張容鵠 夏義杰 竇志浩 何艾 謝輝 鄧浩 馮建成

摘 要 研究木奶果果皮多酚水浴振蕩輔助提取工藝及其體外抗氧化活性。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化木奶果果皮多酚的水浴振蕩輔助乙醇提取工藝，并以VC為對照，對DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基清除能力進行探討。結(jié)果表明：采用優(yōu)化后的工藝條件，提取時間63 min、提取溫度65 ℃、乙醇濃度66%、液料比42 ∶ 1（mL/g），木奶果果皮多酚提取量為31.2 mg/g，與模型預(yù)測值31.0 mg/g相近，最佳工藝實用性強。體外抗氧化活性實驗表明，木奶果果皮多酚對于DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為12.3、2.35、0.141 mg/mL，最高清除率分別為90.6%、99.1%和61.9%，說明木奶果果皮多酚具有很強的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 木奶果果皮；多酚；水浴搖床振蕩輔助提??；響應(yīng)面；抗氧化活性

中圖分類號 TS201.1 文獻標識碼 A

Abstract The water bath shaking-assisted extracting technology was aimed to optimize and antioxidant activity in vitro of polyphenol from the pericarp of Baccaurea ramiflora Lour. was investigated in the study. The extracting technology was optimized using response surface methodology. The evaluation of antioxidant activity was carried out by DPPH， ABTS and superoxide anion radical scavenging assays in comparison to VC. The optimum extraction conditions were determined as 63 min， 65 ℃， 66% and 42 ∶ 1（mL/g）for extraction time， extraction temperature， ethanol concentration and liquid-material ratio， respectively. The experimentally observed yield of polyphenol under the optimized conditions was 31.2 mg/g on average， near the predicted value of 31.0 mg/g， showing the practicability of the optimized process. In DPPH， ABTS and superoxide anion free radical scavenging assays， the IC50 value of the polyphenol extracted from the pericarp of B. ramiflora Lour. were 12.3， 2.35 and 0.141 mg/mL， and the maximum scavenging rates was 90.6%， 99.1% and 61.9%， respectively. Moreover， these results revealed that the pericarp of B. ramiflora Lour. possessed strong antioxidant activity.

Key words Pericarp； Baccaurea ramiflora Lour； Polyphenol； Water bath shaking-assisted extraction； Response surface methodology； Antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.025

木奶果（Baccaurea ramiflora Lour.），也稱水賴、麥穗、蒜瓣果，屬大戟科木奶果屬植物，為常綠喬木或灌木，生于低海拔至中海拔的山谷、山坡陰濕林中。本屬約有80余種，分布于印度、馬來西亞、緬甸、泰國、越南、老撾、柬埔寨、中國、印度尼西亞等國[1-2]。木奶果的木、果皮均可入藥，Inta等[3]指出木奶果主要水煎口服，用于便秘和腹瀉。彭朝忠等[4]收集記載其水煎服后具有解菌毒的功效。胡建香等[2]對西雙版納地區(qū)野生木奶果果實進行了成分分析：其果實可食率為49.2%、含水分84.7%、VC 1.57 mg/（100 g）、可滴定酸1.99%、總糖11.87%等。海南科研人員經(jīng)過初步篩選，發(fā)現(xiàn)木奶果樹皮具有抗腫瘤活性，但對木奶果果皮功能性成分尚未作深入研究[5]。

海南保亭野生木奶果味甘、性涼，肉晶瑩透白，酸甜可口，解暑去熱，是良好的飲品及酸味添加劑；果核姹紫嫣紅，是天然的食用色素；果皮色黃易剝，含有酚類、抗菌類等多種功能性物質(zhì)。天然多酚具有明顯的清除自由基等抗氧化活性[6]，Usha等[7]從木奶果樹葉中發(fā)現(xiàn)迷迭香素多酚具有明顯抗炎和抗氧化活性，從諾麗果肉[8]、石榴果皮[9]、羊棲菜[10]、紫丁香[11]中提取的多酚均顯示具良好的抗氧化活性。目前對于木奶果果皮多酚的提取工藝優(yōu)化國內(nèi)還未見報道。本試驗以乙醇為提取溶劑，采用水浴振蕩輔助法提取木奶果果皮中的總多酚，通過4組單因素試驗確定條件范圍，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，同時對木奶果果皮多酚的體外抗氧化活性進行探討，為實現(xiàn)木奶果果皮廢棄物功能性成分研究與開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料及處理 2014年6月15日于海南保亭南林鄉(xiāng)采摘生長良好，外皮呈黃色的木奶果，超純水清洗，取果皮于-50 ℃冷凍24 h，經(jīng)真空冷凍干燥，粉碎過30目篩，密封貯藏于陰涼干燥處備用。

