李　娜　王利民　董曉青

1 濱州醫(yī)學院實驗教學管理中心機能學實驗室　煙臺　264003；2 濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室

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冷凍大鼠腦組織提取物的磁共振波譜分析

李娜1王利民2董曉青1

1 濱州醫(yī)學院實驗教學管理中心機能學實驗室煙臺264003；2 濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室

【摘要】目的比較漏斗冷凍法和直接浸入冷凍法大鼠腦組織提取物的磁共振波譜(MRS)，為進一步研究提供依據(jù)。方法成年健康SD大鼠隨機分為兩組，分別用漏斗冷凍法和直接浸入冷凍法取腦組織，制備高氯酸組織提取物，溶于重水(D2O)分別用31PMRS和1H MRS檢測。結(jié)果31P MRS可以檢測出多種含磷代謝產(chǎn)物，腦內(nèi)PCr/Pi、ATP/Pi、ATP/EPP三組比值漏斗冷凍法明顯高于直接浸入法；1H MRS可檢測出N-乙酰天冬氨酸(NAA)、乳酸、肌酸及多種氨基酸，漏斗冷凍法與直接浸入法相比，NAA含量高，乳酸含量低。結(jié)論漏斗冷凍法可以較好保存腦內(nèi)的能量代謝產(chǎn)物，腦組織提取物MRS可以檢測出多種含磷和含氫代謝產(chǎn)物，二者結(jié)合是比較好的腦代謝研究方法。

【關鍵詞】腦；能量代謝；磁共振；波譜

磁共振波譜(magnetic resonance Spectroscopy MRS)也稱核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)波譜，在20世紀70年代就已被用于人和動物組織器官的活體檢測[1，2]，是目前唯一用來在活體無損傷的檢測細胞水平代謝變化的非侵入性技術。近年來，被越來越多的用于醫(yī)學研究，并逐漸應用到臨床某些疾病的診斷[3～6]。本文采用兩種冷凍方法，制備大鼠腦組織提取物，并借助磁共振波譜檢測，為臨床體檢提供科學的實驗數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1漏斗的制作取牙膏管頭端金屬部分，將邊緣修剪成鼠頭大小的橢圓形，管口固定到礦泉水瓶蓋上，礦泉水瓶保留1/3。

1.2動物分組成年健康SD大鼠12只，隨機等分為兩組。漏斗冷凍組(A組)用漏斗法在體冷凍鼠頭，直接浸入組(B組)直接在體將鼠頭浸入液氮冷凍。A組大鼠正中切開顱頂皮膚，在皮膚和顱骨之間放置自制漏斗(即將牙膏管的橢圓型部分扣到大鼠顱骨上)，從漏斗中灌入液氮，迅速冷凍鼠腦；待兩側(cè)鼠眼被冷凍變白以后，提起動物將頭浸入液氮，徹底冷凍；用鐵錘敲開鼠頭，冷凍狀態(tài)取出鼠腦(含小腦)，入液氮保存。B組大鼠冷凍后同樣方法取腦。

1.3腦組織提取物的制備冷凍不銹鋼粉碎器，將動物腦組織移入擠壓成粉末；將腦組織粉末移入預冷的研缽，加入60%高氯酸1.5 mL，并使其與腦組織充分混合，研磨成勻漿；勻漿移入離心管，-5℃，12 000 r/min，20 min；取上清液用氫氧化鉀(10N)中和并調(diào)節(jié)pH值為7～8，產(chǎn)生KClO4沉淀。離心去除KClO4，-5℃，12 000 r /min，20 min；上清液加入Chelex-100陽離子交換樹酯，充分攪拌；離心去除Chelex-100，-5℃，12 000 r /min，5 min；取上清液冷凍干燥過夜。

1.4MRS檢測干燥所得固體溶于0.5 mL D2O，移入5 mm核磁管用400 MHz超導磁共振波譜儀(DRX-400，Bruker公司，9.4T)檢測。1H MRS采樣30 min，主要參數(shù)：譜寬30 ppm，采樣延遲3 s，采樣時間1.36 s，溫度300 K，化學位移定標以溶劑HDO峰定位4.80 ppm。31P MRS采樣過夜，主要參數(shù)：譜寬100 ppm，采樣延遲2 s，采樣時間1.01 s，溫度300 K，化學位移以外標85%磷酸的峰為0.0 ppm。

2結(jié)果

2.1漏斗冷凍大鼠腦組織提取物的31P MRS的波譜分析大鼠腦高氯酸提取物的31P MRS波譜分析見圖1。檢測結(jié)果顯示，波譜中各特征峰自左向右依次為：磷酸單脂峰群、無機磷(Pi)、磷酸二脂峰群、磷酸肌酸(PCr)、γ-ATP、β-ADP、α-ADP、α-ATP、NAD峰群、β-ATP。其中與能量代謝有關的有Pi、PCr、ATP、ADP，我們把這四組值之和稱為可交換磷池(EPP，exchangeable phosphate pool)。兩種冷凍方法的31P MRS結(jié)果比較見表1，A組的比值均高于B組，P<0.01。

注：和B組比較，**P<0.01。

2.2漏斗冷凍大鼠腦組織提取物的1H MRS波譜分析腦組織高氯酸提取物的1H MRS波譜分析見圖2。可檢測出多種小分子代謝產(chǎn)物，波譜中各特征峰自左向右依次為：乳酸(Lac)，N-乙酰天冬氨酸(NAA)，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰氨(Gln)、γ-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸(Suc)、?；撬?Tau)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、肌酸池(Cr，含肌酸和磷酸肌酸)。兩種冷凍方法的1H MRS比較見表2。

