沈雪梅　李　晶　張　剛　崔宏曉　劉麗慧　姚軍虎　徐秀容

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌712100)

改良低溫螯合法分離家兔小腸絨毛和隱窩細胞及分離效果鑒定

沈雪梅李晶張剛崔宏曉劉麗慧姚軍虎徐秀容*

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌712100)

摘要：本試驗旨在研究家兔小腸絨毛和隱窩細胞的分離方法，為深入研究小腸上皮結構與功能提供體外模型。試驗以新西蘭白兔為試驗材料，在不同螯合劑濃度[5、10、15、20、25 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)]和螯合溫度(4、25 ℃)下分離小腸絨毛和隱窩細胞，檢測所分離細胞團的產(chǎn)量、形態(tài)、細胞活率、完整性。結果表明：1)各螯合條件下分離的絨毛和隱窩細胞形態(tài)完整，基因組DNA與總RNA完整；2)螯合溫度越高且EDTA濃度越大時，細胞富集率越高，但對細胞毒害作用也越強，4 ℃、5 mmol/L EDTA條件下絨毛和隱窩細胞富集率分別為7.75%和1.01%，絨毛相對完整率和隱窩細胞相對活率分別為91.67%和93.48%；25 ℃、25 mmol/L EDTA條件下絨毛和隱窩細胞富集率則分別高達17.89%和4.99%，但絨毛相對完整率和隱窩細胞相對活率僅為4.25%和5.17%；3)綜合分析后確定，4 ℃、10 mmol/L EDTA條件下分離效果最佳；4)在最佳條件下所分離隱窩富集物的溶菌酶和α-防御素的相對表達量極顯著高于絨毛富集物(P<0.01)，顯示細胞純度較高；且隱窩細胞經(jīng)培養(yǎng)9 h后溶菌酶和α-防御素的相對表達量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，顯示細胞依然具有較高活力。由此可見，改良的低溫螯合法適用于家兔小腸絨毛和隱窩細胞的高效分離。

關鍵詞：隱窩；絨毛；腸上皮細胞；螯合劑；家兔

小腸是機體消化吸收的重要部位，其功能與腸上皮細胞密切相關，單層柱狀上皮細胞覆蓋在腸腔組成小腸的上皮，上皮彎曲折疊有序地排列成絨毛和隱窩，其中上皮凸向腸腔形成的葉狀結構為絨毛，下陷至固有層形成的指套狀結構為隱窩[1]。絨毛和隱窩的細胞組成及生理功能不同，分離培養(yǎng)可用于探討不同的生理問題，如絨毛培養(yǎng)可用于研究小腸物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運等功能[2-4]，隱窩培養(yǎng)則可用于研究腸干細胞生理及潘氏細胞免疫功能等[5-10]。目前國內(nèi)外分離小腸絨毛和隱窩細胞的方法主要有機械分離法、螯合法、酶消化法[11]，其中螯合法應用最廣泛，但螯合法也存在分離時間長、隱窩和絨毛分離效果差、細胞活率低等問題。Pothier等[12]使用含1.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的鹽溶液在37 ℃條件下螯合孵育腸組織，分離的絨毛和隱窩細胞互相摻雜，富集率低；Bjerknes等[13]將EDTA濃度提高為30 mmol/L，雖然分離時間縮短且提高了富集率，但對絨毛損傷很大；Ayabe等[14]在此基礎上將分離溫度降低到室溫，雖可提高隱窩的完整性，但無法富集絨毛。Flint等[15]則用二硫蘇糖醇(DTT)取代EDTA的螯合作用，并將處理溫度進一步降低為4 ℃，可以得到更完整的隱窩細胞團，但對絨毛損傷很大。Fuller等[16]發(fā)現(xiàn)，降低EDTA濃度為3 mmol/L并結合2%山梨醇，能有效地降低細胞損傷，但分離時間較長。以上研究均以小鼠或大鼠為試驗材料，尚無分離家兔小腸絨毛和隱窩細胞的報道，且不同研究者使用的螯合劑種類、濃度、溫度不一致，目前均不能使富集率、完整性、分離純度、分離時間同時達到理想結果。本研究通過綜合分析前人各分離方法的優(yōu)勢與不足，探究不同螯合劑濃度與溫度組合對家兔小腸絨毛和隱窩細胞分離效果的影響，篩選出富集率高、細胞活率好、分離時間短的最佳組合，為后續(xù)研究家兔小腸不同細胞功能及營養(yǎng)物質(zhì)吸收及調(diào)控機制提供重要手段。

