隋 心，張榮濤，楊立賓，許 楠，柴春榮，王繼豐，付曉玲，鐘海秀，邢軍會(huì)，張 玉，倪紅偉

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 哈爾濱 150040)

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模擬氮沉降對三江平原小葉章濕地土壤細(xì)菌多樣性的影響

隋 心1,2，張榮濤2，楊立賓2，許 楠2，柴春榮2，王繼豐2，付曉玲2，鐘海秀2，邢軍會(huì)2，張 玉2，倪紅偉2

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 哈爾濱 150040)

摘要：利用黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站內(nèi)的模擬氮沉降試驗(yàn)平臺(tái)，應(yīng)用Miseq測序技術(shù)對細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行序列測定和分析，探討添加氮對三江平原小葉章濕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，與對照相比，添加氮增加土壤細(xì)菌群落多樣性，低氮(4 g·hm-2·a-1)時(shí)土壤細(xì)菌多樣性最高，高氮(8 g·hm-2·a-1)次之。模擬氮沉降導(dǎo)致濕地土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)以及豐度發(fā)生變化，低氮、高氮和對照地的優(yōu)勢種群均為酸桿菌門(Acidobacteria)，變形菌門(Proteobacteria)次之，隨著氮沉降的增加，酸桿菌門的豐度逐漸下降，變形菌門的豐度則先升高后降低。外源氮的輸入使得土壤的理化性質(zhì)發(fā)生了改變，導(dǎo)致細(xì)菌群落的組成以及細(xì)菌的相對豐度發(fā)生改變。16S rDNA heatmap分析則表明，不同的細(xì)菌群落對氮沉降的響應(yīng)不同。本研究為預(yù)測未來大氣氮沉降對三江平原濕地土壤微生物的影響以及濕地生態(tài)系統(tǒng)的變化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

關(guān)鍵詞：16S rDNA；小葉章濕地；Miseq；氮沉降；細(xì)菌多樣性

近幾十年來，由于科技進(jìn)步以及工業(yè)的高速發(fā)展，燃燒大量的化石燃料導(dǎo)致了大氣氮沉降量迅速增加。根據(jù)歐洲NITREX(Nitrogen Saturation Experiments)項(xiàng)目計(jì)算，森林每年氮飽和的臨界負(fù)荷的最小值為10 kg·hm-2[1]，但是到目前為止，中歐森林每年的大氣氮沉降量達(dá)到了25～60 kg·hm-2，已經(jīng)嚴(yán)重超出了森林的氮飽和的最小值[2]。從全球來看，在北美洲有些森林每年的大氣氮沉降量也超出了森林的氮飽和的最小值，達(dá)到40 kg·hm-2[3-4]。已有研究表明，我國降水中NO3-離子的濃度(3.2×10-7mol·L-1)和沉降量(2.0×10-7mol·L-1)與美國和日本接近，但是我國降水中的NH4+離子的濃度則更高，其沉降量也更大，離子濃度高達(dá)3.77×10-6mol·L-1，分別是美國和日本的4倍和3.7倍，導(dǎo)致我國氮沉降量十分巨大，分別是美國和日本的3倍和1.8倍[5]。目前，大氣氮沉降已經(jīng)成為影響全球變化的重要現(xiàn)象之一，受到了全世界的關(guān)注。近幾十年來，由于大氣氮沉降的沉降量不斷增加，給全球生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的影響，例如土壤酸化的加重，生物功能和多樣性的降低等[6-8]，引起了全世界的廣泛關(guān)注[9-10]。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，環(huán)境微生物的研究方法也從以前的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)進(jìn)入到了分子生物學(xué)方法階段。Handelsman等[11]在1998提出宏基因組(Metagenome)的概念,它包括環(huán)境中所有微生物的基因，目前主要指細(xì)菌和真菌的基因組總和。宏基因組學(xué)(Metagenomics)作為分子生態(tài)學(xué)的一種典型技術(shù)策略，能夠從環(huán)境樣品中直接獲得的基因組中進(jìn)行文庫構(gòu)建、克隆、測序[12]，可以從群落水平上了解微生物完整的群落結(jié)構(gòu)，并且真實(shí)地揭示環(huán)境微生物群落的多樣性和復(fù)雜性[13]，在環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中顯示出無比的優(yōu)越性[14]，在土壤、水體、濕地以及極端環(huán)境微生物多樣性等研究方面被廣泛應(yīng)用[15-18]。

