袁奇超，蔣　犁，朱麗華，虞大凡

東南大學醫(yī)學院　附屬中大醫(yī)院兒科，南京 210009

?

·論著·

重組人促紅細胞生成素在腦白質(zhì)損傷新生鼠經(jīng)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路對血管內(nèi)皮生長因子受體2的影響

袁奇超，蔣犁，朱麗華，虞大凡

東南大學醫(yī)學院附屬中大醫(yī)院兒科，南京 210009

摘要：目的探討重組人促紅細胞生成素在腦室周圍白質(zhì)損傷中顱內(nèi)經(jīng)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路對血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的影響。方法選取出生后4日齡SD大鼠，采用隨機數(shù)余數(shù)分組法分為假手術(shù)組、缺氧缺血組和藥物干預組。缺氧缺血和藥物干預組幼鼠結(jié)扎右側(cè)頸總動脈并吸入6%的氮氧混合氣體2 h，假手術(shù)組幼鼠僅游離右側(cè)頸總動脈。藥物干預組腦室內(nèi)給予重組人促紅細胞生成素1次(0.6 IU/g體質(zhì)量)，假手術(shù)組和缺氧缺血組給予等量的生理鹽水。用Western blot方法檢測術(shù)后60、90 min腦組織中的ERK和磷酸化-ERK及術(shù)后2、4 d腦組織中的VEGFR2表達情況。結(jié)果術(shù)后60及90 min，缺氧缺血組磷酸化-ERK較假手術(shù)組顯著增多(P<0.05)，促紅細胞生成素干預后磷酸化-ERK表達進一步上調(diào)(P<0.05)。術(shù)后2 d，缺氧缺血組和假手術(shù)組大鼠的VEGFR2表達差異無統(tǒng)計學意義，術(shù)后4 d缺氧缺血組VEGFR2表達增加(P<0.05)，藥物干預組VEGFR2的表達較缺氧缺血組顯著增加(P<0.05)。結(jié)論促紅細胞生成素可能通過影響顱內(nèi)ERK信號通路調(diào)節(jié)VEGFR2的表達。

關(guān)鍵詞：促紅細胞生成素；腦室周圍白質(zhì)損傷；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；血管內(nèi)皮生長因子受體2

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：217-221

腦室周圍白質(zhì)損傷(periventricular white matter damage，PWMD)是早產(chǎn)兒腦損傷最常見、最嚴重的類型，是一種由于感染、缺氧/缺血等因素引起的以腦白質(zhì)損傷為主的腦損傷形式[1]。關(guān)于PWMD的治療，目前尚無特效療法，避免導致PWMD發(fā)生的各種危險因素是關(guān)鍵，一旦發(fā)現(xiàn)PWMD患兒應盡早干預，以提高其生活質(zhì)量。根據(jù)早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷發(fā)生的原因及其機制，目前可能的干預措施包括產(chǎn)前應用硫酸鎂、糖皮質(zhì)激素、抗生素、褪黑素、別嘌呤醇、N-乙酰半胱氨酸、一氧化氮合酶抑制劑、維生素E等，產(chǎn)后應用促紅細胞生成素及其衍生物、低溫治療、惰性氣體、褪黑素、別嘌呤醇、神經(jīng)營養(yǎng)因子、吸入一氧化氮、維生素E、托吡脂、消炎痛、細胞因子拮抗劑、細胞移植等。有研究表明重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rh-EPO)給早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的干預及治療帶來了一線曙光[2- 3]。然而，對其具體通路機制的研究國內(nèi)外少有報道。本研究建立新生大鼠PWMD模型，初步探討rh-EPO對細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK) 信號通路的影響。

材料和方法

實驗動物及分組清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，購自南京軍區(qū)醫(yī)學動物實驗中心[許可證號SLXK(軍)]，東南大學動物實驗中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為22℃±2℃，晝夜周期12 h/12 h。大鼠合籠分娩后取新生4日齡SD幼鼠120只，雌雄不限，體質(zhì)量11.0～13.2 g。采用隨機數(shù)余數(shù)分組法隨機分為假手術(shù)組、缺氧缺血組(結(jié)扎右側(cè)頸總動脈后通低濃度的氧氣)和藥物干預組(注射促紅細胞生成素)，每組40只。

