外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓治療非感染性骨折不愈合實(shí)驗(yàn)研究

段建偉　魏俊強(qiáng)　張猛　閆石

067000 承德，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷小兒骨科，在讀研究生(段建偉，張猛)

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外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓治療非感染性骨折不愈合實(shí)驗(yàn)研究

段建偉魏俊強(qiáng)張猛閆石

067000 承德，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷小兒骨科，在讀研究生(段建偉，張猛)

【摘要】目的探討外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)治療非感染性骨折不愈合的療效及可能的生物學(xué)機(jī)制。方法建立新西蘭大白兔股骨干非感染性骨折不愈合模型，將造模成功的87只兔按不同處理方法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白對(duì)照組各29只。將實(shí)驗(yàn)組骨折不愈合端復(fù)位后用外固定架進(jìn)行加壓-牽開(kāi)-再加壓治療；將對(duì)照組的骨折不愈合斷端復(fù)位后用外固定架加壓，但不牽開(kāi)；將空白對(duì)照組的骨折不愈合斷端復(fù)位后用外固定架固定，保證骨折端接觸，既不加壓也不牽開(kāi)。于處理后的第2、4、6、8、12周對(duì)3組進(jìn)行X線片骨痂評(píng)定，對(duì)截取的骨樣本進(jìn)行組織學(xué)觀察，采用免疫組織化學(xué)檢查觀察骨痂中VEGF的表達(dá)情況(著色細(xì)胞個(gè)數(shù))。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的骨折愈合率高于其他2組(P均<0.017)。 處理后第8、12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量新骨形成，成骨細(xì)胞貼附于骨的邊緣，且成骨過(guò)程基本完成；對(duì)照組未見(jiàn)軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的增生，骨痂量也未見(jiàn)明顯的增多；空白對(duì)照組斷端為成熟的纖維結(jié)締組織，有少量的軟骨痂及骨痂。有關(guān)VEGF的表達(dá)情況，處理后2～4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組著色細(xì)胞個(gè)數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但均較空白對(duì)照組多(P均<0.05)；6～12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組著色細(xì)胞個(gè)數(shù)均較對(duì)照組多(P均<0.05)。結(jié)論外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)治療非感染性骨折不愈合有效，該法可能通過(guò)增加VEGF的表達(dá)達(dá)到治療效果。

【關(guān)鍵詞】新西蘭大白兔；伊利扎羅夫技術(shù)；外固定架；加壓-牽開(kāi)-再加壓；張力-應(yīng)力法則；骨折，不愈合

Compression-distraction-compression; Tension-stress principle; Fracture，Nonunion

近年來(lái)，隨著我國(guó)工業(yè)和建筑業(yè)的發(fā)展，高能量損傷大量增加，骨折患者也增加，骨折經(jīng)治療后不愈合的發(fā)生率為5%～10%[1-2]。經(jīng)典的治療骨折不愈合的方法為重建骨折愈合所需的力學(xué)因素，顯露骨折不愈合處，去除硬化的纖維組織后暢通髓腔，取髂骨植骨。此法雖然能使一些骨折不愈合或延遲愈合的病例實(shí)現(xiàn)愈合，但其創(chuàng)傷大，會(huì)造成骨折斷端血運(yùn)的破壞，存在感染風(fēng)險(xiǎn)，造成髂骨部分缺失及后續(xù)并發(fā)癥。使用外固定架具有操作簡(jiǎn)單、手術(shù)時(shí)間短、出血少、愈合時(shí)間早等優(yōu)勢(shì)，有報(bào)道示，近幾年出現(xiàn)的新技術(shù)即應(yīng)用了外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓治療非感染性骨折不愈合[3]。本研究組擬從影像學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)檢查(免疫組化)等方面對(duì)此技術(shù)進(jìn)行研究。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

102只8月齡、體質(zhì)量為1.5～2.5 kg的雄性新西蘭大耳白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物分籠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境下(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，自由活動(dòng)，溫度控制于(25.0±0.5)℃，濕度為60%，定期消毒排風(fēng)，飼養(yǎng)16周。試驗(yàn)中對(duì)兔的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求[4]。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

