軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建鼓膜的組織學(xué)變化*

丁棟　許為青　汪銀鳳　萬光倫

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·實驗研究·

軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建鼓膜的組織學(xué)變化*

丁棟1許為青1汪銀鳳1萬光倫1

【摘要】目的探討軟骨-軟骨膜復(fù)合體修補鼓膜穿孔后其軟骨厚度及軟骨膜內(nèi)血管密度的變化。方法45只雄性豚鼠隨機分為A、B、C三組，每組15只，每只豚鼠分別于左側(cè)耳制作鼓膜穿孔模型后立即采用同側(cè)耳甲腔軟骨-軟骨膜復(fù)合體植入修補鼓膜，植入前先測量并記錄植入復(fù)合體的厚度，分別觀察術(shù)后2周(A組)、6周(B組)及12周(C組)植入復(fù)合體的厚度、軟骨膜內(nèi)血管密度；另取B組5只豚鼠的右耳(對照組)行鼓膜穿孔造模，不行鼓膜修補術(shù)。結(jié)果A、B、C三組豚鼠左耳鼓膜穿孔平均愈合時間為3.8±0.84天，對照組鼓膜穿孔自愈時間為7.2±0.84天；A、B、C三組軟骨-軟骨膜復(fù)合體植入前厚度分別為0.199±0.023、0.198±0.017、0.193±0.021 mm，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而植入后2周(A組)植入體厚度為0.227±0.024 mm,較植入前增厚，植入后6周(B組)植入體厚度為0.191±0.016 mm，較植入前無變化(P>0.05)，但較植入后2周(A組)變薄(P=0.016)，植入后12周的C組植入體厚度為0.169±0.017 mm，較植入前明顯變薄(P<0.05)，且較植入后2周(A組)、6周(B組)厚度變薄(P=0.00)；植入后第2、6周，軟骨膜單位面積中血管數(shù)量分別為13.28±2.49、7.71±2.49個，第2、6周時重建鼓膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)為鱗狀上皮層、纖維-軟骨膜層、軟骨層、粘膜層，第12周時為鱗狀上皮層、軟骨層及粘膜層。結(jié)論耳廓軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建鼓膜的愈合時間短于鼓膜自行愈合的時間；植入后復(fù)合體的厚度較植入前先增厚再變薄，軟骨膜層血管數(shù)量表現(xiàn)為先增加后減少；重建鼓膜最終組織學(xué)分層與正常鼓膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似。

【關(guān)鍵詞】鼓膜穿孔；軟骨-軟骨膜；組織學(xué)；豚鼠

鼓膜穿孔是鼓膜的常見損傷之一，通常是由外傷、中耳炎或鼓膜置管引起[1]，不能自愈的急性或慢性鼓膜穿孔常需手術(shù)干預(yù)。目前用于鼓膜修補的材料多為自體材料，如：筋膜、脂肪組織、軟骨膜及軟骨-軟骨膜復(fù)合體等。隨著修補材料的成功應(yīng)用，其在鼓膜修補術(shù)后的轉(zhuǎn)歸問題逐漸受到關(guān)注。有實驗表明，采用筋膜成功重建的鼓膜中，筋膜的纖維層組織最終成為重建鼓膜的中層[2]；而用脂肪組織成功重建的鼓膜中，術(shù)后的組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，外層的上皮層及內(nèi)層粘膜層之間存在著大量的脂肪細胞[3]。然而，在國內(nèi)，關(guān)于軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建的鼓膜術(shù)后組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點及復(fù)合體轉(zhuǎn)歸的報道較少。本研究旨在觀察以耳甲腔軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建鼓膜后的組織學(xué)變化，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組實驗動物為雄性健康雜色豚鼠45只，體重200～250 g(購自安徽省立醫(yī)院動物實驗中心)。所有的動物飼養(yǎng)、管理及實驗過程均符合國際科學(xué)技術(shù)委員會發(fā)布的《實驗動物管理條例》、衛(wèi)生部發(fā)布的《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細則》和安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會章程。實驗用豚鼠全身無明顯畸形，耳廓反射正常，耳內(nèi)鏡下檢查外耳道及鼓膜均正常。將所有豚鼠隨機分為三組：A組(15只)術(shù)后觀察時間為2周；B組(15只)術(shù)后觀察時間為6周；C組(15只)術(shù)后觀察時間為12周；A、B、C組均以左耳為實驗耳，取B組5只豚鼠的右耳(5耳)為對照組。