1材料與方法

1.1試驗設計

以健康14日齡新西蘭白兔為試驗材料。試驗采用2×5完全隨機試驗設計，設計2個溫度水平：4 ℃低溫(low temperature,LT)和25 ℃室溫(room temperature,RT)；5個EDTA濃度：5、10、15、20、25 mmol/L。每個處理設3個重復，每個重復采用5 g小腸組織。

1.2螯合劑的配制

參照文獻[15]配制D-Hanks液，額外添加0.5 mmol/L DTT、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。螯合劑：1.5 mmol/L KCl、96 mmol/L NaCl、8 mmol/L KH2PO4、5 mmol/L Na2PO4、44 mmol/L蔗糖、55 mmol/L山梨糖醇、5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，按照試驗設計分別添加5個濃度的EDTA。

1.3小腸絨毛和隱窩細胞的洗脫分離

家兔耳緣靜脈注射空氣處死后，浸泡于75%酒精中3 min，剖腹取下全段小腸，用冰冷的D-Hanks液(含DTT、雙抗)沖洗腸腔3遍，將腸段外翻并剪成1～2 cm小段，洗凈黏液，均分5 g小腸組織至各處理，各處理加入50倍體積(以下各步驟所加螯合劑體積均為50倍)對應濃度EDTA的螯合劑。LT組和RT組分別在對應溫度下操作：1)150 r/min條件下振搖15 min后上下顛倒振搖(≈60次/min)2 min后棄懸液，加入螯合劑，相同條件下振搖5～15 min，至肉眼可見懸液中出現(xiàn)針尖樣大小細胞團時棄懸液；2)剩余腸段中加入螯合劑手動上下顛倒振搖3 min后，懸液150×g離心3 min棄上清，此沉淀即為絨毛細胞團；3)剩余腸段中重新加入螯合劑，150 r/min振搖5 min后棄懸液，再加入螯合劑，重復操作3次以去除腸壁上的大部分絨毛；4)重新加入螯合劑，手動輕柔地上下顛倒，每隔2 min收集1次懸液，并加入新的螯合劑，重復4次之后，所得懸液冰上沉淀2 min，去除下層包含絨毛細胞團的沉淀后，懸液300×g離心5 min去上清以去除單個細胞，此時獲得的沉淀即為隱窩細胞團。

1.4絨毛與隱窩細胞富集率、絨毛相對完整率與隱窩細胞相對活率測定

在4倍光學顯微鏡視野下觀察絨毛和隱窩細胞團的形態(tài)和純度，要求單個4倍鏡視野下絨毛中隱窩細胞團不多于3個，隱窩細胞團內(nèi)絨毛碎片不多于3個[17]。分別測定各處理富集的絨毛和隱窩細胞重量，細胞重量占5 g小腸組織的百分比為富集率。將各處理絨毛細胞團稀釋到相同倍數(shù)后，在單個4倍鏡視野下統(tǒng)計破損絨毛碎片的數(shù)量，每個樣品統(tǒng)計30個4倍鏡視野。假定每個4倍鏡視野下總絨毛數(shù)相等，通過公式(絨毛完整率=1-絨毛碎片數(shù)/總絨毛數(shù))計算出1個4倍鏡視野下的絨毛完整率，再以其中1個處理的絨毛完整率為100%，相比得到各處理的相對完整率。用臺盼蘭染色法統(tǒng)計單個隱窩細胞團上死亡細胞數(shù)量，每個處理統(tǒng)計30個細胞團，按照與絨毛相對完整率相同的算法得到隱窩細胞相對活率。