根據(jù)趙震宇等[5-6]的方法建立兔股骨骨折不愈合模型。將戊巴比妥鈉50 mg/kg靜脈注射于兔的耳緣靜脈將其麻醉后，用電動(dòng)褪毛器為其褪毛，常規(guī)碘伏消毒、鋪單，手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。取左股骨干外側(cè)切口，暴露股骨中段。置入外固定架，在股骨遠(yuǎn)、近端分別用電鉆自股骨外側(cè)垂直股骨干鉆透雙側(cè)骨皮質(zhì)，平行擰入2枚直徑2.0 mm半針，安裝外固定架。用線鋸將股骨截?cái)?，并去除截骨部位的骨膜和骨髓，并使骨折斷端分離1.5 cm，然后徹底止血、沖洗傷口、逐層縫合[7]。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素40萬(wàn)U，1次/日，共3 d。將兔分籠飼養(yǎng)，于術(shù)后8周攝X線片檢查模型是否制作成功，成功則如圖1A。102只兔中有5只因腹瀉和麻醉意外死亡，9只因造模術(shù)后切口感染及內(nèi)固定失效而無(wú)法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，余下87只造模成功。

三、造模成功后的處理方法

將造模成功的87只兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組各29只。將實(shí)驗(yàn)組骨折不愈合斷端復(fù)位后用外固定架進(jìn)行加壓-牽開(kāi)-再加壓治療，先以0.5 mm/d的速度持續(xù)加壓4周，然后以0.5 mm/d的速度持續(xù)牽開(kāi)2周，再以同樣的速度加壓4周；將對(duì)照組的骨折不愈合斷端復(fù)位后用外固定架加壓，以0.5 mm/d的速度持續(xù)加壓4周；將空白對(duì)照組的骨折不愈合斷端復(fù)位后用外固定架固定，保證骨折端接觸，既不加壓也不牽開(kāi)。

四、X線片檢查

于處理后的第2、4、6、8、12周將3組麻醉后分別用計(jì)算機(jī)X線成像記錄X線片拍攝情況，參照Ciotakis等[8]制定的X線片骨痂評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)判斷治療效果，即：斷端邊緣稍模糊，骨膜反應(yīng)輕度，無(wú)骨痂者為0分；斷端邊緣明顯模糊，內(nèi)外骨痂密度略高于軟組織，骨折間隙1/2以上出現(xiàn)骨痂者為1分；斷端邊緣大部分消失，內(nèi)外骨痂密度接近于髓腔，骨折間隙1/2以上出現(xiàn)骨痂連接者為2分；斷端邊緣趨于消失，內(nèi)外骨痂密度近似于皮質(zhì)骨，骨折間隙1/2以上出現(xiàn)骨痂連接者為3分；斷端邊緣完全消失，內(nèi)外骨痂密度等同皮質(zhì)骨并連續(xù)，髓腔再通為4分，3～4分為骨折愈合。

五、制作標(biāo)本

處理后的第2、4、6、8、12周行X線片檢查后，3組分別隨機(jī)選取5只兔處死，截取其左股骨中段骨痂和軟組織，將骨痂和軟組織用生理鹽水沖洗后立即放入4%多聚甲醛(pH=7.4)中，于4℃固定24～48 h，用20%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA2Na)脫鈣2～6周，3～4 d更換1次脫鈣液，脫鈣滿意后，用梯度酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明，縱向石蠟包埋，做成層厚6 μm的縱向組織切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。

六、免疫組化染色

將石蠟包埋后的組織塊切片后按說(shuō)明書操作進(jìn)行免疫組化染色，在20×20顯微鏡視野下，以細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)程度，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，對(duì)細(xì)胞(包括著色和未著色)進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中所用VEGF多克隆抗體由上海艾博抗貿(mào)易有限公司提供，組織的染色采用SP法。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、影像學(xué)觀察結(jié)果