PWMD動物模型制備及給藥參照文獻[4]建立的PWMD動物模型制作方法，異氟烷吸入麻醉1～2 min后固定于仰臥位，頸部正中切口，缺血缺氧組及藥物干預組分離并永久性結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，術(shù)畢縫合切口，術(shù)中出現(xiàn)大量出血的幼鼠被剔除。術(shù)后放回母鼠籠中恢復2～3 h，然后送入37℃恒溫箱中并通入混合氣體(6% O2、94% N2)2 L/min持續(xù)2 h。假手術(shù)組幼鼠僅游離右側(cè)頸總動脈，未予結(jié)扎和缺氧。藥物干預組術(shù)后固定于腦立體定位儀上，頭皮消毒，作一切口暴露前囟點，立體定位于右側(cè)腦室(坐標：前囟點后1.0 mm，側(cè)1.0 mm，深2.5 mm)，經(jīng)幼鼠腦定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號68507)將0.6 IU/g體質(zhì)量rh-EPO(益比奧，規(guī)格：3 000 IU/ml，批號：國藥準字S19980074，廠家：沈陽三生制藥有限責任公司)經(jīng)微量注射器緩慢注入腦內(nèi)持續(xù)5 min，然后留針2 min再緩慢拔出，假手術(shù)組和缺氧缺血組經(jīng)相同的方法腦立體定位后給予相同體積的生理鹽水。

Western blot檢測總ERK及磷酸化的ERK分別于術(shù)后60、90 min，每組各取8只，異氟烷吸入麻醉后斷頭取腦，游離出幼鼠右側(cè)大腦半球，檢測總ERK及磷酸化的ERK(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase，P-ERK)；分別于術(shù)后2、4 d，每組各取8只，游離出幼鼠右側(cè)大腦半球，檢測血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)。各腦組織取50 mg，與加樣緩沖液4∶1體積混合，煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜后放入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗兔抗大鼠ERK抗體(1∶1 000，抗-ERK1+ERK2 抗體，ab115799，abcam)或抗P-ERK(磷酸化Y204)抗體(1∶500，抗-ERK1抗體，ab131438，abcam)或抗VEGFR2(1∶1 000，抗-VEGFR2抗體，ab10972，abcam)抗體，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶5 000羊抗兔 IgG H&L，ab6721，abcam或1∶5 000，羊抗鼠 IgG H&L，ab6789，abcam)室溫孵育1.5 h，化學發(fā)光法顯影及定影，以GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果用Image-J軟件J(version 1.38)進行灰度分析，采用目的蛋白條帶與內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值的比值作為結(jié)果，以此表示目的蛋白的表達水平。

結(jié)果

一般情況120只SD大鼠造模過程中及術(shù)后共死亡24只，死亡率20.0%；其中缺血缺氧組死亡12只，死亡率27.3%；藥物干預組死亡9只，死亡率21.9%；對照組死亡3只，死亡率8.5%。術(shù)后缺血缺氧組和藥物干預組大鼠未見明顯發(fā)紺，有活動減少、喂養(yǎng)困難、體質(zhì)量增長緩慢表現(xiàn)，且缺血缺氧組表現(xiàn)相對明顯；對照組體質(zhì)量增長正常。對照組大鼠雙側(cè)腦室大小相似，染色均一，細胞排列整齊，形態(tài)大小均正常。缺血缺氧組大鼠右側(cè)腦室較對側(cè)明顯增大，腦室形狀不規(guī)則，白質(zhì)區(qū)著色較淺，細胞排列疏松、層次混亂，可見水腫，細胞周圍間隙增寬，部分神經(jīng)細胞變性、壞死。而且，缺氧缺血組大鼠有遠期運動發(fā)育、學習和記憶障礙。

