汪　蓉，沈　晨，吳　虹，王　偉，孫亮亮，李淑萍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院　安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230012)

牛膝不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛及抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用

汪蓉，沈晨，吳虹，王偉，孫亮亮，李淑萍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的觀察牛膝不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛及抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用。方法采用二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)、熱板實(shí)驗(yàn)及醋酸誘導(dǎo)小鼠扭體實(shí)驗(yàn)，觀察牛膝不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用；采用2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)來觀察牛膝不同提取部位的抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)作用。結(jié)果牛膝的正丁醇提取部位能顯著減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹(P<0.05)，顯著延長小鼠在熱板上的舔足時(shí)間以及減少醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體次數(shù)(P<0.05)，明顯降低DNCB誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠的耳腫脹度、胸腺指數(shù)及脾指數(shù)(P<0.05)；石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位對二甲苯誘導(dǎo)的炎癥、熱板和醋酸誘導(dǎo)的疼痛及DNCB誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)之部分指標(biāo)有明顯抑制作用(P<0.05)。結(jié)論牛膝的正丁醇提取部位具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛以及抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)作用。

[關(guān)鍵詞]牛膝；提取部位；抗炎；鎮(zhèn)痛；遲發(fā)型超敏反應(yīng)

牛膝(AchyranthisBidentataeRadix)為莧科多年生草本植物牛膝的干燥根[1]，主要產(chǎn)于河南，是常用的中藥[2]。其味甘、酸、苦，性平，入肝和腎經(jīng)。具有散瘀通經(jīng)、引血下行、引諸藥下行、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，常用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻腹痛、跌打損傷、腰膝酸痛、下肢無力、尿血、小便不利、尿道澀痛等病證[3-7]。牛膝含有糖類、皂苷類、植物甾酮類、黃酮類等多種化學(xué)成分[8-11]?，F(xiàn)代藥理研究[12-16]表明，牛膝還具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗腫瘤、延緩衰老等藥理作用?，F(xiàn)代臨床上常用來治療膝關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、哮喘等[17-18]。

本課題組前期通過水提醇沉方法對牛膝粉末進(jìn)行提取，再分別利用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚溶劑進(jìn)行萃取，最終得到牛膝中不同極性部位(正丁醇提取部位含量為50.3%，乙酸乙酯提取部位含量為25.6%，石油醚提取部位含量為13.9%)。本研究在此基礎(chǔ)上，探討牛膝不同極性提取部位的抗炎、鎮(zhèn)痛及抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity, DTH)的作用，找出其抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位，為牛膝“引諸藥下行”的功效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠，生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2011-0003，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在恒溫(24±2)℃、在明暗各12 h的光照周期中飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物與試劑正清風(fēng)痛寧片：每片含鹽酸青藤堿20 mg，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號 1404105；牛膝粉末：購自安徽省中藥材公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室鑒定，符合《中華人民共和國藥典》2010版的要求；二甲苯：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，批號 20121220；冰乙酸：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，批號 20130720；2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)；丙酮：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，批號 20130220。牛膝不同部位的提取方法：稱取牛膝藥材粉末適量，加12倍量的水，提取3次，每次0.5 h，加入無水乙醇至指定濃度，濾過，濾液蒸至無醇味；依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得到正丁醇層、乙酸乙酯層和石油醚層，再分別蒸干石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，得到干膏，備用。

1.3儀器和設(shè)備微量移液器：德國Eppendorf；JY10001電子天平：上海良平儀器；XS105 DU電子天平：瑞士Mettler Toledo；8 mm直徑打孔器；RB-200智能熱板儀：四川省成都泰盟科技有限公司。

2方法

2.1二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)[19-20]取健康昆明種雄性小鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為空白對照組(同容積生理鹽水灌胃)、正丁醇提取組(120 mg/kg)、乙酸乙酯提取組(120 mg/kg)、石油醚提取組(120 mg/kg)、正清風(fēng)痛寧陽性對照組(80 mg/kg)。連續(xù)灌胃給藥5 d，每日1次，末次給藥后1 h，在每只小鼠右耳正反兩面均勻涂抹20 μL二甲苯致炎，左耳作為對照。致炎后50 min將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓剪下左右耳，用8 mm打孔器打下耳片，稱質(zhì)量，計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率。腫脹抑制率=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%。

2.2小鼠熱板實(shí)驗(yàn)[21]將健康昆明種雌性小鼠置于(55±0.5)℃熱板儀上，記錄小鼠舔足時(shí)間，凡舔足時(shí)間小于5 s或大于30 s以及喜跳躍的小鼠都舍棄，取兩次測量的平均值作為基礎(chǔ)痛閾值。分組同“2.1”項(xiàng)，每組8只，連續(xù)灌胃給藥5 d，每日1次，末次給藥后0.5、1、2、3、4 h分別測量小鼠痛閾值，凡舔足時(shí)間大于60 s，則按60 s 計(jì)算。