1.2鼓膜穿孔模型制作A、B、C三組豚鼠均分別以3%戊巴比妥鈉水溶液行腹腔注射(0.1 ml/100 g)麻醉后，剃除左耳周毛發(fā)，常規(guī)消毒、鋪洞巾，耳后皮下注射0.5 ml 1%利多卡因溶液。距耳后溝約0.5 cm處切開皮膚，前翻術(shù)耳耳廓，切開外耳道后壁皮膚，暴露鼓膜，顯微鉤針以錘骨柄為中心切開鼓膜，形成1/4鼓膜面積的穿孔，并刮除錘骨柄上殘余鼓膜組織；對照組同法制作右側(cè)鼓膜穿孔模型。

1.3鼓膜穿孔修補術(shù)A、B、C組完成左鼓膜穿孔造模后，即分離皮下組織至耳甲腔根部軟骨，取軟骨-軟骨膜復(fù)合體(以下簡稱復(fù)合體)移植物，并用游標卡尺(精度0.1 mm)測量復(fù)合體厚度后，將復(fù)合體置于無菌生理鹽水中備用。修剪復(fù)合體至合適大小，置于錘骨柄上，復(fù)合體周圍與穿孔鼓膜邊緣接觸良好，外耳道內(nèi)放置明膠海綿塊固定；浸潤適量磺胺嘧啶鈉；縫合切口后動物置于保溫毯中麻醉復(fù)蘇。

對照組完成鼓膜穿孔術(shù)后，術(shù)腔內(nèi)不放置明膠海綿，僅浸潤適量磺胺嘧啶鈉。

1.4觀察指標

1.4.1鼓膜愈合時間每日觀察A、B、C及對照組鼓膜愈合狀況，鼓膜愈合標準：A、B、C組以復(fù)合體與殘余鼓膜間無縫隙判斷為愈合；對照組以鼓膜未見明顯穿孔判斷為愈合。

1.4.2鼓膜修補術(shù)后復(fù)合體厚度觀察及測量A、B、C三組分別于鼓膜修補術(shù)后2、6、12周處死豚鼠，取出軟骨-軟骨膜復(fù)合體后測量其厚度值，為減小復(fù)合體術(shù)前及術(shù)后厚度測量的誤差，采用精度為0.1 mm游標卡尺測量，每塊復(fù)合體厚度測量三次取平均值：第一次測量復(fù)合體的上部的厚度，第二次是測量復(fù)合體中部的厚度，第三次是測量復(fù)合體下部的厚度[4]。

1.4.3重建鼓膜的組織結(jié)構(gòu)及纖維-軟骨膜層的血管數(shù)量觀察重建鼓膜完整取出后經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋及染色后，于顯微鏡下計數(shù)三組纖維-軟骨膜層血管的數(shù)量：隨機選取三個高倍鏡視野，計數(shù)視野內(nèi)的血管，取其平均值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法實驗中所得的數(shù)據(jù)采集和分析均用盲法進行處理，Graphpad 5.0作圖，以SPSS 16.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鼓膜愈合時間A、B、C三組及對照組鼓膜穿孔術(shù)后均愈合，對照組鼓膜穿孔愈合時間為7.2±0.84天，A、B、C三組鼓膜修補術(shù)后鼓膜愈合時間為3.8±0.84天，行鼓膜修補術(shù)各組的平均愈合時間較對照組明顯縮短(P<0.05)。

2.2軟骨-軟骨膜復(fù)合體修補鼓膜穿孔前后的厚度比較鼓膜修補術(shù)前植入前A、B、C三組復(fù)合體的厚度分別為0.199±0.023、0.198±0.017、0.193±0.021 mm，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；鼓膜修補術(shù)后2周A組復(fù)合體的厚度為0.227±0.024 mm，較術(shù)前明顯增厚(P=0.001)，術(shù)后6周，B組復(fù)合體厚度較A組變薄，至12周時，C組復(fù)合體的厚度較A、B組術(shù)后復(fù)合體的厚度明顯變薄(P<0.001)，且C組復(fù)合體厚度較植入前明顯變薄(P<0.05)(表1)。

