張龍富，姚家美，蔣冬先，洪群英，李 春，趙婧雅，曾海英，侯英勇，張 新.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 0003；.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 0003

?

突變特異性免疫組織化學(xué)法檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變

張龍富1，姚家美2，蔣冬先2，洪群英1，李 春1，趙婧雅1，曾海英2，侯英勇2，張 新1
1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

［摘要］背景與目的：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突變狀態(tài)是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的重要療效預(yù)測指標(biāo)。該研究旨在探討突變特異性免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）法檢測NSCLC標(biāo)本EGFR基因突變的臨床實(shí)用價(jià)值。方法：同時(shí)采用突變特異性IHC法和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法檢測290例NSCLC患者的EGFR基因突變狀態(tài)，計(jì)算突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）；比較ARMS法和突變特異性IHC法檢測EGFR突變的一致性。結(jié)果：以ARMS法檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)染色評(píng)分≥1+為陽性時(shí)，突變特異性IHC法診斷EGFR基因突變的靈敏度為72.92%，特異度為95.20%，PPV為93.75%，NPV為78.08%。突變特異性IHC法診斷不同類型EGFR基因突變的準(zhǔn)確性相差明顯：診斷19外顯子缺失突變的靈敏度只有55.55%，但其特異度在99%以上；當(dāng)染色評(píng)分為1+時(shí)，診斷L858R突變的靈敏度為90.27%，特異度為95.86%，當(dāng)染色評(píng)分為2+或3+時(shí)，其特異度則為98.63%～100%。突變特異性IHC法與ARMS法檢測結(jié)果有較好的一致性（P＜0.001，Kappa值：0.612～0.864）。突變特異性IHC法能直觀判斷EGFR基因突變細(xì)胞豐度。結(jié)論：突變特異性IHC法是EGFR突變分子檢測的有效補(bǔ)充。

［關(guān)鍵詞］非小細(xì)胞肺癌；表皮生長因子受體；突變；免疫組織化學(xué)

Correspondence to：ZHANG XinE-mail：zhang.xin@zs-hospital.sh.cn

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率和死亡率仍在上升［1］。臨床上約70%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者首診時(shí)已處于中期或晚期，失去了根治的機(jī)會(huì)，多采用化療、靶向治療為主的綜合治療［2］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是現(xiàn)階段治療晚期NSCLC最重要的靶向藥物，代表藥物有吉非替尼、厄洛替尼和?？颂婺岬取Ｓ醒芯勘砻?，EGFR基因突變狀態(tài)是決定EGFRTKIs療效最重要的預(yù)測因子［3-4］，EGFR基因突變主要位于18～21外顯子，其中發(fā)生在19外顯子上的E746_A750缺失突變和21外顯子上的L858R點(diǎn)突變所占比例最多，可達(dá)85%～90%［5-7］。目前檢測EGFR基因突變的方法很多，如直接測序法、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法、數(shù)字PCR法和液相芯片法等，其中直接測序法和ARMS法應(yīng)用較廣，但這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。直接測序法可檢測所有的突變分析的區(qū)域，但對(duì)樣本要求高，靈敏度低，只能檢測突變豐度即突變拷貝數(shù)百分比大于20%的基因，限制了其在臨床中的應(yīng)用［8］。ARMS法靈敏度可達(dá)1%，但僅能檢測已知的EGFR基因突變，且試劑費(fèi)用昂貴，設(shè)備和技術(shù)要求高。這限制了ARMS法的應(yīng)用，尤其是在基層醫(yī)院的推廣。2009年，Yu等［9］首次合成抗EGFR 19外顯子E746_A750缺失突變抗體和抗L858R點(diǎn)突變抗體，用其對(duì)NSCLC標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）法檢測，所得結(jié)果與直接測序法有較好的一致性。但現(xiàn)階段，EGFR基因突變特異性IHC法尚未得到廣泛應(yīng)用，作為經(jīng)濟(jì)、快速的EGFR基因突變檢測手段，其診斷價(jià)值有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究旨在探討突變特異性IHC法檢測NSCLC標(biāo)本EGFR基因突變的準(zhǔn)確性及其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　材料和方法