1.1.2 試劑及溶液 甲醇、乙醇、丙酮、碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、雙氧水、過硫酸鉀、磷酸二氫鉀、鄰苯三酚、三羥基甲基氨基甲烷等均為國產(chǎn)分析純，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）（Sigma公司），沒食子酸標準品（上海源葉生物科技有限公司）、VC標準品（上海源葉生物科技有限公司）、試驗用水均為超純水。

1.1.3 儀器與設(shè)備 SHA-C恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）、EL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、HK5200超聲波清洗器（上海漢克科學儀器有限公司）、LD4-2A臺式低速離心機（北京眾益中和生物有限公司）、TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）、RV06-ML 1-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（深圳市怡華電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 木奶果果皮粉末→按比例與乙醇混合→水浴恒溫振蕩→離心→過濾→濃縮→冷凍干燥→定容→測定A760→計算含量。

1.2.2 多酚提取量測定 參考Drosou等[12]和唐遠謀等[13]的方法略有改動。稱取沒食子酸標準品0.010 g，用蒸餾水定容到200 mL，得到0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液，配制2、3、4、5、6 μg/mL的系列標準濃度溶液，分別加入Folin-Ciocalteu試劑和碳酸鈉溶液，搖勻后避光反應(yīng)30 min，顯色后在760 nm處測量吸光度。以沒食子酸濃度（C）為橫坐標，吸光度（A760）為縱坐標，繪制標準曲線。按1.2.1流程提取木奶果果皮多酚，適當稀釋后，按上述方法測定A760，以每克木奶果果皮中沒食子酸當量（mg/g）表示其多酚提取量。木奶果果皮多酚提取量計算公式為：

其中p為多酚提取量（mg/g）；C為根據(jù)標準曲線計算樣品中多酚的質(zhì)量濃度（μg/mL）；n為稀釋倍數(shù)；V為溶液體積（mL）；W為稱取木奶果果皮質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗 稱取木奶果果皮粉末1.0 g，150 r/min水浴搖床振蕩，在一定條件下乙醇浸提，選取提取時間（0、15、30、60、90、120、150 min）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%和80%）、液料比（10 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、60 ∶ 1 mL/g）和提取溫度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）4個因素，以木奶果果皮多酚提取量（p）為評價指標，進行單因素試驗，各因素試驗至少重復3次，取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取時間、提取溫度、乙醇濃度和液料比4因素，3水平，以p為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化木奶果果皮多酚提取工藝，試驗因素和水平編碼如表1，各因素試驗至少重復3次，取平均值。

1.2.5 體外抗氧化活性試驗 以提取的木奶果果皮多酚為原料進行體外抗氧化活性試驗，采用DPPH法[14]測定DPPH自由基的清除率；采用ABTS法[15]測定ABTS自由基的清除率；采用鄰苯三酚自氧化法[16]測定超氧陰離子清除率。

1.2.6 半抑制濃度（IC50）計算[17] 將木奶果果皮多酚的不同質(zhì)量濃度對DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基不同清除率作圖，并進行線性擬合，根據(jù)擬合的線性方程，當清除率為50%所對應(yīng)的多酚質(zhì)量濃度即為IC50，以IC50值作為木奶果果皮多酚的抗氧化能力指標，該值越低表示抗氧化活性越強。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 18分析單因素試驗結(jié)果，采用Origin8.0作圖，運用Design Expert 8.0.5建立響應(yīng)面模型，并對試驗結(jié)果進行參數(shù)優(yōu)化及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量標準曲線

以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖1），其回歸方程為：Y=0.118 4X-0.009，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6，表明該方法下沒食子酸濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 提取時間的選擇 由圖2可知，隨著時間的變化，提取的木奶果果皮多酚出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，提取時間為60 min時，果皮多酚提取量最高達（25.1±0.6）mg/g。提取時間太短，多酚不能完全有效提取，提取時間太長，一方面多酚化合物會不斷分解氧化，穩(wěn)定性降低[13]，另一方面會增加過多色素、蛋白等雜質(zhì)[18]，從而使多酚浸出效率有降低趨勢。因此提取時間以60 min為宜。

2.2.2 乙醇濃度的選擇 由圖3可知，隨著乙醇濃度提高，多酚得率呈先增加，后減小的趨勢，在乙醇濃度為70%時，木奶果果皮多酚含量最高。這是由于極性相近，使得多酚脫離原本的物質(zhì)基團而溶出，而當乙醇濃度繼續(xù)增大，多酚與溶劑分子之間的相互排斥增強，多酚在溶劑中的溶解度下降，從而導致提取率降低[18]。因此，乙醇濃度以70%為宜。