表1　三組鼓膜修補手術(shù)前后復(fù)合體的厚度比較±s)

注:*與本組植入前比較，P<0.001; △與A組植入后比較，P=0.016； #與A、B組植入后比較，P<0.001

2.3重建鼓膜組織學(xué)觀察術(shù)后兩周時可見A組植入后軟骨膜和殘余鼓膜的纖維層融合，成為纖維-軟骨膜層，由外向內(nèi)由鱗狀上皮層、纖維-軟骨膜層、軟骨層及粘膜層構(gòu)成，各層組織均腫脹，纖維-軟骨膜層內(nèi)大量炎癥細胞浸潤；到術(shù)后第6周時，B組各層結(jié)構(gòu)均與A組(第2周)相同，但纖維-軟骨膜層內(nèi)炎癥細胞浸潤較A組減少，組織腫脹減輕；至第12周時，可見C組重建的鼓膜由鱗狀上皮層、軟骨層及粘膜層構(gòu)成，纖維-軟骨膜層已基本消失(圖1)。

2.4復(fù)合體植入前后纖維-軟骨膜層血管數(shù)量變化復(fù)合體植入前，三組軟骨膜中血管數(shù)量極少，而在植入第2周(A組)后，血管數(shù)量明顯增加，單位面積中血管數(shù)量達13.28±2.49個，在植入第6周(B組)后，單位面積中血管數(shù)量開始下降，為7.71±2.49個，至植入后第12周(C組)，單位面積內(nèi)血管數(shù)量極小，A、B、C三組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，C組與植入前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖1　三組重建鼓膜的組織學(xué)觀察(DAB×100)

a為術(shù)后2周重建鼓膜的組織學(xué)切片，鏡下可見其由上皮層、纖維-軟骨膜層、軟骨層及粘膜層構(gòu)成；b為術(shù)后6周重建鼓膜的組織學(xué)切片，鏡下可見其由上皮層、纖維-軟骨膜層、軟骨層及粘膜層構(gòu)成；c為術(shù)后12周重建鼓膜的組織學(xué)切片，鏡下可見其由上皮層、軟骨層和粘膜層構(gòu)成

圖2　三組重建鼓膜纖維-軟骨膜層的血管密度(DAB×200)

a為術(shù)后2周時重建鼓膜纖維-軟骨膜層中血管的鏡下圖像，可見血管樣組織大量增殖；b為術(shù)后6周時重建鼓膜纖維-軟骨膜層中血管的鏡下圖像，可見血管樣組織，但密度較兩周時明顯減低；c為術(shù)后12周時重建鼓膜鏡下圖像，因其已無纖維-軟骨膜層，故結(jié)構(gòu)中未見到明顯血管樣結(jié)構(gòu)

3討論

關(guān)于鼓膜修補的材料應(yīng)該符合以下幾個原則：首先，材料應(yīng)該可靠，若為組織工程材料，應(yīng)無耳毒性；另外，應(yīng)該具有較高的修補成功率，若為自體移植物，則術(shù)后對取材部位無不良影響；在組織結(jié)構(gòu)方面，該材料應(yīng)該可以作為一種支架，供上皮層的細胞移植來封閉穿孔及血管重建；最后，重建的鼓膜應(yīng)該具有與正常鼓膜相似的三層組織結(jié)構(gòu)[5]。張志剛等[6]對比研究了顳肌筋膜、耳屏軟骨膜及耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合體移植物在鼓膜修補術(shù)后的形態(tài)學(xué)變化及聽力改變，發(fā)現(xiàn)耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合體修復(fù)的穿孔鼓膜愈合率達100%，但顳肌筋膜、耳屏軟骨膜修復(fù)的穿孔鼓膜術(shù)后出現(xiàn)不同程度的內(nèi)陷、粘連，部分患者出現(xiàn)了再次穿孔。從組織學(xué)的觀點分析，可能因為重建鼓膜的鱗狀上皮層和粘膜內(nèi)層中間的纖維組織或脂肪細胞不具有抵抗外界壓力的作用及重建鼓膜中層的纖維細胞的排列方式與正常鼓膜不同[7]；并且這些較柔軟的組織本身具有易皺縮的特性[8]。