1.5基因組DNA與總RNA提取和電泳

參照試劑盒操作說明，對分離出的絨毛和隱窩細胞進行基因組DNA與總RNA提取，用以判斷細胞核酸完整性，1%瓊脂糖凝膠電泳，Biorad成像儀攝像分析。

1.6隱窩細胞的培養(yǎng)

富集的隱窩細胞用DMEM/F-12培養(yǎng)基清洗3次，低速離心去除殘余螯合劑后等量接種于細胞培養(yǎng)用6孔板，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，分別于1、3、5、7、9 h后收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后，實時熒光定量PCR檢測隱窩細胞相關基因表達的變化。

1.7實時熒光定量PCR方法檢測基因表達量

利用實時熒光定量PCR方法檢測溶菌酶(LYZ)和α-防御素(DEFEN)的表達量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因[18]。根據(jù)GenBank登錄的家兔LYZ和DEFEN基因保守區(qū)序列設計引物。各基因的擴增引物見表1。反應體系：10 μL SYBR Premix ExTapTMII (2×)，1 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)，1 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L)，1 μL cDNA，ddH2O補至20 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。

表1　各基因?qū)崟r熒光定量PCR引物序列

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，表中數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果與分析

2.1絨毛和隱窩細胞團的形態(tài)和純度

在不同EDTA濃度和溫度下，均獲得了較完整的絨毛和隱窩細胞團。操作過程中，第2步洗脫絨毛時出現(xiàn)針尖樣細胞團所需時間：RT各組(5～9 min)短于LT各組(7～15 min)，且EDTA濃度越高所需時間越短。第4步沉淀隱窩時，LT+5 mmol/L EDTA組隱窩洗脫量極低，且參雜大量絨毛，2 min內(nèi)洗脫物純化后僅獲得5 mg左右隱窩細胞團，遠遠低于LT+10 mmol/L EDTA組。在光學顯微鏡4倍鏡下觀察，LT較RT條件下得到的細胞團形態(tài)結構更完整，但富集量小，LT+5 mmol/L EDTA組細胞團結構最完整，但細胞濃度最低(圖1-A、圖1-B)；隨著溫度及EDTA濃度的升高，得到的細胞團結構完整性逐漸降低，但細胞濃度逐漸升高；在RT+25 mmol/L EDTA條件下時，盡管富集量最高，但在絨毛富集物中出現(xiàn)了較多的隱窩細胞團，隱窩富集物中也出現(xiàn)了大量絨毛碎片(圖1-E、圖1-F)。直觀可看出，在LT+10～15 mmol/L EDTA條件下分離效果較好(圖1-C、圖1-D)。

2.2各分離條件對絨毛細胞富集率與絨毛相對完整率的影響

由圖2可知，各EDTA濃度條件下，RT組絨毛細胞富集率均極顯著高于LT組(P<0.01)，且2種溫度條件下絨毛細胞富集率均隨著EDTA濃度升高而升高。在EDTA濃度小于等于15 mmol/L時，LT組絨毛相對完整率極顯著高于RT組(P<0.01)，且隨著EDTA的濃度升高絨毛相對完整率降低；在EDTA濃度大于等于20 mmol/L時，RT組與LT組絨毛相對完整率差異不顯著(P>0.05)。

2.3各分離條件對隱窩細胞富集率與相對活率的影響

由圖3可知，各EDTA濃度條件下，RT組隱窩細胞富集率均極顯著高于LT組(P<0.01)，且2種溫度條件下隱窩細胞富集率均隨著EDTA濃度升高而升高。當EDTA濃度小于等于10 mmol/L時，LT組隱窩細胞相對活率極顯著高于RT組(P<0.01)，且隨著EDTA的濃度的升高隱窩細胞相對活率逐漸降低；當EDTA濃度大于等于15 mmol/L時，LT組與RT組的隱窩細胞相對活率均極低且2組間差異不顯著(P>0.05)。由圖可以看出，LT+5～10 mmol/L EDTA組與RT+5 mmol/L EDTA組的隱窩細胞相對活率較高，但LT+5 mmol/L EDTA組的隱窩細胞富集率極低，僅為(1.01±0.02)%。