1.實(shí)驗(yàn)組

治療第2周時(shí)骨折斷端邊緣稍模糊，骨痂密度略高于軟組織，斷端出現(xiàn)將近1/2骨痂(圖1B)；第4周時(shí)，斷端邊緣明顯模糊，骨折間隙1/2以上出現(xiàn)骨痂；第6周時(shí)，斷端邊緣大部分消失，骨痂密度接近髓腔(圖1C)；第8周時(shí)，斷端邊緣趨于消失，骨痂密度近似皮質(zhì)骨，骨折間隙1/2以上出現(xiàn)骨痂連接；第12周時(shí)，剩余的9只兔中除1只(1/9)因內(nèi)固定失效、骨折未愈合處，其余8只(8/9)兔骨折斷端完全消失，骨痂密度等同皮質(zhì)骨，骨折愈合(圖1D)。

圖1　實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間非感染性骨折不愈合恢復(fù)情況

A：模型制作成功(箭頭所示)；B：斷端加壓4周后；C：牽開(kāi)2周后；D：處理后第12周

2.對(duì)照組

第2周時(shí)，骨折斷端模糊，骨痂密度略高于軟組織，斷端出現(xiàn)近1/2骨痂；第4周時(shí)，斷端邊緣明顯模糊，內(nèi)外骨痂密度接近于髓腔；第12周時(shí)，剩余的9只兔中有7只(7/9)斷端骨痂連接少于50%，髓腔未再通，骨折未愈合。2只(2/9)斷端邊緣消失，髓腔再通，骨折愈合。

3.空白對(duì)照組

第4周時(shí)，萎縮、硬化的骨折斷端未出現(xiàn)輕度骨膜反映，未見(jiàn)骨痂；第12周時(shí)，所有兔的骨髓腔仍為封閉，無(wú)1只愈合。

術(shù)后各組不同時(shí)間X線片骨痂評(píng)定情況見(jiàn)表1。第12周時(shí)，3組總體骨折愈合情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較示實(shí)驗(yàn)組的骨折愈合率高于其他2組(P均<0.05/3)。

表1　實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白對(duì)照組不同時(shí)間X線片骨痂評(píng)定情況±s)　分

注：3組12周總體比較F=62.672，P<0.001；不同時(shí)間總體比較F=11.602，P<0.01

二、組織學(xué)觀察

第2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨折斷端有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)；空白對(duì)照組斷端為成熟的纖維結(jié)締組織(圖2B)。第4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組靠近骨折斷端的兩側(cè)有少量骨膜細(xì)胞增生，已有部分成骨，并開(kāi)始出現(xiàn)少量的軟骨細(xì)胞填充骨折區(qū)，已無(wú)纖維結(jié)締組織和肉芽組織，有少量血管生成，可見(jiàn)極少量吞噬死骨塊的破骨細(xì)胞。第6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)大量的軟骨細(xì)胞增生，并開(kāi)始分泌軟骨基質(zhì)，成骨細(xì)胞也明顯增多，其中可見(jiàn)由成骨細(xì)胞增生而來(lái)的骨小梁(圖2C、D)；對(duì)照組軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞未見(jiàn)明顯增多，有少量的骨痂形成。第8、12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量新骨形成，成骨細(xì)胞貼附于骨的邊緣，且成骨過(guò)程基本完成；對(duì)照組仍未見(jiàn)軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的增生，骨痂量也未見(jiàn)明顯的增多；空白對(duì)照組斷端為成熟的纖維結(jié)締組織，有少量的軟骨痂及骨痂。

圖2　非感染性骨折不愈合組織學(xué)觀察圖

A：纖維組織向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化(箭頭所示)， HE×100；B：骨折不愈合病理，HE×100；C：軟骨細(xì)胞(箭頭所示)，HE×200；D：部分軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化(箭頭所示)，HE×100

