郭興榮 王小莉 袁雅紅 涂漢軍

（十堰市太和醫(yī)院 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北醫(yī)藥學(xué)院，十堰 442000）

PTEN mRNA編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞殺傷作用研究

郭興榮 王小莉 袁雅紅 涂漢軍

（十堰市太和醫(yī)院 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北醫(yī)藥學(xué)院，十堰 442000）

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有向腫瘤組織遷移趨化的特性，所以它被認(rèn)為是一種攜帶特殊基因進(jìn)行腫瘤的靶向治療的理想載體。與不同形式的DNA載體相比，體外合成的mRNA更容易轉(zhuǎn)染并且不會(huì)引入突變。利用間接共培養(yǎng)方法研究PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）mRNA編輯的MSCs對(duì)U251-Luc細(xì)胞殺傷作用。體外轉(zhuǎn)錄合成PTEN mRNA，轉(zhuǎn)染到MSCs，利用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PTEN蛋白表達(dá)情況，transwell共培養(yǎng)方法分析轉(zhuǎn)染PTEN mRNA對(duì)MSCs腫瘤細(xì)胞遷移趨化性影響。利用活體成像儀和熒光顯微鏡檢測(cè)在間接共培養(yǎng)條件下PTEN mRNA編輯的MSCs對(duì)U251-Luc細(xì)胞殺傷作用。體外成功合成PTEN mRNA，轉(zhuǎn)染到U251-Luc細(xì)胞后能正確表達(dá)PTEN蛋白，并且在轉(zhuǎn)染24 h表達(dá)最高。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PTEN mRNA后能一定程度提高M(jìn)SCs細(xì)胞對(duì)腫瘤遷移能力（P<0.05）。PTEN mRNA編輯的MSCs培養(yǎng)上清能顯著抑制U251-Luc細(xì)胞生長(zhǎng)（P<0.05）。體外合成抑癌基因mRNA的方法為MSC介導(dǎo)的靶向基因治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供新思路。

間充質(zhì)干細(xì)胞；合成mRNA；PTEN；基因治療；U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤（Gliomas），簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，以高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、低治愈率和高病死率等特點(diǎn)著稱［1］。Westphal等［2，3］認(rèn)為由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞組成復(fù)雜、彌散性分布以及具有高耐藥性等，近30年來對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療沒有較大突破。目前限制膠質(zhì)瘤或其它腫瘤的治療效率的關(guān)鍵因素之一是常規(guī)方法缺乏腫瘤的特異性，所以，急需開發(fā)安全高效的靶向治療腦膠質(zhì) 瘤新方法。

MSC介導(dǎo)的基因治療被認(rèn)為是 非常有潛力的治療方法［4-7］。MSCs 的腫瘤組織趨向性已經(jīng)通過體外transwell實(shí)驗(yàn)和在動(dòng)物體內(nèi)腫瘤模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)。利用MSC的腫瘤歸巢性，讓它攜帶特定抑癌基因可在腫瘤組織附近一直表達(dá)抗癌蛋白，從而達(dá)到靶向殺死腫瘤細(xì)胞目的。MSC介導(dǎo)的基因治療方法很多，其中以DNA載體或病毒載體最為常見，但這些方法有都會(huì)存在引入基因重組或突變的問題。因此，不會(huì)引入基因突變又能安全應(yīng)用于臨床腫瘤治療的MSC介導(dǎo)的基因治療方法將是腫瘤治療的理想藥物。體外合成穩(wěn)定的mRNA 方法將有可能替代常用的DNA載體方法（pDNA）［8］，體外合成mRNA 的方法已廣泛應(yīng)用于多能干細(xì)胞或體細(xì)胞編程和誘導(dǎo)分化中［9-12］。

PTEN基因是1997年首次發(fā)現(xiàn)、位于人體10號(hào)染色體（10q23.3）的一種抗癌基因［13-15］。幾乎所有腦膠質(zhì)瘤患者都伴有PTEN活性低下，高達(dá)40%腦膠質(zhì)瘤是由PTEN基因突變所致［16］。PTEN活性低下是眾多腫瘤細(xì)胞的普遍現(xiàn)象，以增強(qiáng)PTEN活性為手段的抗癌研究一直受到廣泛的關(guān)注。