2.3醋酸誘導(dǎo)小鼠扭體實(shí)驗(yàn)[19,21]健康昆明種小鼠40只，雌雄各半，分組同“2.1”項(xiàng)，每組8只，連續(xù)灌胃給藥5 d，每日1次，末次給藥后1 h，分別腹腔注射0.6%醋酸溶液(10 mL/kg)，記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，與空白對照組比較，計(jì)算扭體抑制率。

2.4DNCB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)[22]取健康昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白對照組、DTH模型組、正丁醇提取組、乙酸乙酯提取組、石油醚提取組和正清風(fēng)痛寧陽性對照組。第1天給藥后每只小鼠腹部去毛，范圍約3 cm×3 cm，并將50 μL 1.0% DNCB丙酮麻油溶液均勻涂抹于腹部，空白對照組涂抹等容積丙酮麻油溶液，次日強(qiáng)化1次作為致敏。致敏6 d后，將1.0% DNCB丙酮麻油溶液10 μL均勻涂于各小鼠右耳(正反兩面)進(jìn)行致敏，左耳作為對照。致敏24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器打下直徑為8 mm的耳片，稱質(zhì)量，同時(shí)取小鼠脾和胸腺稱質(zhì)量。以左右耳片質(zhì)量差作為腫脹度。稱質(zhì)量后將右耳片保存在4%中性甲醛溶液中固定，采用常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，顯微鏡下觀察耳組織病理變化。

3結(jié)果

3.1牛膝不同提取部位對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響用二甲苯致炎后，各組小鼠右耳均出現(xiàn)明顯紅腫。各組小鼠耳腫脹度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(4,35)=317.22，P=0.000)。由表1可知，與空白對照組比較，正清風(fēng)痛寧組、正丁醇部位組和石油醚部位組小鼠耳腫脹度顯著減輕(P<0.05)，乙酸乙酯部位組小鼠耳腫脹度無明顯變化(P>0.05)。

表1　牛膝不同提取部位對二甲苯致

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與正丁醇部位組比較，#P<0.05。

3.2牛膝不同提取部位對小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響兩因素混合設(shè)計(jì)的不等距重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，被試內(nèi)因素(時(shí)間)對痛閾的主效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2.89,101.12)=159.95，P=0.000)，被試間因素(組別)對痛閾的主效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(4,35)=15.26，P=0.000)，時(shí)間和組別對痛閾的交互作用也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(11.56,101.12)=15.26，P=0.000)。由圖1可知，各組基礎(chǔ)痛閾(給藥后0.0 h痛閾)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；分別從給藥后1.0、1.5 h開始，正清風(fēng)痛寧組和正丁醇部位組痛閾顯著高于空白對照組(P<0.05)；正清風(fēng)痛寧組和正丁醇部位組痛閾在給藥后3.0 h上升至最大值(P<0.05)，給藥后4.0 h開始明顯降低(P<0.05)。

注：與同時(shí)點(diǎn)空白對照組比較，*P<0.05；與同組給藥后1.0 h比較，aP<0.05；與同組給藥后2.0 h比較，bP<0.05；與同組給藥后3.0 h比較，cP<0.05。

圖1牛膝不同提取部位對小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響

3.3牛膝不同提取部位對醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)的影響各組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(4,35)=67.59，P=0.000)。由表2可知，與空白對照組比較，正清風(fēng)痛寧組和正丁醇部位組小鼠扭體次數(shù)顯著降低(P<0.05)，乙酸乙酯部位組和石油醚部位組小鼠扭體次數(shù)無明顯變化(P>0.05)。

表2　牛膝不同提取部位對醋酸誘導(dǎo)的

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與正丁醇部位組比較，#P<0.05。

3.4牛膝不同提取部位對DNCB誘導(dǎo)的DTH的影響以空白對照組和DTH模型組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，DTH組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著升高(P<0.05)。以空白對照組以外的另5組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，5組小組耳腫脹度、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(耳腫脹度：F(4,35)=40.76，P=0.000；胸腺指數(shù)：F(4,35)=55.31，P=0.000；脾指數(shù)：F(4,35)=100.01，P=0.000)；與DTH模型組相比較，正清風(fēng)痛寧組和正丁醇部位組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，乙酸乙酯部位組耳腫脹度和胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)，石油醚部位組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均無明顯變化(P>0.05)。見表3。光鏡下觀察各組小鼠耳片組織的病理學(xué)變化，結(jié)果顯示：空白對照組小鼠耳組織表皮角質(zhì)化不明顯，炎性細(xì)胞浸潤較少；DTH模型組耳組織表皮角質(zhì)化明顯加厚，炎性細(xì)胞浸潤增多；正丁醇部位組和正清風(fēng)痛寧組小鼠耳組織病理變化明顯改善；乙酸乙酯部位組和石油醚部位組小鼠耳組織病理變化無明顯改善。見圖2。

表3　牛膝不同提取部位對DNCB

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與DTH模型組比較，#P<0.05。

注:A.空白對照組;B.DTH模型組;C.正丁醇部位組;D.乙酸乙酯部位組;E.石油醚部位組;F.正清風(fēng)痛寧組。

圖2牛膝不同提取部位對DTH小鼠耳片組織病理變化的影響(HE染色，10×20倍)