總ERK及磷酸化ERK表達變化ERK蛋白檢測結(jié)果顯示，3組術(shù)后60 min(F=2.45，P=0.21)和90 min(F=1.98，P=0.33)總ERK差異均無統(tǒng)計學意義。磷酸化ERK蛋白檢測結(jié)果顯示，缺氧缺血組大鼠術(shù)后60、90 min磷酸化ERK蛋白較假手術(shù)組顯著增加，經(jīng)rh-EPO治療后，磷酸化ERK蛋白明顯高于缺氧缺血組(P均<0.05)(圖1)。

VEGFR2表達變化術(shù)后2 d，缺氧缺血組大鼠VEGFR2 表達與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，經(jīng)rh-EPO治療后，VEGFR2進一步增加，且與假手術(shù)組及缺氧缺血組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術(shù)后4 d，缺氧缺血組大鼠VEGFR2表達較假手術(shù)組顯著增加，且經(jīng)rh-EPO干預后，VEGFR2進一步增加(P均<0.05)(圖2)。

討論

早產(chǎn)兒是神經(jīng)系統(tǒng)受損的高危人群，其腦癱發(fā)病率并未隨著存活率增高而降低。目前早產(chǎn)兒腦損傷治療方法仍處于臨床研究階段，及時EPO治療是目前研究較多的熱點，大部分研究得到肯定作用，但其中的機制仍在研究中。了解EPO對新生兒神經(jīng)保護作用的相關(guān)機制并將其與臨床研究相結(jié)合，是臨床治療的前提和基礎(chǔ)。有研究顯示，在鼠PWMD模型中，rh-EPO促進了腦白質(zhì)區(qū)的血管新生反應[5]。而本研究顯示這種血管新生反應可能通過影響顱內(nèi)分裂原活化抑制劑/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路進行調(diào)節(jié)。

ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；P-ERK：磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；GAPDH：甘油醛- 3-磷酸脫氫酶；HI：缺血缺氧；EPO：促紅細胞生成素；Mr:相對分子質(zhì)量；與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與HI組比較，bP<0.05ERK：extracellular signal-regulated kinase；P-ERK：phosphorylation extracellular signal-regulated kinase；GAPDH：glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase；HI：hypoxia-ischemia；EPO：erythropoietin；Mr:relative molecular mass;aP<0.05 compared with the sham group；bP<0.05 compared with the HI group

圖 1ERK及磷酸化-ERK Western blot條帶圖(A)及柱狀圖(B)

Fig 1Representative bands (A) and bar graph (B) showing ERK and phosphorylation-ERK expression

VEGFR2：血管內(nèi)皮生長因子受體2；與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與HI組比較，bP<0.05

VEGFR2：vascular endothelial growth factor receptor 2；aP<0.05 compared with the sham group；bP<0.05 compared with the HI group

圖 2VEGFR2 Western blot條帶圖(A)及柱狀圖(B)

Fig 2Representative bands (A) and bar graph (B) showing VEGFR2 expression

VEGFR2(也被稱作KDR或Flk- 1) 是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的高親和性受體，在血管再生和血管新生中都是最重要的分子，幾乎和所有細胞中的VEGF均有作用，對血管內(nèi)皮細胞增殖、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都發(fā)揮重要作用[6]。VEGFR2不僅表達在血管和淋巴管的內(nèi)皮細胞中促進內(nèi)皮細胞的聚集，而且在正常的干細胞中也有表達[7]。有研究顯示EPO干預PWMD后腦白質(zhì)中的VEGF表達上調(diào)[8]。本研究顯示EPO治療組的幼鼠腦白質(zhì)中的VEGFR2的表達較缺氧缺血組增加。而且在腫瘤血管的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGFR2的表達量和腫瘤血管的新生和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[9]。參與調(diào)控血管生成的兩個重要因子(受體與配體)都有明顯上調(diào)，當VEGF與VEGFR2結(jié)合前后就會引發(fā)上下游通路中無數(shù)中間信號形成級聯(lián)反應，最終以內(nèi)皮細胞增殖、存活、遷移、通透性增加及浸潤到周圍組織等不同形式改變血管功能。