本研究擬采用體外合成的PTEN mRNA來編輯MSC，然后利用間接共培養(yǎng)方法研究PTEN mRNA對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的殺傷抑制作用，以此探討體外合成的PTEN mRNA是否能成為有效治療腦膠質(zhì)瘤病人候選藥物之一。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺M(fèi)SCs的分離和培養(yǎng)如本實(shí)驗(yàn)室之前方法所述［17］。人腦膠質(zhì)瘤U251美國(guó)菌種典藏中心（ATCC，Manassas，VA，USA）。U251和MSCs細(xì)胞培養(yǎng)條件參照ATCC培養(yǎng)條件［18］。為了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察U251細(xì)胞生長(zhǎng)情況，熒光素酶pGL4.51［luc2/CMV/ Neo］（Promega，USA）載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞。

1.2 體外合成PTENmRNA和MSCs的轉(zhuǎn)染

體外構(gòu) 建轉(zhuǎn)錄模板和RNA合成示意圖如圖1所示。寡核苷酸序列體外合成的反轉(zhuǎn)錄模板如表1所示。人5' UTR 的 Kozak序列和3' UTR 序列由 DNA合成技術(shù)公司（Coralville，Iowa）合成，克隆到pcDNA3.3載體上，命名為pcDNA 3.3-TOPO TA 載體。如之前文章所述［9］，用限制內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，并作為tail PCRs 的模板。利用MEGAscript T7試劑盒（Ambion）合成，將ARCA 帽子類似物（New England Biolabs），三磷酸腺苷，GTP，5-甲基胞嘧啶和假尿嘧啶（TriLink Biotechnologies）等核糖核苷酸混合物37℃孵育5 h后，用堿性磷酸酶37℃（New England Biolabs）處理2 h去除5'-三磷酸。合成的RNA用 Ambion MEGAclear spin columns（Ambion）純化并用Nanodrop（Thermo Scientific）測(cè)定濃度。TransIT-mRNA（Mirus）轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)染，Opti-MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibico）稀釋RNA，然后依次加入Boost 溶液和TransIT-mRNA，混勻室溫放置2 min，把RNA和脂質(zhì)體復(fù)合物加入到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)基中。分別在轉(zhuǎn)染12，24 和 36 h利用Western blot檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)情況。

1.3 間接共培養(yǎng)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞活力

利用間接共培養(yǎng)的方法分析PTEN編輯的MSCs對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖毒性作用。在第0天，將熒光素酶標(biāo)記的U251（U251-Luc）細(xì)胞按5 000 個(gè)/孔密度加入100 μL MEM 培養(yǎng)基接種于96孔，在第1天將培養(yǎng)基換為從MSCs（CM）或轉(zhuǎn)染PTEN RNA的MSC（CMPTEN）條件培養(yǎng)基，按0%，25%，50%，75%，100%（MSCPTEN/ CM from MSC control）5個(gè)濃度梯度加入100 μL 培養(yǎng)基。在第0，3和6天，每孔加入 1 μL（0.15 mg/mL）D-熒光素（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA），培養(yǎng)10 min后，利用小鼠活體成像儀（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）檢測(cè)熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度。每間隔36 h更換一次培養(yǎng)基，每組至少重復(fù)檢測(cè)3次以上。

表1 體外合成 PTEN mRNA引物

1.4 Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)MSCs的遷移能力

細(xì)胞遷移能力檢測(cè)參考Nakamizo 等［19］方法。將U251-Luc細(xì)胞按1×105個(gè)/孔密度接種到24孔板，第2天待細(xì)胞貼壁后，野生型MSCs 和 MSCPTEN按×104個(gè)/孔密度接種到transwell（Corning，Inc.，Corning，NY）的微孔膜（8 μm）上，用無血清培養(yǎng)基37℃ 和 5% CO2培養(yǎng)48 h，用PBS 清洗微孔膜，然后用棉簽將膜上層細(xì)胞刮下。利用95%乙醇固定transwell的微孔膜，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30-60 min。在顯微鏡視（100×）野下，每組隨機(jī)選取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上。為了檢測(cè)正常細(xì)胞對(duì)MSCs細(xì)胞 遷移能力影響，用野生型的MSCs 細(xì)胞替代U251-Luc細(xì)胞。