1.1臨床資料

收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2014年6月—2014年12月確診的NSCLC患者290例，同時(shí)用突變特異性IHC法和ARMS法檢測EGFR基因突變。在290例患者中，手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本72例，纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺和淋巴結(jié)穿刺等取得的小活檢標(biāo)本218例。病例構(gòu)成特征見表1。

表1　入組患者臨床資料Tab. 1　　The clinical characteristics of patients

1.2DNA抽提

所有標(biāo)本均為4%甲醛溶液固定、石蠟包埋組織；手術(shù)標(biāo)本的石蠟組織切取4 μm厚切片3～5張，活檢標(biāo)本的石蠟組織切取切片10張，每個(gè)病例同時(shí)行常規(guī)H-E染色，并由病理科醫(yī)師鑒定腫瘤細(xì)胞的存在。DNA抽提采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒（購自德國Agen公司），實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)說明書。從標(biāo)本中提取并重懸后的DNA經(jīng)NanoDrop 2000檢測其總量及純度。

1.3ARMS法檢測

采用廈門艾德公司的EGFR基因突變檢測試劑盒（ADx-EGFR基因突變檢測試劑盒），該試劑盒覆蓋了最常見的29種EGFR基因突變。參與反應(yīng)的DNA總量及反應(yīng)條件均根據(jù)該試劑盒說明書要求，最終檢測結(jié)果以ADx-EGFR基因突變檢測試劑盒提供的判讀原則確定標(biāo)本EGFR基因突變狀態(tài)。

1.4突變特異性抗體IHC法及其結(jié)果判定

切片以二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)濃度乙醇水化。加入EDTA（pH=9.0）加熱至95 ℃左右，放入切片加熱30 min抗原修復(fù)。放至室溫，滴加5%的正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫溫育15 min，甩去多余液體。根據(jù)組織大小，滴加50～150 μL稀釋倍數(shù)為1∶50的第一抗體［抗E746_A750缺失突變單克隆兔抗體和抗L858R突變單克隆兔抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司］，4 ℃冰箱過夜。而后加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下放置1 h，PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素液室溫溫育1 h。每張切片加1滴新鮮配制的DAB液顯色10～20 min，用淡蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30 s，脫水并待切片晾干后采用中性樹脂封片，鏡下觀察。

以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)著色為基準(zhǔn)，根據(jù)切片中陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度及百分比將表達(dá)結(jié)果分為0、1+、2+和3+四個(gè)等級(jí)。0：無染色或≤10%腫瘤細(xì)胞淺染色；1+：＞10%腫瘤細(xì)胞淺染色；2+：＞10%腫瘤細(xì)胞中度強(qiáng)染色；3+：＞10%腫瘤細(xì)胞強(qiáng)染色［9］。本結(jié)果由3位病理科醫(yī)師各自單獨(dú)評(píng)分，結(jié)果經(jīng)匯總，對(duì)有差異的評(píng)分經(jīng)復(fù)核商討后得到最終一致結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以ARMS法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算突變特異性IHC法的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）。EGFR基因突變率的比較采用X2檢驗(yàn)，突變特異性IHC法和ARMS法檢測EGFR基因突變一致性的比較采用Kappa檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1突變特異性IHC法檢測結(jié)果

在本組290例NSCLC標(biāo)本中，EGFR特異性IHC法的陽性率為38.62%（112/290），其中染色評(píng)分1+為48例（16.55%，48/290），19外顯子E746_ A750缺失突變17例，L858R突變31例；2+為34例（11.72%，34/290），其中19外顯子E746_A750缺失突變10例，L858R突變24例；3+為30例（10.34%，30/290），其中19外顯子E746_A750缺失突變14例，L858R突變16例。不同染色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)評(píng)分見圖1。陽性病例主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色，間質(zhì)細(xì)胞極少染色，提示這兩種抗體較特異性地與腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原結(jié)合。