2.2.3 液料比的選擇 由圖4可知，隨著液料比增加，木奶果果皮多酚的含量呈先增加，后減小的趨勢。當液料比為40 ∶ 1時，多酚含量最高。液料比增加可以使木奶果多酚物質(zhì)充分與浸提液接觸并向外溢出，利于多酚的溶出，但液料比到達一定量時，木奶果果皮多酚溶出達到平衡，此外，液料比過大會造成能量、溶劑的浪費，并增加濃縮步驟的成本和時間[9]。因此，適宜液料比為40 ∶ 1 mL/g。

2.2.4 浸提溫度的選擇 由圖5可知，隨著提取溫度的升高，木奶果果皮多酚提取量出現(xiàn)先增加后穩(wěn)定不變的趨勢，當提取溫度低于60 ℃時，木奶果果皮多酚提取量是明顯增加，而當提取溫度高于60 ℃時，多酚含量雖略有增加，但增加幅度很小，考慮到溫度太高，會影響多酚化合物的活性，因此浸提的較適宜溫度為60 ℃。

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取木奶果果皮多酚試驗

2.3.1 響應(yīng)曲面法試驗結(jié)果及分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以木奶果果皮多酚提取量（p）為響應(yīng)值，以4因素3水平的響應(yīng)曲面法優(yōu)化乙醇提取木奶果果皮多酚工藝，結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.0.5軟件，對表2響應(yīng)面分析方案和數(shù)據(jù)結(jié)果進行多元回歸擬合，木奶果果皮多酚提取量（p）對浸提時間（A）、浸提溫度（B）、乙醇濃度（C）和液料比（D）的二次多項式回歸方程為：

p=-87.27+0.088A+1.85B+1.22C+0.624D-5.0×10-4AB+0.001 6AC-0.001 3AD+0.002 3BC-2.5×10-4BD+7.5×10-4CD-7.31×10-4A2-0.015B2-0.011C2-0.006 5D2

對木奶果果皮多酚的響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，所得模型的F值為17.83，p<0.001，表示該模型高度顯著。該模型擬合優(yōu)度R2=0.946 9>0.9，R2越接近1，表明模型越能預(yù)測其響應(yīng)值，因此該模型能解釋94.69%響應(yīng)值的變化；變異系數(shù)（CV）=1.78%，變異系數(shù)越小說明實驗越精確、可靠性越高；失擬項p=0.057 8（p>0.05），表明該模型的純誤差不顯著；模型的Adeq Precision=13.412，該值是模型信噪比的反映，Adeq Precision大于4即表明模型的響應(yīng)信號足夠強[19]，可以用來擬合試驗結(jié)果。該模型一次項A、B、C、D和二次項 A2、B2、C2、D2均極顯著（p<0.01），說明此4個因素對木奶果果皮多酚提取量均有極顯著影響。本試驗4個因素對木奶果果皮多酚提取量均有顯著影響，其影響程度為：提取溫度>提取時間>乙醇濃度>液料比。

2.3.2 各因素交互效應(yīng)分析 液料比和乙醇濃度、液料比和提取溫度的交互關(guān)系的等高線近似圓形，認為其交互作用不明顯，此處不逐一列出。圖6～9組圖為乙醇濃度和提取時間、液料比和提取時間、提取溫度和乙醇濃度、提取溫度和提取時間的響應(yīng)面圖和等高線圖，4個等高線圖呈橢圓形，說明存在相互作用。

由圖6可知，乙醇濃度和提取時間2因素相互作用對于響應(yīng)值p的影響較為明顯，且提取時間對于響應(yīng)值的影響比乙醇濃度對于響應(yīng)值的影響略大，響應(yīng)值隨著2因素的變化而變化到達頂點。

由圖7可知，液料比和提取時間之間產(chǎn)生了交互作用，但其交互作用對于響應(yīng)值的影響弱于乙醇濃度和提取時間的交互作用對于響應(yīng)值的影響，且提取時間對于響應(yīng)值的影響比液料比的影響略大，響應(yīng)值隨著2因素的變化而變化到達頂點，而后略有降低。

由圖8可知，乙醇濃度和提取溫度2因素交互作用等高線圖接近圓形，說明兩者相互作用影響不大，其響應(yīng)值也是隨著提取溫度的增加和提取時間的延長出現(xiàn)最大值，其后又逐漸降低。

由圖9可知，提取溫度和提取時間2因素相互作用對響應(yīng)值有一定影響，隨著提取溫度和提取時間的增加，響應(yīng)值也在增加，到達頂點后，又逐漸降低。

在4組相互作用中，提取時間和乙醇濃度的交互作用對多酚提取量影響最大，其次是提取時間和液料比，而提取溫度和乙醇濃度，以及提取溫度和提取時間的交互作用對多酚提取量影響較小。