1.5 Western blotting分析

用細(xì)胞刮刮下6孔板中MSCs 細(xì)胞，PBS洗2-3次后，加入100-200 μL細(xì)胞裂解buffer（Beyotime）冰上裂解 30 min，用BCA試劑盒（Beyotime）測(cè)定蛋白濃度。 按每個(gè)點(diǎn)樣孔（50 μg/每孔），用12% SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h后，4℃一抗（PTEN，（R&D Systems，Minneapolis，USA））撫育過夜。TBST洗3遍，每次5 min，ECL標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，顯色，照相。檢測(cè)分泌到培養(yǎng)基中的PTEN表達(dá)情況時(shí)，收集條件培養(yǎng)基，用0.22濾膜過濾后用冷凍干燥儀（cat # 42406；Millipore，Millerica，MA，USA）濃縮。

1.6 熒光顯微鏡分析

利用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit（Invitrogen）檢測(cè)細(xì)胞活力，按說明書并適當(dāng)修改操作。 具體步驟如下：按1×105細(xì)胞密度將U251 接種到24孔板并加入500 μL的 MEM 培養(yǎng)基作為第0天。 在第1天培養(yǎng)基換為50 或者100% 條件培養(yǎng)基（正常培養(yǎng)基加入一定比例轉(zhuǎn)染PTEN mRNA MSC培養(yǎng)24 h 上清）。在培養(yǎng)第4天，細(xì)胞用PBS洗2遍后，加入新鮮配制的工作液（250 μL/孔，24板，含1 μmol/L calcein AM 和2 μmol/L EthD-1）避光室溫孵育10 min。熒光顯微鏡（IX71；Olympus）下觀察照相，并利用軟件（provided online by the National Institute of Health of USA）分析相關(guān)比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS.10統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間差異采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外合成PTEN mRNA和在MSCs細(xì)胞中表達(dá)分析

PTEN mRNA合成流程如圖1-A所示，為了使翻譯的PTEN蛋白產(chǎn)物具有跨膜分泌特性（stPTEN），在編碼PTEN蛋白的DNA序列前加分泌肽DNA序列（MKFPSQLLLLLLFGIPGM）和跨膜肽DNA序列（TAT，YGRKKRRQRRR）（圖1-B）。 以之前構(gòu)建的pDsRed1-TAT-PTEN載體［18］為模板克隆stPTEN DNA序列（圖2A-a），然后把克隆得到的PCR產(chǎn)物雙酶切后連接到pcDNA 3.3-TOPO TA載體。將菌落PCR和酶切篩選得到的陽(yáng)性克?。▓D2A-b，c），送上海生工測(cè)序，經(jīng)比對(duì)完全正確的序列用限制性酶切后的產(chǎn)物作為tail PCR 的模板（圖2A-d）。如圖2-B 所示，向MSCs轉(zhuǎn)染PTEN mRNA 后PTEN蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)。對(duì)照組中內(nèi)源性的PTEN 蛋白與轉(zhuǎn)染組PTEN 蛋白略微小些，轉(zhuǎn)染24 h后PTEN 蛋白表達(dá)最高，36 h后逐漸降低。在培養(yǎng)上清也檢測(cè)到PTEN蛋白表達(dá)，說明合成的PTEN mRNA表達(dá)的蛋白具有分泌特性。

2.2 轉(zhuǎn)染PTEN mRNA后對(duì) MSC遷移能力的影響

利用transwell系統(tǒng)分析 MSC遷移能力。將U251-LUC和MSCs 或 MSCPTEN細(xì)胞間接共培養(yǎng) 48后，大量的MSCs 或 MSCPTEN對(duì)U251-LUC細(xì)胞有趨向作用遷移穿過濾膜（圖3-A），然而幾乎很少細(xì)胞對(duì)正常MSC細(xì)胞有趨向作用遷移穿過濾膜（圖3-B）。而且，與對(duì)照MSC細(xì)胞相比轉(zhuǎn)染PTEN-mRNAs 的MSC細(xì)胞對(duì) U251 細(xì)胞的趨向能力更強(qiáng)（圖3-C）。