2.2兩種方法檢測EGFR基因突變的陽性率比較

ARMS法檢測EGFR基因突變陽性率為49.65%，優(yōu)于突變特異性IHC法檢測的陽性率（38.62%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。而這一差異主要由19外顯子缺失突變陽性率差異所致。ARMS法與突變特異性IHC法檢測19外顯子缺失突變的陽性率分別為24.82%和14.13%，前者顯著高于后者（P=0.002）。而ARMS法和突變特異性IHC法檢測L858R突變的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24.82% vs 24.48%，P=1，圖2）。

圖1　IHC染色結(jié)果Fig. 1　　The staining results of IHC

（×400）

圖2　兩種檢測方法檢出EGFR基因突變率的比較Fig. 2　　The comparison of EGFR gene mutation rates by ARMS and IHC

2.3突變特異性IHC法與ARMS法一致性分析

突變特異性IHC法和ARMS法的一致性分析提示，兩者一致性較好（Kappa值=0.682，P＜0.001，表2）。其中：對(duì)19外顯子缺失突變檢測的Kappa值為0.612（P＜0.001，表3）；對(duì)L858R突變檢測的Kappa值為0.864（P＜0.001，表4）。

表2　ARMS法與突變特異性IHC法檢測結(jié)果的一致性分析Tab. 2　　Consistency analysis in detecting results between ARMS and mutation specifc IHC

表3　ARMS法與突變特異性IHC法檢測19外顯子缺失突變的一致性分析Tab. 3　　Consistency analysis in detecting exon 19 deletion between ARMS and mutation specifc IHC

表4　ARMS法與突變特異性IHC法檢測L858R突變的一致性分析Tab. 4　　Consistency analysis in detecting L858R mutation between ARMS and mutation specifc IHC

2.4染色強(qiáng)度對(duì)突變特異性IHC法診斷準(zhǔn)確性的影響

本文以ARMS法檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)以IHC染色評(píng)分≥1為陽性時(shí)，IHC法診斷EGFR基因突變的靈敏度為72.92%，特異度為95.20%，PPV為93.75%，NPV為78.08%。

突變特異性IHC法對(duì)兩種突變類型檢測的準(zhǔn)確性相差明顯：診斷19外顯子缺失突變的靈敏度只有55.55%，但其特異度在99%以上；當(dāng)染色評(píng)分為1+時(shí)，診斷L858R突變的靈敏度為90.27%，特異度為95.86%，當(dāng)染色評(píng)分為2+或3+時(shí)，其特異度則高達(dá)98.63%～100%（表5）。

2.5突變特異性IHC法對(duì)EGFR突變細(xì)胞豐度的判斷

由于IHC法可以直觀地顯示EGFR突變型的腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，依據(jù)H-E染色也能判斷和計(jì)數(shù)選定區(qū)域的所有腫瘤細(xì)胞，從而可以計(jì)算出EGFR某種突變型腫瘤細(xì)胞占總腫瘤細(xì)胞的比例，即細(xì)胞豐度。在本研究的290例標(biāo)本中，包括EGFR 19外顯子E746_A750缺失突變和L858R突變，EGFR基因突變細(xì)胞豐度都在15%～100%，均值約為84%，中位值為100%，只有10.71%（12/112）的病例EGFR基因突變細(xì)胞豐度低于50%。

表5　ARMS法與突變特異性IHC法診斷價(jià)值的比較Tab. 5　　Comparison of diagnostic value between mutation specifc IHC and ARMS