三江平原濕地是我國面積最大、分布最為集中的濕地[19]，由于人類活動(dòng)的影響，濕地遭到破壞，面積大幅減少，已經(jīng)從1949年的534.5萬 hm2減少到148.16萬hm2[9], 濕地生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了退化。目前研究主要集中在植物群落變化[10]、溫室氣體排放[19]和營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)[20]。國外大量的研究已經(jīng)表明，氮沉降長期增加會(huì)對土壤微生物產(chǎn)生不利影響[21-25]，但是有關(guān)氮沉降對三江平原小葉章(Deyeuxiaangustifolia)濕地的土壤微生物的結(jié)構(gòu)組成和變化的影響，到目前為止還沒有相關(guān)的研究。因此，本研究通過野外原位試驗(yàn)，探討模擬氮沉降對三江平原小葉章濕地土壤細(xì)菌多樣性的影響，以期為研究三江平原濕地生態(tài)系統(tǒng)在氮沉降背景下的變化提供科學(xué)依據(jù)，并為三江平原濕地的保護(hù)與管理提供理論參考。

1材料與方法

1.1研究區(qū)域概況

研究樣點(diǎn)設(shè)置在黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站——洪河國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)(47°45′39″ N,133°37′04″ E)。研究站海拔55～65 m，多年平均氣溫1.9 ℃，≥10 ℃有效積溫2 165～2 624 ℃·d。多年平均降水量為585 mm，50%～70%集中在7-9月，多年平均蒸發(fā)量為1 166 mm。主要植被類型為草甸和沼澤，優(yōu)勢植物有小葉章、狹葉甜茅(Glyceriaspiculosa)、毛果苔草(Carexlasiocarpa)、漂筏苔草(Carexpseudocuraica)等[26]。

1.2樣品采集

2010 年5 月在研究區(qū)設(shè)置9塊20 m×20 m的小葉章沼澤化草甸濕地，設(shè)3個(gè)氮沉降梯度，分別為對照N1 (0 g·hm-2·a-1)、低氮N2(4 g·hm-2·a-1) 和高氮N3(8 g·hm-2·a-1)，每種處理重復(fù)3次。每年5月份進(jìn)行施氮處理，將NH4NO3溶于水，用花灑均勻噴施。于2014年6月采集土壤樣品，采取隨機(jī)取樣的方式，在每個(gè)試驗(yàn)區(qū)分別用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法采集0-10 cm 表層土，每個(gè)土樣有5～8 個(gè)采集點(diǎn)的土壤混合，每個(gè)處理分別混合成一袋土，共計(jì)3袋，去除土樣中的植物和動(dòng)物殘?bào)w等雜質(zhì)，混合均勻后用四分法取適量于自封袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。取一部分保存在-80 ℃冰箱，用于分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。另一部分風(fēng)干、磨細(xì)過0.15 mm篩、1.00 mm篩，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.3土壤理化性質(zhì)檢測

土壤有機(jī)碳利用碳氮分析儀測定(耶拿-2100S, 德國)；土壤中全氮采用半微量凱氏定氮法測定；NO3--N采用酚二磺酸比色法測定；NH4+-N采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法測定。

1.4土壤微生物總DNA的提取

土壤微生物總DNA提取采用美國MO BIO的強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation Kit)，按照說明書的操作步驟進(jìn)行提取。將提取出的土壤微生物總DNA溶解在100 μL去離子水中，取5 μL的DNA用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(0.5×TAE緩沖液)，分析DNA的完整性和相對濃度。