2.3.3 優(yōu)化與驗證 通過Design Expert 8.0.5軟件分析，預(yù)測的最優(yōu)提取工藝為：提取時間63.32 min、提取溫度64.57 ℃、乙醇濃度65.95%、液料比41.75 ∶ 1（mL/g），為方便實際操作，將上述條件調(diào)整為：提取時間63 min、提取溫度65 ℃、乙醇濃度66%、料液比42 ∶ 1（mL/g）。以調(diào)整后的條件進行實驗測定，實際得到多酚提取量平均值為31.2 mg/g，與模型預(yù)測值31.0 mg/g，相對誤差為0.6%，認為模型良好，響應(yīng)面法優(yōu)化所得工藝條件具有實用性。

2.4 木奶果果皮多酚體外抗氧化活性

由圖10～12可知，在測定范圍內(nèi)，木奶果果皮多酚和VC對自由基的清除能力隨著濃度的增加而增強，并呈一定的量效關(guān)系。對于DPPH·的清除能力，木奶果果皮多酚略低于VC；對于ABTS+·及超氧陰離子自由基（O2·- ）的清除能力，木奶果果皮多酚高于VC，表現(xiàn)出了極強的抗氧化活性。截取不同自由基清除率和濃度進行線性方程擬合，通過擬合出的線性方程計算得到，木奶果果皮多酚清除DPPH·的IC50為12.3 μg/mL，清除ABTS+·和O2·- 的IC50分別為2.35 μg/mL和0.141 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

木奶果果肉由淡黃色革質(zhì)狀果皮包被，醇甜可口，其果汁主要用于治療便秘。目前已有研究表明木奶果樹皮和樹葉提取物可用于治療關(guān)節(jié)炎和膿腫[20]。木奶果果皮是木奶果果實廢棄物，其多酚提取工藝和抗氧化活性研究還鮮有報道[21]。本試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果顯示影響木奶果果皮多酚提取量的因素排序為：提取溫度>提取時間>乙醇濃度>液料比。鄭朋朋等[22]研究表明影響瑪咖多酚提取量的因素主要是提取溫度和提取時間，與本試驗結(jié)果一致；而張麗斌等[10]研究表明在提取濃度、提取時間和液料比3個因素中，液料比是影響羊棲菜多酚提取量的主要因素。造成上述結(jié)果的原因主要是由于不同植物中多酚的種類和含量區(qū)別很大，因而在植物多酚提取條件優(yōu)化中，應(yīng)先通過單因素試驗摸索條件范圍，再采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，從而找到影響多酚提取量的關(guān)鍵因素。孟蘄翾等[8]以乙醇為提取溶劑，對諾麗果粉進行超聲波輔助提取，多酚提取量為6.19 mg/g；本試驗以乙醇為提取溶劑，采用水浴振蕩輔助法提取木奶果果皮中的總多酚，多酚提取量為31.2 mg/g，結(jié)果提示在提取溶劑相同情況下，選擇合適的輔助提取方法是增加多酚提取量的關(guān)鍵因素之一。

植物多酚具有較強的體外抗氧化活性[15，19-20]。Amin等[21]對木奶果果實甲醇粗提物，分別用氯仿和石油醚提取多酚，研究提取物清除DPPH自由基的抗氧化作用，結(jié)果顯示氯仿和石油醚提取物清除DPPH·的 IC50分別為49.78、75.31 μg/mL；而本試驗以乙醇為浸提劑，采用水浴搖床振蕩法，提取的木奶果果皮多酚清除DPPH·的IC50為12.3 μg/mL，說明本方法提取的木奶果果皮多酚抗氧化活性更強。同時，本試驗提取的木奶果果皮多酚清除ABTS+· 和O2·- 的IC50分別為2.35 μg/mL和0.141 mg/mL，說明木奶果果皮多酚具有極佳的抗氧化活性，提示木奶果果皮可以變廢為寶，成為分離生物活性物質(zhì)的潛在資源。

本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化木奶果果皮多酚的乙醇提取工藝，并以VC為對照，對DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基（O2·- ）清除能力進行探討。結(jié)果表明：采用優(yōu)化后的工藝條件，提取時間63 min、提取溫度65 ℃、乙醇濃度66%、液料比42 ∶ 1（mL/g），木奶果果皮多酚類物質(zhì)的提取量為31.2 mg/g，與模型預(yù)測值31.0 mg/g相近，工藝切實可行?？寡趸钚詫嶒灡砻鳎灸坦ざ喾訉τ贒PPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為12.3 μg/mL、2.35 μg/mL和0.141 mg/mL，最高清除率分別為90.6%、99.1%和61.9%，說明木奶果果皮多酚具有很強的抗氧化活性。該提取工藝操作簡單，能耗低，提取的多酚抗氧化能力強，可為木奶果果皮資源化利用提供基礎(chǔ)。

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