注：和B組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3討論

腦高氯酸提取物的31P MRS分辨率高，內(nèi)容豐富，適用于多種腦部疾病的研究。其需要解決的首要問題是腦組織的快速冷凍，因為腦能量代謝特別迅速，完全缺血缺氧10 sec，腦內(nèi)PCr就會喪失95%。目前文獻報道有斷頭取腦[7]、直接浸入[8]、正壓通氣直接浸入[9]、漏斗冷凍法[10]4種液氮冷凍方法。斷頭取腦法是先取出鼠腦然后投入液氮冷凍，僅見于用1H MRS研究腦內(nèi)的氨基酸代謝，因為從動物處死到腦完全冷凍所需時間太長，其間腦內(nèi)高能磷酸化合物(PCr和ATP)已全部代謝掉了；直接浸入法是將鼠頭或整只大鼠直接浸入液氮，徹底冷凍后再取出鼠腦。此方法難以維持腦內(nèi)生活狀態(tài)的高能磷酸代謝產(chǎn)物含量。因為動物浸入液氮后，馬上窒息死亡，而從開始冷凍到大腦底部冷凍結(jié)束，約需90 s(大鼠)，但這90 s足以引起腦能量代謝產(chǎn)物含量的明顯變化，這個通過實驗已經(jīng)得到證實；正壓通氣直接浸入法是大鼠浸入液氮前先戴一個動物呼吸器給以正壓通氣，但與正常通氣相比有人為因素的參與。在體漏斗冷凍在七十年代就有人應用，而且證實冷凍后腦內(nèi)PCr、ATP和葡萄糖明顯高于直接浸入法，而乳酸、肌酸、ADP和AMP大大低于后者。此方法好處在于腦淺層冷凍時深層組織仍有血液供應，而且動物自主呼吸冷凍早期還存在，因而從一定程度上推遲了腦缺血缺氧時間，使冷凍前后腦內(nèi)代謝中間產(chǎn)物保持不變。此方法已有人應用于NMR檢測。本研究把漏斗冷凍后31P MRS的結(jié)果與直接浸入比較可見：腦內(nèi)PCr/Pi、ATP/Pi明顯高于后者；ATP/EPP二者相差不多。從結(jié)果可以看出，漏斗冷凍法可以較好的保存腦內(nèi)的能量代謝產(chǎn)物，是目前研究腦代謝最可靠的方法；腦高氯酸提取物的31P MRS可以檢測到腦內(nèi)多種含磷代謝產(chǎn)物，包括磷酸肌酸、ATP、ADP、Pi、甘油磷酸膽堿、甘油磷酸乙醇胺等，因而此方法可用于腦內(nèi)能量代謝以及磷脂代謝的研究。

NAA是神經(jīng)元特有的一種氨基酸，也是腦內(nèi)含量最高的幾種氨基酸之一。在正常大鼠腦高氯酸提取物1H磁共振波譜中，NAA形成的波峰最高。通常情況下，NAA是其含量僅次于谷氨酸和谷氨酰胺，高達490 μmol/100g[11]，然而它在腦內(nèi)的具體功能還不清楚。文獻報道，缺血時1H MRS中NAA峰減低，表示腦內(nèi)NAA濃度降低，并以此作為腦細胞受損傷的標志。實驗發(fā)現(xiàn)，兩種冷凍方法的1H MRS中NAA峰都非常明顯，而漏斗冷凍法的NAA/Cr值高于直接浸入法，說明前者優(yōu)于后者；同時，我們發(fā)現(xiàn)前者Lac/Cr也明顯小于后者。

細胞內(nèi)NAA和乳酸含量可以用來判斷腦缺血缺氧損傷的嚴重程度。目前在體1H MRS在腦缺血缺氧性疾病的研究中已有大量文獻報道，其中大部分用NAA/Lac作為判斷損傷嚴重程度的標志性指標。我們通過腦組織提取物的1H MRS檢測發(fā)現(xiàn)，正常腦內(nèi)NAA/Lac值為6.54±2.474，可以用于在體檢測的參考。

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Magnetic resonance spectroscopy of brain tissue extracts from freezing rat

LI Na1WANG Limin2DONG Xiaoqing1

1 Functional Laboratory,The Experimental Teaching Management Center,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China;2 Department of Human Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo compare magnetic resonance spectroscopy of brain tissue extracts after funnel freezing and direct dipping freezing.MethodsTwelve adult SD rats were divided into two groups,one frozed with funnel and another frozed by direct dipping into liquid N2.The brain tissue extracts were dissolved in 0.5 mL D2O for31P and 1H MRS analysis.Results31P MRS could reveal many phosphrus-containing metabolites of brain.The ratio PCr/Pi,ATP/Pi,ATP/EPP in funnel freezing group were higher than that in direct dipping freezing group.1H MRS could display N-acetylaspartate,lactic acid,creatine and many amino acids.There was higher content of N-acetylaspartate and lower content of lactic acid contained in funnel freezing group than in direct dipping freezing group.ConclusionsFunnel freezing method could comparatively preserve capacity metabolites.31P and 1H MRS may reveal many metabolites of brain. Integrating two methods together was a relatively perfect research way about capacity metabolism of brain.

【Keywords】brain, capacity metabolism,magnetic resonance, spectroscopy

(收稿日期：2016-01-07 )

【中圖分類號】Q58

【文獻標志碼】A

【文章編號】1001-9510(2016)02-0103-03

李娜，E-mail: wanghaojian2006@163.com