三、免疫組化觀察結(jié)果

細(xì)胞(包括著色和未著色)個(gè)數(shù)見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨折斷端開(kāi)始加壓后的4周內(nèi)，可見(jiàn)少量輕微著色的單核細(xì)胞，著色較深的為肥大和成熟的軟骨細(xì)胞，VEGF高表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性的為和原始骨小梁相連的軟骨細(xì)胞，而骨痂內(nèi)幼稚的軟骨細(xì)胞為陰性，在破骨細(xì)胞中也可看到VEGF的表達(dá)。4～6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中肥大的軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)VEGF持續(xù)高表達(dá)，對(duì)照組4周時(shí)曾可見(jiàn)VEGF高表達(dá)情況，但其后未能持續(xù)，空白對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)VEGF高表達(dá)的情況。6周后，實(shí)驗(yàn)組骨小梁在逐漸成熟過(guò)程中，成骨細(xì)胞逐漸減少，VEGF的表達(dá)也逐漸下降，而骨基質(zhì)VEGF為散在陽(yáng)性。

表2　實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白對(duì)照組骨痂中不同時(shí)間VEGF表達(dá)(著色細(xì)胞個(gè)數(shù))的變化±s)　個(gè)

討論

非感染性骨折不愈合分為肥大型和萎縮型。肥大型骨折不愈合的原因?yàn)楣潭ú环€(wěn)后引起的異常應(yīng)力抑制了骨折愈合的進(jìn)程。更換穩(wěn)定的固定可使多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，使骨折愈合。而萎縮型骨折不愈合斷端組織無(wú)生物愈合的能力，治療過(guò)程中需給予足夠的生物學(xué)刺激促進(jìn)組織再生。本實(shí)驗(yàn)以新西蘭大白兔為研究對(duì)象，依據(jù)趙震宇等[5-6]的方法造成股骨萎縮型骨折不愈合模型，造模成功后應(yīng)用外固定架對(duì)斷端采用加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)治療骨折不愈合取得成功。

一、外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)治療無(wú)菌性骨折不愈合的作用機(jī)制

骨折斷端復(fù)位后逐漸加壓過(guò)程除增加固定的穩(wěn)定性外，斷端纖維組織受到擠壓逐漸壞死，壞死后的組織誘發(fā)炎癥反應(yīng)，開(kāi)始刺激骨愈合的過(guò)程，重啟骨折斷端愈合的潛能。處理后在對(duì)斷端加壓的過(guò)程中，斷端處于微小不間斷移動(dòng)加壓狀態(tài)，有利于成骨。而在對(duì)斷端牽開(kāi)的過(guò)程中，組織受到持續(xù)牽開(kāi)的應(yīng)力，促使其再生和修復(fù)，使前開(kāi)的間隙發(fā)生成骨過(guò)程。而再加壓過(guò)程能使新生成的骨組織被嵌壓在斷端，產(chǎn)生類似“自身植骨”的作用。這種加壓-牽開(kāi)-再加壓的過(guò)程被稱為“手風(fēng)琴”技術(shù)[8]。

二、VEGF高表達(dá)促進(jìn)骨折愈合

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們通過(guò)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組斷端被加壓過(guò)程中，斷端成熟的纖維結(jié)締組織受壓后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠仔匀庋拷M織。在加壓的后期(第4周時(shí))可見(jiàn)骨膜細(xì)胞增生并部分成骨，開(kāi)始出現(xiàn)軟骨細(xì)胞。對(duì)實(shí)驗(yàn)組骨折斷端牽開(kāi)2周后，斷端的軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞明顯增多，而對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象。對(duì)實(shí)驗(yàn)組再加壓4周后，斷端大量新骨形成，髓腔再通，骨折愈合?？瞻讓?duì)照組斷端只有少量的軟骨痂及骨痂。同時(shí)，免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第4周時(shí)VEGF的表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而第6、8、12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組VEGF的表達(dá)量均多于空白對(duì)照組，說(shuō)明加壓-牽開(kāi)-再加壓的過(guò)程能增加VEGF的表達(dá)，這可能是外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)能治愈非感染性骨折不愈合的生物學(xué)機(jī)制之一。

