張　帆，易華婭，齊帥英，武創(chuàng)新，方　麗，楊玉濤

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

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論著

自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠雌激素樣作用的研究

張帆1，易華婭2，齊帥英2，武創(chuàng)新2，方麗2，楊玉濤1

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

[摘要]目的探討自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠的雌激素樣作用機(jī)制。方法選擇陰道細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)為有規(guī)律的4～5 d動(dòng)情周期的4月齡雌性SD大鼠20只為青年組，陰道細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)無動(dòng)情周期改變的18月齡雌性SD大鼠20只為老年組；選用自然老化的圍絕經(jīng)期雌性SD大鼠，肌注氫化可的松構(gòu)建腎陽虛型圍絕經(jīng)期大鼠模型，將造模成功大鼠隨機(jī)分為更年湯組、教材方組、利維愛組和生理鹽水組。青年組、老年組、生理鹽水組均給予生理鹽水灌胃，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃15 d后處死大鼠，分離摘取子宮稱子宮濕質(zhì)量，計(jì)算子宮指數(shù)，采用免疫組化及原位雜交檢測方法觀察大鼠子宮組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其信使VEGF mRNA的陽性表達(dá)情況。結(jié)果各給藥組子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)均明顯高于生理鹽水組和老年組(P均<0.05)；更年湯組子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)與青年組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，與利維愛組、教材方組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；利維愛組子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)與教材方組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。老年組和生理鹽水組VEGF及VEGF mRNA陽性表達(dá)明顯低于青年組(P均<0.05)。各給藥組VEGF及VEGF mRNA的陽性表達(dá)明顯高于生理鹽水組、老年組(P均<0.05)，更年湯組、利維愛組VEGF及VEGF mRNA陽性表達(dá)明顯高于教材方組(P均<0.05)，利維愛組VEGF及VEGF mRNA陽性表達(dá)與更年湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論自擬更年湯可促進(jìn)子宮增生質(zhì)量，具有雌激素樣作用；其促進(jìn)子宮增加質(zhì)量的機(jī)制可能與上調(diào)子宮組織中VEGF及VEGFmRNA的陽性表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]自擬更年湯；腎陽虛；圍絕經(jīng)期；大鼠；血管內(nèi)皮生長因子

植物雌激素是從天然植物中提取的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素相似的一類化合物，能夠與雌激素受體(ERs)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素具有多種生理活性，特別對(duì)婦女絕經(jīng)后因雌激素減少引起的骨質(zhì)疏松癥、絕經(jīng)綜合征、心血管疾病以及激素依賴性腫瘤等有較好的預(yù)防和治療作用[1]。中藥復(fù)方為中醫(yī)治病用藥的最主要形式之一，其中具有植物雌激素樣作用的中藥復(fù)方在絕經(jīng)期綜合征的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠子宮質(zhì)量、子宮組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其信使VEGF mRNA的陽性表達(dá)情況的影響，探討自擬更年湯的雌激素樣作用及其機(jī)制，旨在為其臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)藥品自擬更年湯由熟地12 g、懷山藥12 g、棗皮12 g 、仙茅12 g、仙靈脾12 g、巴戟天12 g、女貞子12 g、旱蓮草12 g、桑寄生12 g、當(dāng)歸10 g、 桂枝9 g、獨(dú)活9 g、防風(fēng)9 g、細(xì)辛3 g、炙甘草6 g組成。教材方[2]由熟地、仙茅、仙靈脾各15 g，山藥、杜仲、棗皮、菟絲子、知母各12 g，黃柏、當(dāng)歸各10 g，肉桂、甘草各6 g組成。更年湯及教材方的中藥飲片均由北京同仁堂大藥房(貴陽市大南門店)提供，并經(jīng)中藥飲片檢驗(yàn)，于貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室用電磁爐煎熬，熬制好的藥液在中心實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。生理鹽水：250 mL/2.25 g，貴州省科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20033939。注射用氫化可的松:50 mg/10 mL，湖北人民制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20058653。替勃龍片(利維愛)：2.5 mg×7片/盒，南京歐加農(nóng)制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20051085。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑BA0407 VEGF免疫組化染色試劑盒和VEGFmRNA(ISH-5173)原位雜交檢測試劑盒由貴州愛瑞達(dá)生物科技有限公司提供。