3　討論

EGFR-TKIs在我國上市時(shí)間較長，包括IPASS、OPTIMAL和First-Signal等多項(xiàng)大型多中心臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EGFR基因敏感突變的NSCLC患者使用EGFR-TKIs治療的中位無進(jìn)展生存期顯著優(yōu)于化療，可達(dá)8～13個(gè)月，因此國內(nèi)外多項(xiàng)指南推薦EGFR-TKIs作為EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC的一線治療，且推薦選用EGFR-TKIs作為一線治療前，均應(yīng)檢測腫瘤EGFR基因突變狀態(tài)［10-13］。然而，國內(nèi)NSCLC病例EGFR基因突變的送檢率只有20%，使很多患者喪失靶向治療的機(jī)會(huì)［14］，而不檢測EGFR基因突變就盲目使用靶向藥物，又會(huì)造成極大的浪費(fèi)、貽誤化療時(shí)機(jī)?，F(xiàn)階段EGFR基因突變檢測多采用直接測序法和ARMS法等分子水平檢測，這類方法檢測費(fèi)用高，儀器設(shè)備及場地要求高，難以在基層醫(yī)院開展，甚至不少三級(jí)醫(yī)院也未開展EGFR基因突變檢測，這是我國EGFR基因突變檢測比例很低的重要原因。目前在各級(jí)醫(yī)院病理科普遍開展總EGFR基因的IHC檢測，野生型和突變型EGFR基因表達(dá)都為陽性，其表達(dá)水平不能預(yù)測EGFR-TKIs的療效；而用突變特異性抗體，就能用IHC法識(shí)別EGFR基因突變的細(xì)胞。EGFR基因突變特異性IHC法較分子水平檢測方法價(jià)格低廉，操作簡便、迅速，可在幾乎所有病理實(shí)驗(yàn)室開展。

近年來，國內(nèi)外有數(shù)篇IHC法檢測E746_ A750缺失突變和L858R突變的報(bào)道，但他們所報(bào)告的檢測靈敏度波動(dòng)范圍（24%～100%）大，而且有些研究病例數(shù)偏少，有些研究作為金標(biāo)準(zhǔn)的方法欠妥［15-21］。本研究是國內(nèi)外比較ARMS法和突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變病例數(shù)較多的一項(xiàng)研究，旨在探討突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變?cè)谖覈Ｒ?guī)開展的價(jià)值，并指導(dǎo)臨床醫(yī)師合理解讀IHC法檢測結(jié)果，包括IHC法的靈敏度、特異度、可靠性及不同突變類型、不同染色強(qiáng)度的解讀差異。

Yu等［9］于2009年最早報(bào)道了制備EGFR基因突變特異性抗體，并驗(yàn)證這兩種抗體診斷EGFR基因突變的的靈敏度為92%，特異度為99%。實(shí)際上以后的類似研究基本上都是用此兩種抗體。但其研究所依據(jù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是第一代直接測序法，現(xiàn)在已經(jīng)明確，第一代測序法本身靈敏度不夠高，特別是對(duì)活檢小標(biāo)本存在較多的假陰性，把該文的結(jié)論推廣到以活檢小標(biāo)本為主的晚期肺癌檢測顯然欠妥。另外，該研究所使用的E746_A750缺失抗體也存在缺陷，它并不能涵蓋所有的EGFR 19外顯子缺失突變。根據(jù)癌癥體細(xì)胞突變目錄（catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC）的統(tǒng)計(jì)，EGFR 19外顯子缺失突變包含如E746-A750、E746-T751、L747-T751、L747-A750和L747-S752缺失突變等19種，E746_A750缺失突變約占其中的68%［22］。從原理上就決定了用該抗體檢測所有19外顯子缺失突變的靈敏度不會(huì)太高。比較可信的是Brevet等［22］的報(bào)道，如果只對(duì)E746_A750缺失的病例，IHC法的靈敏度是100%；而對(duì)所有19外顯子缺失突變的病例，靈敏度就下降到74.2%，特異度都為98.8%。Jiang等［20］報(bào)告按不同染色積分判斷突變特異性IHC法檢測結(jié)果，分值為1+、2+和3+時(shí)的陽性率分別為23.08% （24/104）、67.96% （70/103）和100% （48/48），特異度偏低。而王杰等［21］在2015年報(bào)道，在40例EGFR突變標(biāo)本中，IHC法檢出突變的靈敏度僅為40%，這兩項(xiàng)國內(nèi)的研究需考慮其實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)是否還需優(yōu)化。