圖示A與B、C與D、E與F分別為LT+5 mmol/L EDTA、LT+10 mmol/L EDTA、RT+25 mmol/L EDTA條件下分離的絨毛與隱窩細胞團的形態(tài)。

This picture showed the morphology of separated villus and crypt cells under LT+5 mmol/L EDTA (A and B), LT+10 mmol/L EDTA (C and D) and RT+25 mmol/L EDTA (E and F), respectively.

圖1絨毛和隱窩細胞富集物的形態(tài)學觀察

Fig.1Morphological observation of villus and crypt enrichments

同指標同EDTA濃度，數(shù)據(jù)點標注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖3同。

In the same index and the same EDTA concentration, value points with different capital letters mean significant difference (P<0.01), while with no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.3.

圖2各分離條件下絨毛細胞富集率與絨毛相對完整率

Fig.2Villus cell enrichment ratio and villus relative integrity rate under different separated conditions

圖3　各分離條件下隱窩細胞富集率與相對活率

2.4絨毛和隱窩細胞基因組DNA、總RNA保存完整性測定結果

富集的細胞團提取DNA、總RNA后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，結果如圖4和圖5所示。各處理條件下，細胞基因組DNA完整，未見彌散拖尾現(xiàn)象；總RNA可見28S、18S和5S條帶，表明分離過程中細胞處于存活狀態(tài)。

A為絨毛細胞，B為隱窩細胞。RT與LT條件下EDTA濃度左起分別為5、10、15、20、25 mmol/L。圖5同。

A was villus cell, and B was crypt cell. From left to right, the concentration of EDTA was 5, 10, 15, 20 and 25 mmol/L, respectively. The same as Fig.5.

圖4絨毛和隱窩富集物基因組DNA電泳

Fig.4Electrophoresis of the genome DNA extracted from crypt and villus enrichments

圖5　絨毛和隱窩富集物總RNA電泳

2.5絨毛和隱窩細胞團差異表達基因檢測結果

根據(jù)前述的試驗結果，選取了綜合分離效果最佳的LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的絨毛和隱窩細胞，檢測其DEFEN與LYZ的相對表達量，由表2可知，隱窩富集物中DEFEN與LYZ的相對表達量極顯著高于絨毛富集物(P<0.01)。

2.6隱窩細胞在培養(yǎng)過程中相關基因表達量變化

在LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的隱窩細胞經(jīng)培養(yǎng)1、3、5、7、9 h后，檢測了DEFEN與LYZ的相對表達量，結果如圖6。在1～9 h過程中，DEFEN與LYZ的相對表達量均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，但在最初的1 hLYZ與DEFEN的相對表達量有低于3～9 h時的趨勢(0.05

3討論

小腸上皮細胞體外培養(yǎng)是研究腸道相關生理功能的重要手段，相比于各細胞系而言，原代培養(yǎng)的細胞生理性狀與體內(nèi)狀態(tài)更接近，在一定程度上能較好地反映小腸的真實生理特征[19]。為更深入的研究腸干細胞生理及潘氏細胞免疫等功能，國內(nèi)外報道了多種絨毛與隱窩細胞分離方法，常用的螯合劑為EDTA和DTT[20]。EDTA通過螯合作用可以結合并降低組織液中的鈣、鎂離子，破壞細胞之間的緊密連接，在機械力的作用下使細胞分離，因此可用于縱向分離腸絨毛與隱窩[21]。DTT能夠破壞分子間的二硫鍵，迅速地去除黏液及黏附的細菌，達到分離細胞的目的[14]。螯合劑對細胞有一定的毒害作用，其毒性取決于螯合劑種類、濃度、作用溫度與時間[22]。動物的年齡、生理狀況、腸段大小和腸道緊密連接狀態(tài)不同，分離條件也有所不同。