關(guān)于軟骨作為重建或修補鼓膜材料的人和動物實驗表明，隨著時間的遷移，軟骨板會發(fā)生不同程度的軟化，但軟骨基質(zhì)仍可以保持完整；即使伴有咽鼓管功能不良，軟骨仍可以保持其本身的硬度，抵抗重建鼓膜過程中的回縮及其對軟骨的吸收和再穿孔[9]； 且由于軟骨自身有一定的彎曲度，當其凹面面對外耳道時，其解剖特點與正常鼓膜相似；此外，由于植入前已經(jīng)將其凸面的軟骨膜移除，故術(shù)后軟骨不會與鼓岬粘連。從本研究結(jié)果看，重建鼓膜在術(shù)后第2周和第6周由上皮層、纖維—軟骨膜層、軟骨層和粘膜層構(gòu)成，第12周時重建完成鼓膜最終由上皮層、軟骨層、粘膜層構(gòu)成，重建鼓膜的纖維-軟骨膜層逐漸消亡，原有鼓膜可以抵抗外界壓力的纖維中層由軟骨層代替，因軟骨本身具有一定的硬度，不易變形，這可能就是軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建鼓膜可以平衡鼓室內(nèi)外壓力、不易發(fā)生再穿孔的組織學(xué)原因。鼓膜修補的成功率與很多因素有關(guān)，如咽鼓管功能、局部是否感染等，故在術(shù)前應(yīng)完善咽鼓管功能的檢查，術(shù)中選取適合的修補材料，術(shù)后注意抗感染藥物的局部及全身應(yīng)用，以保證鼓膜修補的成功率。

Zahnert等[10]通過實驗證明理想的修補鼓膜穿孔的軟骨厚度約為0.5 mm，該厚度被認為能在足夠的機械穩(wěn)定性與減少聲學(xué)傳遞衰減之間取得平衡，但該實驗并未將軟骨移植物與聽骨鏈及內(nèi)耳相連接，不能反映實際應(yīng)用中軟骨厚度對穩(wěn)固性及聽力的影響；杜娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)臨床手術(shù)中取用的人耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合體的厚度與術(shù)后聽力無明顯相關(guān)性。本研究顯示軟骨-軟骨膜復(fù)合體植入后的厚度呈現(xiàn)出較植入前增厚-持平-變薄的變化趨勢，隨著時間的延長，厚度逐漸穩(wěn)定；在鼓膜愈合良好、聽骨鏈完整及活動度較佳時，移植物的厚度不同可能對聽力產(chǎn)生影響；故臨床上取用自體移植物的厚度不一定固定于0.5 mm，因為隨著時間的延長，復(fù)合體的厚度會逐漸變化至一個相對穩(wěn)定的數(shù)值，屆時植入體的厚度才可能是影響聽力的部分因素，但用于修補鼓膜穿孔的耳廓軟骨-軟骨膜復(fù)合體的最佳厚度及其對聽力的影響尚有待進一步研究。

杜曉燕等[12]曾用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)滴注豚鼠的穿孔鼓膜后發(fā)現(xiàn)，bFGF可促進鼓膜的愈合，其重建的鼓膜與正常鼓膜的組織結(jié)構(gòu)相似，并且可以減少瘢痕組織的生成；熊觀霞等[13]用人重組表皮生長因子(rhEGF)滴注于豚鼠的穿孔鼓膜得出了類似結(jié)果。本研究結(jié)果顯示重建的鼓膜經(jīng)過炎癥細胞的滲出、纖維組織的牽拉、血管的再生等過程，術(shù)后2周時，重建鼓膜中炎癥細胞大量浸潤，血管大量增殖，各層組織均較正常時腫脹；第6周時，重建鼓膜中炎癥細胞及血管數(shù)量均較第2周時減少，組織腫脹減輕；到第12周時，纖維-軟骨膜層已基本消失，重建鼓膜基本形成，可見術(shù)后兩周為重建鼓膜愈合的關(guān)鍵期。是否可在軟骨-軟骨膜復(fù)合體修補鼓膜穿孔的術(shù)后第2周關(guān)鍵期加用bFGF或rhEGF促進鼓膜的愈合，并減少疤痕組織形成，值得進一步觀察。