本研究以ARMS法為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果提示以染色評(píng)分≥1為陽性時(shí)，IHC法檢測L858R突變的靈敏度為90.27%，特異度為95.86%；檢測19外顯子缺失突變的靈敏度為55.55%，特異度為99.28%。本研究比較IHC法和ARMS法，反映EGFR兩種常見敏感突變檢測一致性的Kappa值為0.682（P＜0.01），這個(gè)數(shù)值主要是被19外顯子缺失突變所拉低（Kappa值=0.612，P＜0.001），對(duì)L858R突變而言，Kappa值高達(dá)0.864（P＜0.001）。由上述結(jié)果可見，突變特異IHC法有較高的特異度，但對(duì)19外顯子缺失突變的靈敏度則有不足，這與Brevet等［22］的報(bào)道比較吻合，而我們的病例數(shù)較多。本研究所使用E746_A750缺失抗體并不能涵蓋所有的19外顯子缺失突變，所以結(jié)果顯示對(duì)19外顯子缺失的靈敏度不足。針對(duì)這一問題，有研究表明，同時(shí)檢測總EGFR表達(dá)水平可減少特異性突變假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，提高19外顯子缺失突變的靈敏度至82.56%以上［17，20］。隨著研究的深入，相信會(huì)開發(fā)出更完善的抗體，從而提高IHC法的靈敏度。

IHC的染色強(qiáng)度也對(duì)突變檢測結(jié)果的解讀有重要影響。判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)隨IHC評(píng)分的升高，診斷的靈敏度就相應(yīng)下降，特異度相應(yīng)升高。對(duì)19外顯子缺失突變而言，評(píng)分1+時(shí)診斷突變的特異度高達(dá)98.5%，這說明IHC的陽性結(jié)果基本上就是真陽性，臨床可以使用EGFRTKIs；但如果是陰性，假陰性的機(jī)會(huì)較高，有條件時(shí)應(yīng)該做核酸檢測。對(duì)L858R而言，評(píng)分1+時(shí)診斷突變的靈敏度和特異度分別為90.27% 和95.86%，準(zhǔn)確性較高，只有約10%的病例為假陰性；評(píng)分為2+和3+的標(biāo)本，特異度分別高達(dá)98.63%和100%。由此可見，突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變具有較好的準(zhǔn)確性，尤其當(dāng)染色評(píng)分為強(qiáng)陽性時(shí)結(jié)果更加可靠。

另外，EGFR基因突變豐度是影響EGFRTKIs療效的因素之一，Zhou等［23］和Zhao等［24］的研究顯示，EGFR突變豐度的高低與EGFRTKIs療效正相關(guān)。由于采用核酸檢測方法，上述研究檢測的突變豐度實(shí)際為腫瘤組織中突變型EGFR拷貝數(shù)占總EGFR拷貝數(shù)的比例，即EGFR基因突變分子豐度。然而，EGFR突變的細(xì)胞豐度，即突變型腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的比例，暫不能通過簡便的分子檢測得到。突變特異性IHC法可直觀地顯示EGFR突變型的腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，較簡便地計(jì)算出EGFR突變細(xì)胞豐度，利于臨床醫(yī)生制定個(gè)體化的治療方案，研究EGFR基因突變的變化規(guī)律。

綜上所述，突變特異性IHC法具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)和易于推廣等優(yōu)勢，與ARMS法有較高的一致性，是ARMS法等核酸水平檢測的有效補(bǔ)充，針對(duì)我國核酸檢測廣泛開展存在困難的現(xiàn)狀，值得在基層醫(yī)院推廣；對(duì)突變特異性IHC檢測結(jié)果，臨床上要合理解讀；突變特異IHC法對(duì)EGFR基因突變細(xì)胞豐度的觀察有獨(dú)特價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

［參 考 文 獻(xiàn)］

［1］ SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics, 2012 ［J］. CA Cancer J Clin, 2012, 62（1）：10-29.

