeamays)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的蛋白同源性最高，該結(jié)果表明日本結(jié)縷草在進(jìn)化上與谷子和玉米的親緣關(guān)系最近。而在C端的序列差異較大，這種結(jié)構(gòu)說明了ZjNAC036蛋白具有NAC家族的高度保守性，并且具有激活功能的多樣性，也表明該蛋白在結(jié)縷草中可能發(fā)揮著十分重要的作用。

目前研究表明，NAC類轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物的生長發(fā)育過程，還直接或間接的在植物的生物及非生物脅迫的響應(yīng)中起到十分重要的作用[23]。Hu等[15]研究顯示，水稻SNAC1基因受保衛(wèi)細(xì)胞脫水誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻與野生型相比展現(xiàn)出更好的耐旱性和耐鹽性。本課題組對日本結(jié)縷草NAC轉(zhuǎn)錄因子ZjNAC036基因的非生物脅迫進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)在高鹽，低溫環(huán)境的脅迫下，該基因表達(dá)量總體呈上升趨勢，但并未有明顯的相關(guān)性，而在干旱脅迫下表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，不同處理間的差異達(dá)到極顯著水平，說明ZjNAC036基因可能參與調(diào)控植物的干旱相關(guān)的響應(yīng)機(jī)制，并且很有可能是特異響應(yīng)干旱脅迫的基因。

圖3　ZjNAC036蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3　Conserved domain of ZjNAC036 protein

圖4　ZjNAC036蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4　Predicted secondary structure of ZjNAC036 protein　藍(lán)色：α-螺旋；紅色：延伸鏈；綠色：β-轉(zhuǎn)角；淺紫色：無規(guī)則卷曲。Blue: Alpha helix; Red: Extended strand; Green: Beta turn; Purple: Random coil.

圖5　ZjNAC036基因在脅迫誘導(dǎo)后的相對表達(dá)量

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在參與植物生長發(fā)育及生物、非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，具有普遍的生物學(xué)功能多效性，使其在植物的生物育種實(shí)踐中具有較大的應(yīng)用潛力。如擬南芥(ATAF1，ATAF2，DR26)，水稻(SNAC1，ONAC045)等，而結(jié)縷草中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員研究甚少，大部分的成員功能尚未確定。本實(shí)驗(yàn)克隆到的ZjNAC036基因受非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，可能在結(jié)縷草抗逆遺傳改良中具有一定的利用價(jià)值，為今后的深入研究提供有效的證據(jù)。

4結(jié)論

本研究從日本結(jié)縷草中克隆得到了1個(gè)NAC類轉(zhuǎn)錄因子，命名為ZjNAC036。該基因包含一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，推測編碼449個(gè)氨基酸。ZjNAC036蛋白N端中含有一個(gè)NAM保守結(jié)構(gòu)域。ZjNAC036基因受干旱誘導(dǎo)，在該條件下，表達(dá)量出現(xiàn)了上調(diào)，且在處理8 h，表達(dá)量差異最大。

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Cloning and expression ofZjNACfromZoysiajaponica

ZHANG Yin-Bing1, SUN Xin-Bo2, FAN Bo1, HAN Lie-Bao1, ZHANG Xue1, YUAN Jian-Bo1, XU Li-Xin1*

1.InstituteofTurfgrassScience,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China； 2.KeylaboratoryofcropgrowthregulationofHebeiProvince,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China

Abstract:Proteins in the NAC family (including NAM, ATAF1/2, and CUC2 proteins) are plant-specific transcription factors that play critical roles in plant development. To explore and exploit the excellent resistance-gene resources of zoysia (Zoysia japonica), a gene encoding a NAC transcription factor (ZjNAC) was cloned by blasting the Zoysia transcriptome database. The biological function of the cloned ZjNAC gene was explored by a phylogenetic analysis with OsNACs of rice (Oryza sativa) combined with protein and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses. The bioinformatics analysis showed the cloned ZjNAC gene was 1496 bp long, and contained a 1332 bp open reading frame (ORF) encoding 449 amino acids with a NAM domain. In a phylogenetic analysis, the cloned ZjNAC gene showed the highest homology to OsNAC036 from rice, and so the cloned gene was designated as ZjNAC036. The qRT-PCR analysis showed that ZjNAC transcript levels increased under drought stress, reaching peak levels (approximately 50-fold that in the control) after 8 h of drought stress. The transcript levels of ZjNAC did not show obvious variations under salt stress or cold stress. Together, these results show that the protein encoded by ZjNAC036 may play an important role in the drought stress response, rather than the salt or cold stress responses.

Key words:Zoysia japonica; NAC transcription factor; phylogenetic tree; expression analysis

*通信作者

Corresponding author. E-mail: lixinxu@bjfu.edu.cn

作者簡介：張胤冰(1990-)，女，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士。E-mail：13020019042@163.com

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(BLX2012034)和國家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102607)資助。

*收稿日期：2015-09-23；改回日期：2015-11-30

DOI：10.11686/cyxb2015453

http://cyxb.lzu.edu.cn

張胤冰，孫鑫博，樊波，韓烈保，張雪，袁建波，許立新. 結(jié)縷草ZjNAC基因的克隆與表達(dá)分析.草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(4): 239-245.

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