圖1 體外合成 PTEN mRNA（A）和 分泌性 PTEN（stPTEN）融合蛋白（B）流程圖

2.3 PTEN編輯的MSCs對(duì)U251-LUC細(xì)胞的活力影響

利用活體成像儀器檢測(cè)U251細(xì)胞中LUC發(fā)光強(qiáng)弱分析PTEN編輯的MSCs間接共培養(yǎng)對(duì)U251-LUC細(xì)胞活力影響。如圖 4-A所示，隨著條件培養(yǎng)基（CM）比例的提高U251細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低。每個(gè)濃度梯度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖 4-B所示，在CM（25%）作用下，共培養(yǎng)6天U251細(xì)胞死亡率達(dá)47.7%，（P<0.05）。然而在共培養(yǎng)的第 3天，在CM（100%）作用下已經(jīng)開始有細(xì)胞死亡（P<0.05），而其他濃度的CM作用下基本不會(huì)引起細(xì)胞死亡。

為了進(jìn)一步檢測(cè)PTEN編輯的MSCs對(duì)U251-LUC細(xì)胞致死作用，用50%和100%CM培養(yǎng) U251-LUC細(xì)胞4 d后用LIVE/DAED Viability/Cytotoxicity Assay Kit分析，在熒光顯微鏡觀察被染為紅色（死細(xì)胞）和綠色（活細(xì)胞）細(xì)胞數(shù)量。如圖5所示，U251-LUC細(xì)胞死亡數(shù)量與CMPTEN培養(yǎng)基比例 成正比，劑量依賴的致死率表明轉(zhuǎn)染PTEN mRNA 的MSCs分泌到培養(yǎng)上清PTEN蛋白可通過間接培養(yǎng)直接導(dǎo)致 U251-LUC細(xì)胞死亡。而在正常MSC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作用下沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。

圖2 體外合成PTEN mRNA和轉(zhuǎn)染到MSCs表達(dá)檢測(cè)

圖3 體外檢測(cè)MSCs的遷移能力

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤是一種很難治愈的腫瘤，主要是由于它的生長(zhǎng)位置和生物學(xué)特性決定，例如（i）滲透特性，（ii）凋亡耐受性，（iii）高復(fù)發(fā)性，（iv）高耐藥性［3］。自從MSCs 的腫瘤趨向性被發(fā)現(xiàn)以來，利用特定抗癌基因編輯的MSCs已逐漸成為最有潛力的靶向治療膠質(zhì)瘤方法［20-22］。然而，用病毒或質(zhì)粒載體攜帶抗癌基因的MSCs不能應(yīng)用于臨床治療。

最新的體外合成mRNA方法是一種安全高效的基因治療方法［11］，它可完全排除對(duì)宿主基因的修飾［23，24］，并已被證實(shí)可應(yīng)用于臨床研究［25］。 因此，利用體外合成特定抗癌基因mRNA編輯MSCs的方法具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