［2］ ABERLE D R，BROWN K. Lung cancer screening with CT ［J］.Clin Chest Med, 2008, 29（1）：1-14.

［3］ LYNCH T J, BELL D W, SORDELLA R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib ［J］. N Engl J Med, 2004, 350（21）：2129-2139.

［4］ PAEZ J G, JANNE P A, LEE J C, et al. EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy ［J］. Science, 2004, 304（5676）：1497-1500.

［5］ ONO M, KUWANO M. Molecular mechanisms of epidermal growth factor receptor （EGFR） activation and response to gefitinib and other EGFR-targeting drugs ［J］. Clin Cancer Res, 2006, 12（24）：7242-7251.

［6］ GATELY K, O’FLAHERTY J, CAPPUZZO F, et al. The role of the molecular footprint of EGFR in tailoring treatment decisions in NSCLC ［J］. J Clin Pathol, 2012, 65（1）：1-7.

［7］ CHIRIEAC L R, DACIC S. Targeted therapies in lung cancer ［J］. Surg Pathol Clin, 2010, 3（1）：71-82.

［8］ QIN L, ZHONG W, ZHANG L, et al. Comparison of three methods for detecting epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples of Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer ［J］. Chin Med J （Engl）, 2011, 124（6）：887-891.

［9］ YU J, KANE S, WU J, et al. Mutation-specific antibodies for the detection of EGFR mutations in non-small-cell lung cancer ［J］. Clin Cancer Res, 2009, 15（9）：3023-3028.

［10］ MOK T S, WU Y L, THONGPRASERT S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma ［J］. N Engl J Med, 2009, 361（10）：947-957.

［11］ HAN J Y, PARK K, KIM S W, et al. First-SIGNAL：first-line single-agent iressa versus gemcitabine and cisplatin trial in never-smokers with adenocarcinoma of the lung ［J］. J Clin Oncol, 2012, 30（10）：1122-1128.

［12］ ZHOU C C, WU Y L, CHEN G Y, et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cel lung cancer （OPTIMAL, CTONG-0802）：a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study ［J］. Lancet Oncol, 2011, 12（8）：735-742.

［13］ ROSELL R, CARCERENY E, GERVAIS R, et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer （EURTAC）：a multicentre, openlabel, randomised phase 3 trial ［J］. Lancet Oncol, 2012, 13（3）：239-246.

［14］ XUE C, HU Z, JIANG W, et al. National survey of the medical treatment status for non-small cell lung cancer （NSCLC） in China ［J］. Lung Cancer, 2012, 77（2）：371-375.

［15］ KATO Y, PELED N, WYNES M W, et al. Novel epidermal growth factor receptor mutation-specific antibodies for nonsmall cell lung cancer：immunohistochemistry as a possible screening method for epidermal growth factor mutations ［J］. J Thorac Oncol, 2010, 5（10）：1551-1558.

［16］ WANG X Q, WANG G Q, HAO Y Y, et al. A comparison of ARMS and mutation specific IHC for common activating EGFR mutations analysis in small biopsy and cytology specimens of advanced non-small cell lung cancer ［J］. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7（7）：4310-4316.

［17］ WU S G, CHANG Y L, LIN J W, et al. Including total EGFR staining in scoring improves EGFR mutations detection by mutation-specific antibodies and EGFR TKIs response prediction ［J］. PLoS One, 2011, 6（8）：e23303.

［18］ KOZU Y, TSUTA K, KOHNO T, et al. The usefulness of mutation-specific antibodies in detecting epidermal growth factor receptor mutations and in predicting response to tyrosine kinase inhibitor therapy in lung adenocarcinoma ［J］. Lung Cancer, 2011, 73（1）：45-50.