ERK信號通路是由一個小的三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白激酶級聯(lián)反應。一般認為ERK是生存通路，其在神經(jīng)元的增殖分化以及抑制神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用[10- 11]。但是在腫瘤血管生成的研究中顯示ERK信號通路參與腫瘤血管內(nèi)皮細胞的水平、垂直和定向遷移[12]。本研究顯示，腦組織中有ERK和P-ERK的表達，缺氧缺血后ERK表達未見變化，但P-ERK增加，提示缺氧可能是激活ERK通路的一種因素。另有研究顯示大鼠腦缺血預處理后，ERK1/2磷酸化持續(xù)存在至少3 d后才回到正常水平[13]。EPO治療的大鼠腦組織中ERK表達較缺氧缺血組無變化，但P-ERK的表達情況則明顯增高，EPO促進了ERK的磷酸化，提示EPO對ERK信號通路產(chǎn)生了影響。ERK通路的激活促進細胞持續(xù)增殖或存活，如果細胞持續(xù)增殖而不遷移就會產(chǎn)生內(nèi)皮細胞堆積的血管結(jié)構(gòu)，形成囊腔。本研究顯示EPO治療的大鼠腦組織中的VEGFR2增加，所以ERK信號通路很可能參與了PWMD后的血管新生。關(guān)于血管生成的研究，在血管瘤中還發(fā)現(xiàn)磷酸酰肌醇- 3激酶/蛋白激酶B信號通路也參與了血管生成的調(diào)節(jié)[14]，對于ERK信號通路的研究還顯示分裂原活化抑制劑/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路在EPO促進腸道葉酸吸收中發(fā)揮調(diào)控作用[15]。其實EPO為神經(jīng)細胞的發(fā)育和存活提供了有力條件，在體內(nèi)外實驗研究中已證實EPO可通過一系列廣泛的細胞信號傳導通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，其中抗神經(jīng)細胞凋亡是目前研究最深入的機制之一，且在新生鼠模型[16]以及體外實驗[17]中均有發(fā)現(xiàn)，除了EPO促進血管新生外，其他機制包括抗炎、營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化及抗驚厥等作用。

綜上，本研究初步探討了EPO促血管新生反應可能通過激活ERK信號通路，但是血管新生是一個極其復雜的過程，要了解其詳細的機制尚需進一步深入的研究。

參考文獻

[1]Rees S，Harding R，Walker D.The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain [J]. Int J Dev Neurosci，2011，29(6)：55l- 563.

[2]Xu F，Yu Z，Ding L. Experimental studies of erythropoietin protection following traumatic brain injury in rats [J]. Exp Ther Med，2012，4(6)：977- 982.

[3]龍莎莎，程國強.早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷治療的循證醫(yī)學進展 [J].臨床兒科雜志，2015，33(3)：287- 290.

[4]Zhu LH，Bai X，Zhang N，et al. Improvement of human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on glial cell and behavioral function in a neonatal model of periventricular white matter damage [J]. Brain Res，2014，1563：13- 21.

[5]Zhu LH，Bai X，Wang SY，et al. Recombinant human erythropoietin augments angiogenic responses in a neonatal rat model of cerebral unilateral hypoxia-ischemia [J]. Neonatology，2014，106 (2)：143- 148.

[6]Bamias A，Pignata S，Pujade-Lauraine E. Angiogenesis：a promising therapeutic target for ovarian cancer [J]. Crit Rev Oncol Hematol，2012，84(3)：314- 326.

[7]Claesson-Welsh L，Welsh M.VEGFA and tumour angiogenesis[J].J Intern Med，2013，273(2)：114- 127.

[8]朱麗華，蔣犁，張志華，等. 缺氧缺血致低齡大鼠腦白質(zhì)損傷和神經(jīng)功能障礙的實驗研究[J]. 臨床兒科雜志，2007，25(9)：784- 787.

[9]Yao X，Ping Y，Liu Y，et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR- 2) plays a key role in vasculogenic mimicry formation，neovascularization and tumor initiation by glioma stem-like cells [J].PLoS One，2013，8(3)：e57188.