1.3造模方法與分組應(yīng)用陰道脫落細(xì)胞動(dòng)情周期觀察法對(duì)80只體質(zhì)量280～300 g的11～12個(gè)月齡SD大鼠進(jìn)行連續(xù)15 d觀察篩選，結(jié)果所有大鼠底層細(xì)胞均在50%以上，涂片呈現(xiàn)為動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長,證明其屬于圍絕經(jīng)期。將符合圍絕經(jīng)期模型的大鼠，每天常規(guī)消毒后左右交替于臀部肌肉豐厚的部位注射氫化可的松0.5 mL/100 g，連續(xù)肌注9 d，間停4 d。見動(dòng)物出現(xiàn)持續(xù)性萎靡不振、反應(yīng)遲鈍、扎堆、拱背少動(dòng)、毛不光潔、豎毛時(shí)則認(rèn)為腎陽虛型模型造模成功。將造模成功的腎陽虛型大鼠隨機(jī)分為更年湯組、教材方組、利維愛組、生理鹽水組，每組20只。另選擇陰道細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)為有規(guī)律的4～5 d動(dòng)情周期的4個(gè)月齡SD大鼠20只(體質(zhì)量180～200 g)為青年組，陰道細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)無動(dòng)情周期改變的18月齡大鼠20只(體質(zhì)量420～450 g)為老年組。以上動(dòng)物均由重慶市中藥研究院動(dòng)物室提供[許可證號(hào)：scxk(渝)2012-0003]，微生物控制等級(jí)為Ⅰ級(jí)。

1.4給藥方法及劑量每日9:30—11:30由專人選用5 mL無菌注射器抽取藥液或生理鹽水對(duì)各組大鼠灌胃，連續(xù)15 d。各給藥組給藥劑量均按人鼠體質(zhì)量換算，人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，人與大鼠的等效劑量比值為1∶(6～7)，劑量單位為mg/kg。更年湯組、教材方組、利維愛組分別給予更年湯溶液[含生藥量1.8 g/mL,約18 g/(kg·d)]、教材方溶液[含生藥量1.6 g/mL,約16 g/(kg·d)]、予利維愛溶液[含藥量0.029 4 mg/mL,約0.294 mg/(kg·d)]各4 mL灌胃，青年組、老年組、生理鹽水組均給予生理鹽水4 mL灌胃。

1.5標(biāo)本的采集與處理在實(shí)驗(yàn)過程中由于動(dòng)物之間的相互撕咬等原因?qū)е聞?dòng)物死亡，至采集標(biāo)本時(shí)，大鼠的數(shù)量為青年組13只、老年組13只、生理鹽水組13只、更年湯組16只、教材方組15只、利維愛組14只。于末次給藥24 h后，將各組大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈放血處死，剖取出大鼠子宮，去除其周圍多余組織，放于電子天平上稱取濕質(zhì)量后放至標(biāo)記好的盛有10%福爾馬林溶液中固定。

1.6指標(biāo)檢測將已固定好的子宮組織送至貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行檢測，該科醫(yī)生運(yùn)用免疫組化及原位雜交方法觀察子宮組織中VEGF及VEGF mRNA的陽性表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格參照試劑盒說明操作。根據(jù)子宮濕質(zhì)量計(jì)算子宮指數(shù)，子宮指數(shù)=子宮濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.7免疫組化及原位雜交結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[3]按陽性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度兩者結(jié)合分析判斷。陽性細(xì)胞所占百分比，即陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為(+)，25%～50%為(),>50%為()，無陽性細(xì)胞(-)；染色強(qiáng)度：淺黃色為(+)，棕黃色()，棕褐色為()，未著色細(xì)胞為(-)。為了統(tǒng)計(jì)方便予以半定量計(jì)分：(-)為0分，(+)為1分，()為2分，()為3分。每張切片至少觀察3個(gè)視野。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)利用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較；免疫組化及原位雜交所得結(jié)果利用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)及Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠體質(zhì)量、子宮濕質(zhì)量及子宮指數(shù)比較各組大鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各給藥組子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)均明顯高于生理鹽水組、老年組(P均<0.05)；更年湯組子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)與青年組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，與利維愛組、教材方組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；利維愛組子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)與教材方組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠子宮組織中VEGF與VEGF mRNA陽性表達(dá)情況老年組和生理鹽水組VEGF及VEGF mRNA陽性表達(dá)明顯低于青年組(P均<0.05)。各給藥組VEGF及VEGF mRNA的陽性表達(dá)明顯高于生理鹽水組、老年組(P均<0.05)，更年湯組、利維愛組VEGF及VEGF mRNA陽性表達(dá)明顯高于教材方組(P均<0.05)，利維愛組VEGF及VEGF mRNA陽性表達(dá)與更年湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。各組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)見圖1～6，各組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖見圖7～12。