1.5土壤細(xì)菌16S rDNA基因測序

由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Miseq高通量測序。細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增引物采用通用引物(8F/533R)。

1.6數(shù)據(jù)處理

1.6.1有效序列和優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)由于采用多個(gè)樣品平行測序的方法，所以各樣品中的序列均引入了一段標(biāo)示其樣本來源信息的barcode標(biāo)簽序列及前引物(Forward Primer)序列。本次分析根據(jù)barcode標(biāo)簽序列和前引物序列篩選出有效序列后，將測序接頭與barcode序列去除，并對處理后的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

為了分析結(jié)果更精確，需要對有效序列進(jìn)行去雜。去掉小于150 bp和含有模糊堿基以及引物堿基對錯(cuò)配達(dá)到兩個(gè)以上的序列，從而得到優(yōu)化后的序列，用優(yōu)化后的序列來進(jìn)行后續(xù)生物信息分析。

1.6.2OTU-based 分析對所有樣品進(jìn)行劃分可操作分類單元(Operationaltaxonomic unit，OTU )，并對OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將優(yōu)化序列選取長度大于350 bp的序列并截齊后與silva數(shù)據(jù)庫中的微生物基因序列進(jìn)行比對后對序列進(jìn)行聚類。聚類分析使用的軟件為Mothur和Chopseq(http://www.mothur.org/wiki/Main-Page)。

1.6.3細(xì)菌群落多樣性分析細(xì)菌群落物種的豐富度(Richness)和多樣性(Diversity)分別用Chao1和Shannon指數(shù)表示，測序深度指數(shù)用覆蓋度(Coverage)表示。計(jì)算公式如下：

Chao1=OTUs+n1(n1-1)/2(n2+1).

式中，OTUs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)目；n1=只含有一條序列OUT數(shù)目；n2=只含有兩條序列的OUT數(shù)目。

Shannon index(H)=-∑Pi×log2Pi.

式中，Pi=ni/N，表明第i個(gè)物種的相對多度；ni=含有i條序列的OTU數(shù)目；N=所有序列數(shù)。

Coverage=1-n1/N.式中，n1=只含有一條序列的OTU數(shù)目,N=總序列數(shù)。

群落多樣性分析使用的軟件為Mothur (version v.1.30.1) 。

1.6.4群落結(jié)構(gòu)分析

將優(yōu)化序列與silva庫中的已知序列進(jìn)行比對，對OTU序列進(jìn)行種屬鑒定。在門(Phylum)的水平上做樣品群落分布柱狀圖，比較3個(gè)土樣中的細(xì)菌群落分布情況。

2結(jié)果

2.1模擬氮沉降條件下土壤理化性質(zhì)的變化特征

模擬氮沉降樣地的土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示(表1)，樣地的土壤類型主要為草甸土，且不同處理間的pH值存在差異，其中高氮樣地的pH均值最低(P<0.05)。不同處理間土壤的全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效磷存在顯著差異(P<0.05)。有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、全磷和銨態(tài)氮含量呈現(xiàn)隨著氮沉降的增加而升高的趨勢，而速效磷含量則呈現(xiàn)隨著氮沉降的增加而下降的趨勢。

2.2測序數(shù)據(jù)分析

通過Miseq高通量測序并優(yōu)化后，3個(gè)處理共獲得39 979條序列，總堿基數(shù)為15 845 087 bp，平均堿基長度為396.32 bp，其中301～400 bp長度的序列占總序列數(shù)的99.74%(表2)。

表1　模擬氮沉降條件下的土壤理化性質(zhì)的比較

注：同行不同小寫表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lower case letters within the same row show significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

表2　16s rDNA有效序列的數(shù)量及分布

利用測序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，將抽到的序列數(shù)所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線。3個(gè)處理的稀釋性曲線均趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)接近飽和，測序的深度比較合理，增加測序數(shù)量對發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小(圖1)。