PTEN基因表達(dá)的缺失或低表達(dá)廣泛存在于腫瘤細(xì)胞包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞，說明該基因的表達(dá)是影響腫瘤細(xì)胞的存活關(guān)鍵因素［26］。PTEN功能的恢復(fù)將有可能抑制腫瘤生長(zhǎng)和在特定情況下誘導(dǎo)其死亡。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中表達(dá)的PTEN蛋白可分泌到胞外再進(jìn)入其他細(xì)胞影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和存活［27］。鑒于此，我們體外合成能表達(dá)分泌PTEN蛋白的mRNA，并用它編輯MSC應(yīng)用于治療癌癥研究，探討它潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。如圖2-B所示，轉(zhuǎn)染合成的PTEN mRNA 24 h后在MSCs 表達(dá)達(dá)到高峰。并且表達(dá)出PTEN蛋白的分泌特性與我們之前在這個(gè)細(xì)胞模型用DNA載體轉(zhuǎn)染表達(dá)效果一致［19］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)利用DNA載體攜帶的抗癌基因編輯的MSCs 可抑制胰腺癌細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［19，28］。為了保證臨床應(yīng)用的可行性，必須確定轉(zhuǎn)染mRNA后是否會(huì)影響MSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移性。如圖3所示，轉(zhuǎn)染 PTEN-mRNA 并不會(huì)抑制MSCs的遷移性，而MSCs對(duì)U251細(xì)胞的遷移性反而還有一定程度增強(qiáng)，我們推測(cè)高表達(dá)的PTEN蛋白可能可以影響MSCs細(xì)胞中控制腫瘤遷移特性蛋白表達(dá)或活性，關(guān)于這個(gè)潛在的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。通過間接共培養(yǎng)方法，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PTEN-mRNA的培養(yǎng)上清能顯著抑制U251-LUC細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，并且這種作用還有劑量依賴（圖4，圖5）。然而體外合成的PTEN-mRNA表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基后，是否是通過進(jìn)入U(xiǎn)251-LUC細(xì)胞或是其他方式來抑制其生長(zhǎng)和促進(jìn)其凋亡作用，在后續(xù)研究中將深入討論。

圖4 利用活體成像檢測(cè)儀分析U251-Luc細(xì)胞活力

4 結(jié)論

本研究首次利用體外合成的PTEN mRNA修飾MSC作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，開發(fā)了一種安全可靠和高效基因治療腫瘤新方法。利用MSC介導(dǎo)的基因靶向治療腫瘤具有兩種優(yōu)勢(shì)，一方面是由于MSCs本身具有腫瘤趨向性，另一方面是可攜帶特定抗癌藥物。同時(shí)這種方法還具有潛在優(yōu)勢(shì)。

圖5 間接共培養(yǎng)分析U251-Luc cell 細(xì)胞活力

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Cytotoxic Effects of PTEN-mRNA-engineered Mesenchymal Stem Cell on U251 Glioma Cells

GUO Xing-rong WANG Xiao-li YUAN Ya-hong TU Han-jun
（Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000）

Mesenchymal stem cells（MSCs）have been considered of great potential as ideal carriers for the delivery of anticancer agents since the discovery of their capacity of tumor-oriented migration and integration. Differing from DNA-bas ed vectors，synthesized mRNA in vitro owns the properties of its easy t ransfection and mutagenesis-free. This study aims to investigate the effects of phosphatase and tensin homolog（PTEN）mRNA-engineered MSCs on human glioma U251 cells under indirect co-culture cond ition. PTEN mRNA by in v itro transcription was transfected into MSCs，and then the expression of protein PTEN in the transfected MSCs was detected by Western blot，and the migration and integration effects of PTEN mRNA transfection on MSC tumor cells were verified using transwell co-cultures. The cytotoxic effects of PTEN mRNA-engineered MSCs on the U251-Luc glioma cells were detected with luminescence and fluo rescence microscopy under indirect co-culture condition. The in vitro synthesized PTEN mR NA was transfected to U251-Luc cells，protein PTEN expressed correctly and the expression was the highest at 24 hours after transfection. An enhanced migration rate was observed with MSCs transfected with PTEN mRNA compared to nontransfected MSCs（P<0.05）. A significant inhibition of U251 cells was observed when they were cultured with conditioned medium from PTEN mRNA-engineered MSCs（P<0.05）. The results suggest that anticancer gene-bearing mRNA synthesized in vitro provides new insights into the MSC-mediated targeted gene therapy of glioblastoma.

mesenchymal stem cells；synthesized mRNA；PTEN；gene therapy；U251 glioma cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.032

2015-08-13

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014CFA068），湖北省衛(wèi)生計(jì)生委一般項(xiàng)目（WJ2015MB223），國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410929005）

郭興榮，女，博士，研究方向：腦腫瘤預(yù)防與治療；E-mail：gxrdl@126.com

涂漢軍，男，博士，教授，研究方向：腦膠質(zhì)瘤預(yù)防與治療；E-mail：sythj@sina.com