根據(jù)各成分作用原理，本研究對沿用次數(shù)較多的Flint等[15]的螯合劑配方進行了改良，除加入一定濃度的EDTA外，還加入了5 mmol/L EGTA，并在清洗腸段時加入0.5 mmol/L DTT以快速去除黏液。在分離過程中，使用螯合劑將絨毛和隱窩細胞從小腸組織上分級洗脫下來之后，需要快速去除螯合劑以縮短螯合劑對細胞毒害的時間，且需根據(jù)絨毛與隱窩自身沉降系數(shù)不同進行富集物的純化。離心純化絨毛時需根據(jù)試驗動物大小確定轉(zhuǎn)速和時間，要求離心力不應過大(<300×g)，防止離心力對絨毛結構造成破壞，并能避免將隱窩細胞離心混入絨毛沉淀中[22]。對于較大體型動物的小腸，可使用自然沉降法獲得高純度的絨毛。在隱窩洗脫時不可避免地會混入少量絨毛，需要確定合適的自然沉降時間純化隱窩細胞。一般以上清液中針尖樣大小細胞團即絨毛全部沉入底部時為合理的沉降時間[13]。

本研究結果表明，雖然各分離條件下細胞基因組DNA和總RNA均保存完整，但在不同條件下分離效果存在顯著差異。溫度越高，螯合劑濃度越大，得到的富集物越多，但細胞團純度、絨毛完整性和隱窩細胞活率也越差，甚至會對細胞產(chǎn)生一定毒害作用。首先，高EDTA濃度可提高富集率，但同時也是降低隱窩細胞活率和絨毛完整性的主要因素，本研究顯示，EDTA濃度高于15 mmol/L時，EDTA濃度對絨毛完整性和隱窩細胞活率的損傷作用遠大于溫度，作為后續(xù)培養(yǎng)的材料，細胞活率和組織完整性是首要考慮的指標，因此，分離時的EDTA濃度不宜高于15 mmol/L。其次，較高的螯合溫度可提高富集率，但同時也會降低絨毛完整性和隱窩細胞活率。對絨毛而言，溫度越高絨毛碎片越多，即使在最低EDTA濃度條件下，RT組的絨毛完整性也極顯著低于LT組，故分離溫度應選擇低溫；對于隱窩而言，LT+EDTA濃度低于10 mmol/L組和RT+5 mmol/L EDTA組的細胞活率均較好，但LT+5 mmol/L EDTA組隱窩富集率僅有(1.01±0.02)%，細胞量已不能滿足后續(xù)試驗要求。綜合考慮絨毛和隱窩細胞的分離效果，本研究選擇LT+10 mmol/L EDTA為最適分離條件。

表2　絨毛、隱窩富集物DEFEN與LYZ的相對表達量

同行數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

數(shù)據(jù)柱形無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。

Value columns with no letter mean no significant difference (P>0.05).

圖6經(jīng)細胞培養(yǎng)后隱窩富集物DEFEN與

LYZ的相對表達量

Fig.6Relative expression levels ofDEFENandLYZin crypt enrichments by cell cultured

在小腸上皮細胞中，DEFEN和LYZ主要在隱窩的潘氏細胞中表達，因而富集物中這2個基因的差異表達可以有效說明所富集細胞的純度和分離效果。本試驗結果表明，分離的隱窩富集物中DEFEN和LYZ的相對表達量極顯著高于絨毛富集物，顯示分離的絨毛和隱窩細胞純度很高，達到預期分離效果。本研究對LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的隱窩細胞進行了短時間培養(yǎng)以檢測是否達到后續(xù)研究的要求。培養(yǎng)3～9 h過程中，隱窩細胞中DEFEN與LYZ的相對表達量均未發(fā)生顯著變化，表明培養(yǎng)過程中細胞生理狀態(tài)穩(wěn)定；在最初的1 h，LYZ與DEFEN的相對表達量有低于3～9 h時的趨勢，這可能與分離過程中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏及LT造成了細胞的饑餓和應激有關，但在隨后的培養(yǎng)中得到了恢復。這些結果表明，LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的小腸絨毛和隱窩細胞可以滿足后續(xù)研究的要求。