圖1　不同處理土壤細(xì)菌OTU稀釋曲線

2.3模擬氮沉降條件下土壤細(xì)菌多樣性分析

通過比對細(xì)菌16S rDNA的相似性，將相似性高于98%的序列歸為同一個(gè)OTU[27]。對不同氮沉降梯度下小葉章濕地土壤細(xì)菌16S rDNA多樣性指數(shù)進(jìn)行分析(表3)，N1、N2和N3的Shannon指數(shù)分別為5.26、5.38和5.32，豐富度指數(shù)Chaol分別為745、698和728。與N1相比，隨著氮濃度的逐漸增加，細(xì)菌的多樣性有所增多，在N2時(shí)細(xì)菌多樣性達(dá)到最高；而細(xì)菌的豐富度指數(shù)與多樣性的變化不同，在N2時(shí)細(xì)菌豐富度最低。這表明不同氮沉降梯度下小葉章濕地土壤細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和豐富度均存在著差異, 且不同氮沉降梯度下土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律不同。

表3　模擬氮沉降各梯度下小葉章濕地土壤

2.4模擬氮沉降條件下土壤細(xì)菌16S rDNA序列分析

將測序所得16S rDNA序列在Genbank中進(jìn)行比對，得到不同氮沉降梯度下小葉章濕地細(xì)菌的分類(表4)。N1、N2和N3小葉章濕地優(yōu)勢種群均為酸桿菌門(Acidobacteria)，分別占總測序數(shù)的53.31%、45.64%和36.33%。變形菌門(Proteobacteria)分布僅次于酸桿菌門，在N1、N2和N3中也有大量的分布，分別占總序列數(shù)的21.60%、21.98%和18.20%。另外，浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在3個(gè)處理中的比例均超過3%，也有大量的分布。

表4　模擬氮沉降條件下土壤細(xì)菌16S rDNA序列分析

不同氮沉降的濕地中土壤微生物還包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠菌門(Chlorobi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、螺旋體菌門(Spirochaetae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、熱胞菌門(Thermotogae)和纖維桿菌門(Fibrobacteres)，它們在N1、N2和N3三個(gè)處理中分布均比較少，各類細(xì)菌占總序列數(shù)的比例都小于3%。另外，N1、N2和N3三個(gè)處理中均有≥17%的細(xì)菌在Genbank中沒有被明確的分類，屬于未分類的細(xì)菌。

與N1相比，氮沉降對酸桿菌門數(shù)量分布的影響最大，隨著氮濃度的增加，土壤中酸桿菌門呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。氮濃度增加后，與N1相比，N2和N3的酸桿菌門分別減少了7.67和16.98個(gè)百分點(diǎn)。變形菌門的變化規(guī)律稍有不同，與N1相比，N2增加了0.38個(gè)百分點(diǎn)，N3降低了3.4個(gè)百分點(diǎn)。此外，浮霉菌門、綠彎菌門和硝化螺旋菌門受氮沉降的影響也比較大。與N1相比，土壤氮含量增加后，N2的浮霉菌門增加了0.72個(gè)百分點(diǎn)，而N3下降了0.83個(gè)百分點(diǎn)；而N2和N3的綠彎菌門分別增加了4.64和2.84個(gè)百分點(diǎn)；硝化螺旋菌門則在N2中幾乎沒有變化，在N3中減少了0.49個(gè)百分點(diǎn)。

2.5細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在屬的水平上對各處理所含菌屬進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類后各處理中的不同OTU所含序列的豐度制作Heatmap(圖2)，該圖能夠反映在菌屬水平上各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與豐度上的差異。不同氮沉降梯度下濕地土壤16S rDNA細(xì)菌可以劃分為5個(gè)聚類(Cluster)。菌屬的豐度受到不同氮濃度的影響，在所測得的菌屬中豐度受不同氮濃度影響比較大的是鏈霉菌(Streptomyces)、Oryzihumus和嗜酸鏈霉菌屬(Streptacidiphilus)。