4討論

炎癥是機(jī)體活組織在各種損傷刺激下所表現(xiàn)的以防御為主的反應(yīng)[21]。二甲苯誘導(dǎo)的耳腫脹模型是最常見的急性炎癥模型，二甲苯能增加毛細(xì)血管壁的通透性，導(dǎo)致紅腫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇和石油醚提取部位能明顯抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，說明正丁醇和石油醚提取部位能降低血管壁的通透性，減輕腫脹度；乙酸乙酯部位基本無作用。研究表明在傷害性刺激作用下，組織釋放各種致痛因子，如H+、K+、組織胺、前列腺素，刺激痛受體，使游離神經(jīng)末梢產(chǎn)生痛覺傳入沖動(dòng)，沖動(dòng)傳至高級中樞引起痛覺。理論上，阻斷該過程的任一環(huán)節(jié)，均可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇部位明顯延長小鼠在熱板上舔足時(shí)間，明顯減少醋酸誘導(dǎo)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，提示其具有一定的鎮(zhèn)痛作用；乙酸乙酯和石油醚提取部位基本無作用。

DTH是依賴T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，其主要特征是致敏機(jī)體在抗原攻擊部位，出現(xiàn)遲發(fā)型炎性反應(yīng)。胸腺與脾臟是機(jī)體主要的免疫器官，其中脾臟是免疫細(xì)胞定居的場所，也是免疫應(yīng)答的場所；胸腺是T細(xì)胞發(fā)育的主要場所。機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)的同時(shí)，脾臟和胸腺腫大，其質(zhì)量增加，臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[23-25]。DNCB是一種半抗原，將其稀釋液涂抹腹壁皮膚后，與皮膚蛋白形成完全抗原，刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞[22]。4～7 d后再將其涂抹于耳部，使局部產(chǎn)生DTH，一般在抗原攻擊后24～48 h達(dá)高峰，此時(shí)測其腫脹度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇部位能顯著減輕小鼠耳腫脹度，降低胸腺指數(shù)及脾指數(shù)，提示其能抑制體內(nèi)的免疫反應(yīng)；乙酸乙酯部位能有效降低小鼠耳腫脹度及胸腺指數(shù)但對脾指數(shù)無明顯作用，提示其有一定的抑制體內(nèi)免疫反應(yīng)的作用，石油醚提取部位不能抑制DNCB誘導(dǎo)的DTH。

本研究顯示，牛膝的正丁醇部位的抗炎鎮(zhèn)痛及抑制DTH作用均明顯不及正清風(fēng)痛寧，說明中藥復(fù)方的作用有一定的優(yōu)勢。今后應(yīng)優(yōu)化提取工藝，以挖掘牛膝抗炎鎮(zhèn)痛有效部位中活性更強(qiáng)的單體或組合物，深入探究其抗炎鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制，進(jìn)一步嘗試與現(xiàn)有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物聯(lián)用，充分發(fā)揮其“引諸藥下行”的作用，提高抗炎藥物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變組織中的藥物濃度。

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Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Different Extracts ofAchyranthisBidentataeRadix and Their Effects against Delayed-type Hypersensitivity

WANGRong,SHENChen,WUHong,WANGWei,SUNLiang-liang,LIShu-ping

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory and analgesic effects of different extracts of Achyranthis Bidentatae Radix and their effects against delayed-type hypersensitivity (DTH). MethodsThe dimethylbenzene-induced mouse ear-swelling test, hot plate test, and acetic acid-induced mouse writhing test were performed to observe the anti-inflammatory and analgesic effects of different extracts of Achyranthis Bidentatae Radix. The 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) was used to induce DTH in mice, and the effects of different extracts of Achyranthis Bidentatae Radix against DTH were examined.ResultsThe n-butyl alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix significantly reduced the ear swelling induced by dimethylbenzene (P<0.05), significantly prolonged the licking time on hot plate and reduced the times of writhing induced by acetic acid (P<0.05), and significantly reduced ear swelling, thymus index, and spleen index in mice with DNCB-induced DTH (P<0.05). The petroleum ether and ethyl acetate extracts of Achyranthis Bidentatae Radix significantly inhibited some indices of the inflammation induced by dimethylbenzene, the pain induced by hot plate and acetic acid, and DNCB-induced DTH (P<0.05). ConclusionThe n-butyl alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix has significant anti-inflammatory, analgesic, and anti-DTH effects.

[Key words]Achyranthis Bidentatae Radix; Extract; Anti-inflammatory; Analgesic; Delayed-type hypersensitivity

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473400，81073122)；安徽中醫(yī)藥大學(xué)青年研究基金項(xiàng)目(2015qn014)

作者簡介：汪蓉(1991-)，女，碩士研究生

通信作者：吳虹，hongw@aliyun.com

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.023

(收稿日期：2015-09-16；編輯：姚實(shí)林)