表1　各組大鼠體質(zhì)量、子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)比較±s)

注：①與利維愛組比較，P<0.05；②與教材方組比較，P<0.05；③與更年湯組比較，P<0.05。

表2　各組大鼠子宮VEGF與VEGF mRNA陽性

圖1　青年組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)(呈強(qiáng)陽性)

圖2　老年組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)(呈弱陽性)

圖3　生理鹽水組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)(呈弱陽性)

圖4　教材方組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)(呈中度陽性)

圖5　利維愛組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)(呈強(qiáng)陽性)

圖6　更年湯組大鼠子宮VEGF表達(dá)免疫組化表現(xiàn)(呈強(qiáng)陽性)

圖7　青年組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖(呈中度陽性)

圖8　老年組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖(呈弱陽性)

圖9　生理鹽水組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖(呈弱陽性)

圖10　教材方組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖(呈中度陽性)

圖11　利維愛組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖(呈強(qiáng)陽性)

圖12　更年湯組大鼠子宮VEGF mRNA表達(dá)原位雜交圖(呈強(qiáng)陽性)

3討論

對(duì)于絕經(jīng)期綜合征的治療，西醫(yī)主要以性激素替代療法為主，雖然臨床證明療效確切但不良反應(yīng)明顯，使其運(yùn)用受到很大限制。所以從天然藥物中尋找具有激素樣生物活性而又無損身體健康的治療藥物很有現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)于絕經(jīng)前后腎陽虛及腎陰陽俱虛之證，筆者以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出腎中陰陽失調(diào)是其發(fā)病的基礎(chǔ)，經(jīng)絡(luò)閉阻是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，腎虛寒凝是其基本病機(jī)，提出了補(bǔ)腎溫陽、祛風(fēng)散寒的基本治療大法，并在此基礎(chǔ)上設(shè)立了自擬更年湯作為治療經(jīng)斷前后諸證的基本方劑。方中熟地、當(dāng)歸滋陰補(bǔ)腎，填精益髓；山藥健脾益氣，補(bǔ)后天以充先天；山茱萸滋補(bǔ)肝腎，固澀精氣；仙茅、仙靈脾、巴戟天溫腎壯陽，強(qiáng)筋骨，袪風(fēng)濕；旱蓮草、女貞子、桑寄生補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；桂枝、獨(dú)活、防風(fēng)、細(xì)辛發(fā)散風(fēng)寒，溫通經(jīng)脈，祛下焦?jié)裥氨酝矗恢烁什菀鏆庋a(bǔ)中，調(diào)和諸藥。全方以補(bǔ)腎、調(diào)和腎中陰陽為主，配合祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)之除濕藥以治療絕經(jīng)前后腎虛、腎陰陽失調(diào)，經(jīng)絡(luò)閉阻之證。 前期研究已證實(shí)自擬更年湯治在調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、延緩卵巢衰退方面有良性作用，且安全[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用子宮增加質(zhì)量法進(jìn)一步探討更年湯治療經(jīng)斷前后諸證的作用機(jī)制。

子宮增加質(zhì)量法檢測藥物的雌激素活性是一種最常用的評(píng)價(jià)雌激素作用的方法[7]，其靈敏度高，可直接反映受試物的活性,并可用于多種外來雌激素的檢測等。其原理主要是子宮含有大量的雌激素受體(ERs),雌激素或具有雌激素活性的化合物通過與該受體結(jié)合,可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),使子宮的雌激素誘導(dǎo)蛋白(IPs)含量增加,表現(xiàn)為子宮組織增生變厚而使子宮質(zhì)量增加。隨著機(jī)體進(jìn)入圍絕經(jīng)期，卵巢功能的衰退，性激素分泌水平的降低，將引起全身諸多組織器官結(jié)構(gòu)和功能的退行性改變。子宮是卵巢激素的主要靶器官，子宮是圍絕經(jīng)期衰老進(jìn)程中受影響較為明顯的器官。本研究結(jié)果顯示，青年組的大鼠子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)最高，而老年組大鼠則是最低的；給藥后更年湯組、教材方組、利維愛組的子宮濕質(zhì)量、子宮指數(shù)明顯高于生理鹽水組，表明3種藥物均可促進(jìn)模型大鼠子宮質(zhì)量增加，其中更年湯較利維愛、教材方作用更為顯著，說明更年湯具有雌激素樣作用，且活性較強(qiáng)。