Cluster 1主要包括Bryobacter、Candidatus、硝化螺旋菌、鏈霉菌等(圖2)。氮沉降增加使得細(xì)菌結(jié)構(gòu)的分布發(fā)生了明顯的影響。例如，Bryobacter和Candidatus在N1中要高于N2和N3；鏈霉菌的豐度在N3中要高于N1和N2。

Cluster 2主要包括綠彎菌門和硝化螺旋菌門兩大類群。其中綠彎菌門的豐度在N3中比較低，在N1和N2中較高；而硝化螺旋菌門在N3中比較高，在N1和N2中較低。

Cluster 3主要包括螺旋體菌、放線菌、地桿菌、光合細(xì)菌、醋桿菌、Aquabacterium、Chitinophagaceae等。螺旋體菌在N3中的豐度較低，在N1和N2中豐度較高；放線菌和地桿菌則在N1中豐度較低，N2和N3中豐度較高；光合細(xì)菌和醋桿菌則在3個(gè)氮沉降樣地中豐度接近；Aquabacterium和Chitinophagaceae則在N1中豐度較高，在N2和N3中豐度較低。

圖2　基于細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的熱圖

Cluster 4主要包括Isosphaera、Chitinophagaceae、Syntrophorhabdaceae、黃單胞菌等。Isosphaera和Chitinophagaceae在N1中豐度較高，N2和N3中豐度較低；Syntrophorhabdaceae和黃單胞菌在N1中的豐度較低，N2和N3中的豐度較高。

Cluster 5主要包括Singulisphaera、黏球菌、酸微菌等。Singulisphaera、黏球菌、酸微菌在N3中的豐度要大于N1和N2中。

從總體來看，N1和N2的細(xì)菌結(jié)構(gòu)和豐度都比較接近，N3的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度變化比較大，這說明N3對土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)的影響比較明顯，這從圖2可以明顯看出來。另外，對于N1和N2兩個(gè)小葉章濕地來看，二者的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度都比較接近，這說明在N2的條件下，土壤細(xì)菌的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生顯著的改變。

3討論

土壤pH值是影響土壤微生物多樣性的重要因素之一，pH值的變化對土壤的有機(jī)質(zhì)分解與合成以及N、P、K營養(yǎng)元素的合成與轉(zhuǎn)化有著重要的作用[28]。在不同氮沉降條件下，N1的pH值最高，其次是N2，但二者無顯著差異(P>0.05)。氮沉降的增加會(huì)對土壤養(yǎng)分產(chǎn)生影響。將N2和N3兩種處理與N1相比，氮沉降使土壤有機(jī)碳、氮等的含量均顯著增加(表1)，這可能是氮輸入能促進(jìn)碳固定，從而增加土壤有機(jī)碳含量，這與Conant等[29]的觀點(diǎn)一致。說明外源氮素的輸入增加了濕地生態(tài)系統(tǒng)可利用氮素狀況，從而對濕地土壤有機(jī)碳含量產(chǎn)生了重要影響。另外，外源氮素的增加還促進(jìn)了土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量增加，促進(jìn)了土壤氮的礦化率，使得土壤礦質(zhì)氮的含量也相應(yīng)的增加，從而使土壤全氮的含量得到顯著增加，這和大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致，表明土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮在土壤氮飽和之前會(huì)隨著氮輸入量的增加而增加[30]。在南亞熱帶森林土壤有效氮含量對于模擬氮沉降的初期響應(yīng)的研究中，發(fā)現(xiàn)大氣的氮沉降會(huì)使土壤中的速效氮含量增加，而且氮處理水平越高、土壤速效氮含量增加越多[31]。

多樣性指數(shù)對于分析不同土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)是非常有效的方法，多樣性指數(shù)越高則微生物群落多樣性越高，它由種類的豐富度及種類的均勻度兩部分組成[32-33]。本研究表明，不同氮沉降條件下土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，Shannon指數(shù)呈現(xiàn)出N2>N3>N1的趨勢(表2)，可見，氮沉降會(huì)增加速效氮含量增加，而且氮處理水平越高、土壤速效氮含量增加越多[31]。