組織愈合過程中血管的新生是由于血管內(nèi)皮細胞增殖與遷移，形成新血管[14]，其過程復(fù)雜，受眾多正性和負性調(diào)節(jié)因子的調(diào)控。本實驗結(jié)果可見修補鼓膜穿孔的植入體的血管數(shù)量呈現(xiàn)增殖-減少-正常的變化趨勢。在鼓膜愈合的過程中，若適時加用血管生成刺激因子，可能可促進鼓膜的愈合，減少愈合不佳的幾率。

綜上所述，耳廓軟骨-軟骨膜復(fù)合體重建鼓膜的愈合時間短于鼓膜自行愈合的時間；植入后復(fù)合體的厚度較植入前呈先增厚再變薄，軟骨膜層血管數(shù)量表現(xiàn)為先增加后減少；重建鼓膜最終組織學(xué)分層與正常鼓膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似。今后還應(yīng)進一步了解軟骨-軟骨膜植入前后不同時期對聽力的影響；另外，還可觀察在不同時期加入促細胞或血管生成的生長因子后重建鼓膜的轉(zhuǎn)歸，為臨床鼓膜修補材料的選擇及應(yīng)用提供參考。

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(2015-09-07收稿)

(本文編輯雷培香)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-2615：52

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160426.1552.002.html

The Postoperative Outcome of the Cartilage-perichondrium Complex Reconstructed Tympanic Membrane Perforation in Guinea Pig

Ding Dong， Xu Weiqing， Wang Yinfeng， Wan Guanglun

(Department of Otolaryngology-Head &Neck Surgery，the Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Hefei， 230001,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the thickness and histologic changes of cartilage-perichondrium complex(CP) and vascular density changes in perichondrium after repairing perforated eardrum.MethodsForty-five male guinea pigs were randomly divided into three groups, and were used to create left TM perforation. The left cavum conchae cartilage-perichondrium was immediately used to repair the perforation. The observation time for group A was two weeks, group B was six weeks and group C was twelve weeks. The thickness of the composite was measured before and after the implantation. The histologic changes of implants and the vascular change in perichondri were observed.ResultsThe healing time for the left ear was 3.8±0.84 , and the right ear 7.2±0.84.The thickness of the composite for group A increased by 14.4% (P<0.05). There was no significant change in the thickness of group B after implantation(P>0.05). Group C decrease by 14.2%(P<0.05). After implantation, the thickness of cartilage in group C was decreased by 34.2% compared to that in group A(P<0.05). At the 2nd week in post-implantation, the number of vessels within the unit area of fiber-perichondrium was up to 13.28±2.49, while the above number reached to 7.71±2.49 at the 6th week after implantation. The final histological structure of reconstructed tympanic membrane at the 2nd week and 6th week was composed of squamous epithelial layer, fibrous-perichondrium layer, cartilaginous layer and mucous layer. The above histological structure at 12th week was composed of squamous epithelial layer, cartilaginous layer and mucous layer. ConclusionThe healing time of the reconstructed tympanic membrane is shorter than the time spent on healing on its own. The thickness of the composite in post-implantation in three groups first increased and then decreased compared to that in pre-implantation. The number of blood vessels of fiber-perichondrium in the reconstructed tympanic membrane first increased and then reduced. The layers of final histological structure of reconstructed tympanic membrane are similar to those of normal tympanic membrane. From the perspective of histology, the cartilage-perichondrium composite is the suitable material for repairing tympanic membrane.

【Key words】Tympanic membrane perforation;Cartilage-Perichondrium;Histology;Guinea pig

【中圖分類號】R764.9+2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)03-0251-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.03.008

作者簡介：丁棟，男，安徽人，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要研究方向為耳科學(xué)。通訊作者：許為青(Email: weiqingxu@aliyun.com)

*2013年安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研課題計劃(13zc042)資助

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(合肥230001)