[10]Silingardi D，Angelucci A，De pasquale R，et al.ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex[J]. Front Behav Neurosci，2011，5(84)：1- 13.

[11]Pignataro G，Esposito E，Sirabella R，et al. nNOS and p-ERK involvement in the neuroprotection exerted by remote postconditioning in rats subjected to transient middle cerebral artery occlusion [J]. Neurobiol Dis，2013，54：105- 114.

[12]肖高春，童仕倫，鄭勇斌，等. PI3K/AKT及MEK/ERK信號通路在腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移中的作用 [J].重慶醫(yī)學，2015，44(11)：1452- 1456.

[13]Choi JS，Kim HY，Cha JH，et al.Ischemic preconditioning-induced activation of ERK1/2 in the rat hippocampus [J]. Neurosci Letters，2006，409(3)：187- 191.

[14]吉毅，陳思源，李凱，等.PI3K/Akt信號通路的異?；罨瘜胗變貉芰鰞?nèi)皮細胞凋亡的抑制作用 [J]. 中華小兒外科雜志，2014，35(2)：93- 96.

[15]Yan J，Jin G，Du L，et al. Modulation of intestinal folate absorption by erythropoietininvitro[J]. Molecular Pharmaceutics，2014，11(1)：358- 366.

[16]Juul SE，Beyer RP，Bammler TK，et a1.Microarray analysis of high-dose recombinant erythropoietin treatment of unilateral brain injury in neonatalmouse hippocampus[J].Pediatr Res，2009，65(5)：485- 492.

[17]Ma R，Hu J，Huang C，et al. JAK2/STAT5/Bcl-xL signalling is essential for erythropoietin-mediated protection against apoptosis induced in PC12 cells by the amyloid beta-peptide A beta 25-35[J]. Br J Pharmacol，2014，171(13)：3234- 3245.

Impacts of Erythropoietin on Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 by the Extracellular Signal-regulated Kinase Signaling Pathway in a Neonatal Rat Model of Periventricular White Matter Damage

YUAN Qi-chao，JIANG Li，ZHU Li-hua，YU Da-fan

Department of Pediatrics，Zhongda Hospital,Medicine School，Southeast University，Nanjing 210009，China Corresponding author：JIANG LiTel：025- 83262767，E-mail：jiangli77777@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the impacts of erythropoietin on vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) by the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway in a neonatal rat model of periventricular white matter damage. MethodsAll of postnatal day 4 rats were randomized into three groups：the sham group [without hypoxia-ischemia (HI)]，the HI group (HI with saline administration)，and the erythropoietin(EPO) group [HI with recombinant human erythropoietin(rh-EPO) administration]. Rat pups underwent permanent ligation of the right common carotid artery，followed by 6% O2 for 2 hours or sham operation and normoxic exposure. Immediately after the HI，rats received a single intraventricular injection of rh-EPO (0.6 IU/g body mass) or saline. ERK and phosphorylation-ERK were examined at 60 minutes and 90 minutes after operation，and VEGFR2 were detected at 2 and 4 days after operation by using Western blot. ResultsAt 60 minutes and 90 minutes after operation，the proteins of phosphorylation-ERK were significantly higher in HI rats than in the sham rats and significantly higher in HI+EPO rats than in the HI rats (P<0.05). Two days after operation，VEGFR2 was not significantly different between sham and HI rats. However，the proteins of VEGFR2 were increased after administration of rh-EPO(P<0.05). Four days after operation，the proteins of VEGFR2 were significantly higher in HI rats than in the sham rats and significantly higher in HI+EPO rats than in the HI rats(P<0.05).ConclusionEPO may regulate VEGFR2 expression by affecting the intracranial ERK signaling pathways.

Key words：erythropoietin；periventricular white matter damage；extracellular signal-regulated kinase；vascular endothelial growth factor receptor 2

(收稿日期：2015- 10- 10)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.016

中圖分類號:R722.1

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)02- 0217- 05

通信作者：蔣犁電話：025- 83262767，電子郵件：jiangli77777@126.com