4結論

① 2個溫度和5種EDTA濃度條件下對家兔小腸絨毛和隱窩細胞的分離效果有較大差異，低溫螯合時細胞富集率較低，但細胞活率較高，螯合劑中EDTA濃度越高細胞富集率越高，而細胞活率則相應降低。

② 本研究中，LT+10 mmol/L EDTA為最佳分離條件，得到的絨毛和隱窩細胞富集率和純度較高，形態(tài)完整，細胞活率高。

③ 在37 ℃、5% CO2、無血清的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 h后的隱窩細胞依然具有較高活力，顯示分離的絨毛和隱窩細胞可用于家兔小腸生理特性相關研究。

參考文獻：

[1]PETERSON L W,ARTIS D.Intestinal epithelial cells:regulators of barrier function and immune homeostasis[J].Nature Reviews Immunology,2014,14(3):141-153.

[2]HORITA N,TSUCHIYA K,HAYASHI R,et al.Fluorescent labelling of intestinal epithelial cells reveals independent long-lived intestinal stem cells in a crypt[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2014,454(4):493-499.

[3]BEDFORD A,CHEN T,HUYNH E,et al.Epidermal growth factor containing culture supernatant enhances intestine development of early-weaned pigsinvivo:potential mechanisms involved[J].Journal of Biotechnology,2015,196-197:9-19.

[4]GRABINGER T,LUKS L,KOSTADINOVA F,et al.Exvivoculture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy[J].Cell Death & Disease,2014,5(5):e1228.

[5]VINCENT A,KAZMIERCZAK C,DUCHNE B,et al.Cryosectioning the intestinal crypt-villus axis:an ex vivo method to study the dynamics of epigenetic modifications from stem cells to differentiated cells[J].Stem Cell Research,2015,14(1):105-113.

[6]BERDASCO M,ESTELLER M.DNA methylation in stem cell renewal and multipotency[J].Stem Cell Research and Therapy,2011,2(5):42.

[7]CLEVERS H.The intestinal crypt,a prototype stem cell compartment[J].Cell,2013,154(2):274-284.

[8]TANCOS Z,NEMES C,POLGAR Z,et al.Generation of rabbit pluripotent stem cell lines[J].Theriogenology,2012,78(8):1774-1786.

[9]BEVINS C L,SALZMAN N H.Paneth cells,antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis[J].Nature Reviews Microbiology,2011,9(5):356-368.

[10]SALZMAN N H.Paneth cell defensins and the regulation of the microbiome:detente at mucosal surfaces[J].Gut Microbes,2010,1(6):401-406.

[11]EVANS G S,FLINT N,SOMERS A S,et al.The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures[J].Journal of Cell Science,1992,101(Pt 1):219-231.

[12]POTHIER P,HUGON J S.Characterization of isolated villus and crypt cells from the small intestine of the adult mouse[J].Cell and Tissue Research,1980,211(3):405-418.

[13]BJERKNES M,CHENG H.Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine[J].The Anatomical Record,1981,199(4):565-574.

[14]AYABE T,SATCHELL D P,WILSON C L,et al.Secretion of microbicidal α-defensins by intestinal Paneth cells in response to bacteria[J].Nature Immunology,2000,1(2):113-118.

[15]FLINT N,COVE F L,EVANS G S.A low-temperature method for the isolation of small-intestinal epithelium along the crypt-villus axis[J].Biochemical Journal,1991,280(2):331-334.

[16]FULLER M K,FAULK D M,SUNDARAM N,et al.Intestinal crypts reproducibly expand in culture[J].Journal of Surgical Research,2012,178(1):48-54.

[17]寧宇,王鋒超,劉登群,等.在體分離小鼠小腸隱窩絨毛上皮細胞的生化完整性研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2009,9(14):2610-2612.