多樣性指數(shù)對于分析不同土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)是非常有效的方法，多樣性指數(shù)越高則微生物群落多樣性越高，它由種類的豐富度及種類的均勻度兩部分組成[32-33]。本研究結(jié)果表明，不同氮沉降條件下土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，Shannon指數(shù)呈現(xiàn)出N2>N3>N1的趨勢(表2)，可見，氮沉降會(huì)增加細(xì)菌的多樣性，低氮較高，高氮略有下降，說明氮沉降增加細(xì)菌多樣性具有閾值限制性，即氮濃度增加到一定閾值時(shí)，細(xì)菌多樣性則由升高轉(zhuǎn)變?yōu)橄陆?。這可能是由于氮沉降增加了土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)來源，因此，一定濃度的氮素會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的生長，這與對杉木林土壤微生物[34]的研究結(jié)果一致。但是在高氮水平下，氮增加改變了土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的有效性，這導(dǎo)致了某些微生物定閾值時(shí)，細(xì)菌多樣性則由升高轉(zhuǎn)變?yōu)橄陆?。這可能是由于氮沉降增加了土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)來源，因此，一定濃度的氮素會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的生長，這和劉彩霞等[34]的研究結(jié)果一致。但是在高氮水平下，氮增加改變了土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的有效性，這導(dǎo)致了某些微生物種群(如偏于利用植物殘?bào)w的種群) 的生長，但是同時(shí)又抑制了其它種群，致使群落多樣性指數(shù)的下降?？偟膩碚f，氮沉降會(huì)對土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)具有一定促進(jìn)作用。由此可以推斷，目前我國一些地區(qū)的高氮沉降勢必會(huì)對土壤微生物群落產(chǎn)生影響[35-37]。

通過16S rDNA序列分析表明，N3、N2和N1的優(yōu)勢種群都是酸桿菌門，分別占53.31%、45.64%和36.33%。很多研究都表明，濕地土壤中主要的細(xì)菌群落是酸桿菌門和變形菌門。例如，三江平原濕地土壤細(xì)菌主要是酸桿菌[38]，還有研究表明，濕地土壤中主要優(yōu)勢細(xì)菌群落為變形菌[39-40]，本研究得到相似結(jié)果，表明在濕地土壤中，酸桿菌門和變形菌門是最主要的兩大類群。

氮沉降改變了土壤細(xì)菌群落組成，酸桿菌門的豐度隨著氮沉降的增加而下降，而變形菌門隨著氮沉降的增加先升高后降低，這和Zhou等[41]的研究結(jié)果一致，表明酸桿菌門與土壤氮含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。對于變形菌門的豐度來說，低氮處理時(shí)，變形菌門豐度最高，高氮時(shí)出現(xiàn)下降。有一些研究結(jié)果表明，變形菌門在長期施氮處理中的占主要優(yōu)勢[42-43]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在高氮處理時(shí)，土壤變形菌門豐度會(huì)下降，這可能是由于在高氮濃度時(shí)，土壤氮含量已經(jīng)過飽和，過飽和氮反而會(huì)抑制土壤養(yǎng)分的供給，導(dǎo)致變形菌豐度下降。