我們認(rèn)為造成VEGF增多的原因?yàn)椋簩?duì)骨折斷端加壓后，骨折的修復(fù)及肉芽組織的增長(zhǎng)使得斷端的血供減少、氧分壓降低，缺氧環(huán)境能促進(jìn)成骨細(xì)胞中VEGF的表達(dá)[9]。VEGF不僅可使血管生成增多，為成骨細(xì)胞提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成新的骨小梁，而且能促進(jìn)成骨[10]。我們觀察到實(shí)驗(yàn)組中VEGF在肥大的軟骨細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，其作用可能為通過(guò)自分泌和旁分泌的形式促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化、血管形成。相反，既無(wú)加壓也無(wú)牽開(kāi)的空白對(duì)照組的軟骨細(xì)胞中VEGF的表達(dá)明顯少，VEGF的減少抑制了軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和成骨細(xì)胞的增殖，該組無(wú)一只能治愈。

三、總結(jié)

外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)治療非感染性骨折不愈合有效，該法可能通過(guò)增加VEGF的表達(dá)治愈非感染性骨折不愈合。本實(shí)驗(yàn)不足之處包括：①以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，雖達(dá)到預(yù)期效果，但因新西蘭大白兔與人存在物種差異，外固定架加壓-牽開(kāi)-再加壓技術(shù)應(yīng)用于臨床需在醫(yī)學(xué)倫理及臨床的允許下謹(jǐn)慎進(jìn)行，取得顯著成果后方可應(yīng)用于臨床；②僅通過(guò)對(duì)橫行骨折不愈合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，初步研究促進(jìn)骨折愈合的軸向應(yīng)力，尚不能為臨床提供各種骨折類型的參考依據(jù)，還需從深度、廣度進(jìn)一步研究；③此技術(shù)不能解決截骨對(duì)肢體造成的短縮[10]。

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Experimental study of accordion maneuver in the treatment of non-infected nonunion using external fixator

DuanJianwei,WeiJunqiang,ZhangMeng,YanShi.

DepartmentofPediatricTraumaOrthopedics,theAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,ChinaCorrespondingauthor,YanShi,E-mail:yanshi1967@163.com

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the efficacy and explore the biological mechanism of the accordion maneuver in the treatment of non-infected fracture nonunion. MethodsEighty seven New Zealand white rabbit models with non-infected femoral nonunion were successfully established and randomly divided into three groups (n=29). In the experimental group, the animals were treated with the accordion technique of alternating compression with distraction using external fixator after femoral reduction. In the control group, the rabbits were handled with compression without distraction following femoral reduction. In blank control group, the femoral fracture was fixed after femoral reduction without compression or distraction. At 2, 4, 6, 8, 12 weeks after corresponding treatment, X-ray imaging was performed to assess the callus formation. Immunohistochemistry staining was utilized to measure the expression level of VEGF (quantity of stained cells). ResultsThe percentage of bone union in the experimental group was significantly higher compared with those in the control and blank control groups (P<0.017). At 8 and 12 weeks after treatment, a large quantity of new bone formation was observed and osteoblasts attached to the bone margin. The process of osteogenesis was almost completed. In the control group, neither chondrocyte nor osteoblast proliferation was documented. No apparent increase in callus formation was found. In the blank control group, mature fibrous connective tissue was observed at the end of bone fracture. A slight amount of chondrocyte and bone callus formation was noted. At 2 and 4 weeks, the quantity of stained cells did not significantly differ between the experimental and control groups (P>0.05), whereas both considerably higher than that in the blank control group (both P<0.05). At 6 and 12 weeks, the number of stained cells in the experimental group was significantly higher compared with that in the control group (P<0.05). ConclusionThe accordion technique is an efficacious treatment of non-infected nonunion by up-regulating the expression of VEGF.

【Key words】New Zealand rabbit; Ilizarov technique; External fixator;

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.009

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題(ZL20140067)

(收稿日期：2015-11-20)(本文編輯：洪悅民)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，閆石，E-mail：yanshi1967@163.com