[18]高博,楊曉農(nóng),于學輝,等.家兔GAPDH基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(1):69-73.

[19]GROSSMANN J,WALTHER K,ARTINGER M,et al.Progress on isolation and short-termex-vivoculture of highly purified non-apoptotic human intestinal epithelial cells (IEC)[J].European Journal of Cell Biology,2003,82(5):262-270.

[20]CANO-GAUCI D F,LUALDI J C,OUELLETTE A J,et al.InvitrocDNA amplification from individual intestinal crypts:a novel approach to the study of differential gene expression along the crypt-villus axis[J].Experimental Cell Research,1993,208(2):344-349.

[21]CHOUGULE P,HERLENIUS G,HERNANDEZ N M,et al.Isolation and characterization of human primary enterocytes from small intestine using a novel method[J].Scandinavian Journal of Gastroenterology,2012,47(11):1334-1343.

[22]TAUC H M,TASDOGAN A,PANDUR P.Isolating intestinal stem cells from adultDrosophilamidguts by FACS to study stem cell behavior during aging[J].Journal of Visualized Experiments,2014(94):52223.

(責任編輯菅景穎)

Separation of Rabbit Intestinal Villus and Crypt Cells Using Improved Cryogenic Chelating Method and Separation Effect Identification

SHEN XuemeiLI JingZHANG GangCUI HongxiaoLIU LihuiYAO JunhuXU Xiurong*

(College of Animal Science and Technology, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)

Abstract:This study aimed to investigate the separation method of rabbit intestinal villus and crypt cells, which can be served as the in vitro model for study on the structure and function of the intestinal epithelium. The experiment used New Zealand white rabbits as test material, and separated their intestinal villus and crypt cells under the conditions of different chelating agent concentrations [5, 10, 15, 20 and 25 mmol/L ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)] and chelating temperatures (4 and 25 ℃). Then the yield, morphology, cell viability rate and integrity of the separated cells were detected. The results showed as follows: 1) under different chelating separation conditions, all of the collected villus and crypt cells remained morphological integrity, and the genomic DNA and total RNA of these villus and crypt cells were intact. 2) The higher chelating temperature and EDTA concentration was, the greater cell enrichment rate was obtained, but the toxic effect on cell was stronger. The enrichment rate of villus and crypt cells in group LT+5 mmol/L EDTA was 7.75% and 1.01%, and that in group RT+25 mmol/L EDTA was 17.89% and 4.99%, respectively; while the relative integrity rate of villus and relative viability rate of crypt cells in the former group were 91.67% and 93.48%, and were 4.25% and 5.17% in the latter group, respectively. 3) By a comprehensive analysis, the best separation effect was observed under the condition of 4 ℃ and 10 mmol/L EDTA. 4) The relative expression levels of lysozyme and α-defensin genes from crypt enrichment separated under the optimal condition were significantly higher than those of from villus enrichment (P<0.01), and it indicated that cells in a higher purity. In addition, relative expression levels of lysozyme and α-defensin genes from the crypt cell separated under the optimal condition had no significantly change after cultured for 9 h (P>0.05), and it indicated that cells still had a higher vitality after cultured for 9 h. In conclusion, the improved cryogenic chelating method is suitable for separating rabbit intestinal villus and crypt cells effectively.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1442-1449]

Key words:crypt; villus; intestine epithelial cell; chelating agents; rabbits

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.020

收稿日期：2015-12-04

基金項目：陜西省科技攻關項目(2013K02-18)

作者簡介：沈雪梅(1990—)，女，四川樂山人，碩士研究生，特種經(jīng)濟動物營養(yǎng)調(diào)控專業(yè)。E-mail: forshenxuemei@163.com *通信作者：徐秀容，副教授，碩士生導師，E-mail: xuxiurong@nwafu.edu.cn

中圖分類號：R329

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)05-1442-08

*Corresponding author, associate professor, E-mail: xuxiurong@nwafu.edu.cn