［19］ H O F M A N P , I L I E M , H O F M A N V , e t a l . Immunohistochemistry to identify EGFR mutations or ALK rearrangements in patients with lung adenocarcinoma ［J］. Ann Oncol, 2012, 23（7）：1738-1743.

［20］ JIANG G Y, FAN C F, ZHANG X P, et al. Ascertaining an appropriate diagnostic algorithm using EGFR mutationspecific antibodies to detect EGFR status in non-small-cell lung cancer ［J］. PLoS One, 2013, 8（3）：e59183.

［21］ 王 杰, 劉 暢, 鐘殿勝, 等. 免疫組化法檢測NSCLC患者EGFR突變［J］. 中國肺癌雜志, 2015, 18（4）：212-218.

［22］ BREVET M, ARCILLA M, LADANYI M. Assessment of EGFR mutation status in lung adenocarcinoma by immunohistochemistry using antibodies specific to the two major forms of mutant EGFR ［J］. J Mol Diagn, 2010, 12（2）：169-176.

［23］ ZHOU Q, ZHANG X C, CHEN Z H, et al. Relative abundance of EGFR mutations predicts benefit from gefitinib treatment for advanced non-small-cell lung cancer ［J］. J Clin Oncol, 2011, 29（24）：3316-3321.

［24］ ZHAO Z R, WANG J F, LONG H, et al. Mutation abundance affects the efficacy of EGFR tyrosine kinase inhibitor readministration in non-small-cell lung cancer with acquired resistance ［J］. Med Oncol, 2014, 31（1）：810.

Detection of EGFR gene mutations with mutation-specifc immunohistochemistry in non-small cell lung cancer

ZHANG Longfu1，YAO Jiamei2，JIANG Dongxian2，HONG Qunying1，LI Chun1，ZHAO Jingya1，ZENG Haiying2，HOU Yingyong2，ZHANG Xin1（1.Department of Pulmonary Medicine，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China；2.Department of Pathology，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

［Key words］Non-small cell lung cancer；Epidermal growth factor receptor；Mutations；Immunohistochemistry

［Abstract］Background and purpose：Epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation is the most important predictive factor for determining the effectiveness of EGFR tyrosine kinase inhibitors （TKIs） for non-small cell lung cancer （NSCLC）. This study aimed to determine the clinical application value of mutation-specific immunohistochemistry for EGFR mutation detection in NSCLC. Methods：Mutation-specific immunohistochemistry and amplification refractory mutation system （ARMS） were used simultaneously to detect EGFR gene mutation status in 290 lung cancer specimens. The sensitivity，specificity，positive predictive value （PPV） and negative predictive value （NPV） of mutation-specific immunohistochemistry for detecting EGFR gene mutations were evaluated. The consistency was analyzed between mutation-specific immunohistochemistry results and ARMS results. Results：With ARMS testing as the gold standard，when a cutoff value of score 1+ was used as positive by immunohistochemistry，the sensitivity of mutation-specific immunohistochemistry for EGFR gene mutation was 72.92%，specificity 95.20%，positive predictivevalue 93.75% and negative predictive value 78.08%. The accuracy of immunohistochemistry was obviously different when various EGFR gene mutations were detected. The sensitivity of immunohistochemistry for exon 19 deletion was only 55.55%，but specificity was above 99%. When immunohistochemistry score was 1+，the sensitivity for L858R mutation was 90.27%，whereas specificity was 95.86%. When immunohistochemistry score was 2+ or 3+，the specificity for L858R mutation was 98.63%-100%. The results of mutation-specific immunohistochemistry were finely correlated with mutation status determined by ARMS assay （P＜0.001，Kappa value：0.612-0.864）. Mutation-specific immunohistochemistry can directly determine EGFR gene mutation abundance at the cellular level. Conclusion：Mutation-specific immunohistochemistry could be an effective supplemental method to EGFR molecular tests.

DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.007

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639（2016）04-0326-07

通信作者：張 新 E-mail：zhang.xin@zs-hospital.sh.cn

收稿日期：（2015-12-15修回日期：2016-02-20）