VEGF是組織細(xì)胞產(chǎn)生的一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原,在血管生成和血管通透性的生理病理過程中有著重要作用[8]。VEGF與血管發(fā)生和發(fā)展緊密聯(lián)系在一起,在個(gè)體胚胎發(fā)育過程中有廣泛的表達(dá),如胚胎和出生后腦室的神經(jīng)外胚層、腦垂體、腎臟、腎上腺、卵巢、子宮內(nèi)膜和胎盤等正常組織，與女性的生殖系統(tǒng)也密切相關(guān)，如血管化過程中的黃體、卵泡、子宮內(nèi)膜周期和蛻膜、創(chuàng)傷炎癥和腫瘤的生成過程均伴有VEGF的表達(dá)[9]。血管的分化、增殖與生成是維持子宮結(jié)構(gòu)和功能的必要條件，而VEGF是促進(jìn)子宮血管生成的關(guān)鍵因子。本實(shí)驗(yàn)觀察到更年湯與利維愛能顯著上調(diào)VEGF及VEGFmRNA的陽性表達(dá),而雌二醇有促進(jìn)VEGF合成和表達(dá)的作用[10-11]。提示自擬更年湯改善子宮老化、促進(jìn)子宮質(zhì)量增加的作用可能與其發(fā)揮雌激素樣作用，調(diào)節(jié)血管新生基因的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎溫陽、祛風(fēng)散寒法之自擬更年湯可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠子宮增重，發(fā)揮其雌激素樣作用，達(dá)到治療絕經(jīng)期綜合征的目的。

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Investigation of the estrogen-like activity of Gengnian decoction in the perimenopause model rats with deficiency of kidney-Yang

ZHANG Fan1, YI Huaya2, QI Shuaiying2, WU Chuangxin2, FANG Li2, YANG Yutao1

(1.The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002, Guizhou, China; 2.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002, Guizhou, China)

Abstract:Objective It is to explore estrogen-like activity of Gengnian decoction in the perimenopause model rats with deficiency of kidney-Yang.Methods We chose natural aging perimenopausal female SD rats model and injected hydrocortisone to build the rats model with deficiency of kidney-Yang. Then they were divided randomly into four groups: the Gengnian decoction group(A), the textbook decoction group(B)，the livial group(C) and the normal saline group(D). A young group (E)and an elderly group(F) SD female rats were chosen as the control groups. The perimenopause models with deficiency of kidney-Yang were established by muscle injection with hydrocortisone. All the rats in every group were treated with respective drug by gavage. After treating for 15 days, the rats were killed to remove their uterus to calculate their wet weight and the uterus index,and compare the positive expression of uterine VEGF, VEGF mRNA by immunohistochemical staining and in situ hybridization detection method. Results The index and wet weight of uterus in GroupA,B and C were increased significantly compared with Group D and Group F (P<0.05), and the difference between Group A and Group B, C was significant(P<0.05). There was no statistical significance between Group B and C (P>0.05). The GroupA,B and C could up-regulate the VEGF and VEGFmRNA Expression, but the level between GroupA, C and GroupB was different and hasstatistical significance (P<0.05). There was no significant difference between Group A and C (P>0.05). Conclusion The Gengnian decoction can increase weight of the uterine and has estrogen-like effects, and the mechanism through which to gain weight may have relationship with the positive expression of VEGF and VEGF mRNA decoction.

Key words:Gengnian decoction; deficiency of kidney-Yang; perimenopause; rat; VEGF

[收稿日期]2015-09-20

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)02-0115-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.001

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160491)

[作者簡介]張帆，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療婦女生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病。[通信作者]易華婭，E-mail：847356542@qq.com