本研究結(jié)果還顯示，氮沉降導(dǎo)致土壤礦質(zhì)氮含量大幅上升，土壤呈現(xiàn)弱酸性，而3個(gè)處理中都含有較多的酸桿菌。這可能是與弱酸性的土壤環(huán)境有關(guān)，土壤的弱酸性會(huì)有利于某些酸桿菌的生長。濕地中土壤微生物在濕地土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起非常重要的作用。但目前對濕地的研究還相對較少，對氮沉降的研究更為薄弱。這是因?yàn)闈竦嘏c森林、草原等生態(tài)系統(tǒng)相比，由于其環(huán)境特殊，季節(jié)性或常年積水，所以在不同地點(diǎn)、不同季節(jié)的研究結(jié)果差別會(huì)較大。因此，研究濕地土壤微生物是一個(gè)十分復(fù)雜和龐大的系統(tǒng)工程，對其研究需要不斷地從各個(gè)方面積累，并應(yīng)有多個(gè)學(xué)科的滲透與加入。全球大氣氮沉降增加背景下我國東北地區(qū)的氮沉降將會(huì)增加。在此背景下，研究濕地土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)對氮沉降的響應(yīng)，對研究未來氣候變化對濕地生態(tài)系統(tǒng)多樣性格局和功能穩(wěn)定性的影響具有重要參考意義。

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Effect of simulation nitrogen depositions on bacterial diversity ofDeyeuxiaangustifoliain wetland of Sanjiang Plain

Sui Xin1,2, Zhang Rong-tao2, Yang Li-bin2, Xu Nan2, Chai Chun-rong2, Wang Ji-feng2,Fu Xiao-ling2, Zhong Hai-xiu2, Xing Jun-hui2, Zhang Yu2, Ni Hong-wei2

(1.College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;2.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation Institute of Nature & Ecology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150040, China)

Abstract:Wetland soil bacterial community structure under the simulation nitrogen depositions was studied using 16S rDNA gene sequencing. The soil samples were collected from three different nitrogen depositions in the Sanjiang Plain Field Experiment Station of the Institute of Nature & Ecology, Heilongjiang Academy Sciences. Total microbial DNA was directly extracted from soil samples and 16S rDNA genes were sequenced and analyzed by Miseq molecular technology. The results showed that both low N and high N treatment increased the bacterial diversity compared with control treatment and low N treatment had the highest diversity. The wetland bacterial community structures significantly changed under simulation N depositions. In low N treatment, high N treatment and control treatment, Acidobacteria were predominated followed by Proteobacteria. The richness of Acidobacteria decreased and the richness of Proteobacteria increased first then decreased along the deposition. Soil pH decreased with deposition, which showing acidic property and increasing the Acidobacteria distribution. Soil physicochemical properties changed by input N which resulted in the soil bacterial community composition and abundant changed. The heatmap tree based on the 16S rDNA sequences showed that different bacterial community structure differently responded on Nitrogen deposition. This research provided basic data and theory consultation for predicting the influence of future atmospheric nitrogen deposition on soil microorganism in Sanjiang Plain wetlands.

Key words：16S rDNA; wetland; miseq; nitrogen deposition; bacterial diversity

Corresponding author:Ni Hong-weiE-mail:nihongwei2000@163.com

中圖分類號(hào)：S154.36

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-0629(2016)4-0589-10*

通信作者：倪紅偉(1964-)，男，黑龍江雙城人，研究員，博士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)學(xué)。E-mail：nihongwei2000@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470019)；黑龍江省科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)計(jì)劃(GY2014KC0039)；黑龍江省科學(xué)院院級項(xiàng)目(STJB16-01、STJB16-04、2015YZ01、2014ST05)

收稿日期：2015-08-06接受日期：2015-12-08

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0444

隋心,張榮濤,楊立賓,許楠,柴春榮,王繼豐,付曉玲,鐘海秀,邢軍會(huì),張玉,倪紅偉.模擬氮沉降對三江平原小葉章濕地土壤細(xì)菌多樣性的影響.草業(yè)科學(xué),2016,33(4)：589-598.

Sui X,Zhang R T,Yang L B,Xu N,Chai C R,Wang J F,Fu X L,Zhong H X,Xing J H,Zhang Y,Ni H W.Effect of simulation nitrogen depositions on bacterial diversity ofDeyeuxiaangustifoliain wetland of Sanjiang Plain.Pratacultural Science，2016,33(4)：589-598.

第一作者：隋心(1982-)，男，黑龍江拜泉人，研究實(shí)習(xí)員，博士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)學(xué)。E-mail：xinsui_cool@126.com