張江寧，丁衛(wèi)英，楊　春

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原　030006）

?

發(fā)酵條件對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀的影響

張江寧，丁衛(wèi)英，楊春

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030006）

摘要：試驗(yàn)從紅曲霉固態(tài)發(fā)酵條件入手，通過(guò)選擇不同碳源和氮源，研究其對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響，最終確定以葡萄糖和蛋白胨作為輔助碳源和氮源，此時(shí)洛伐他汀產(chǎn)量最高。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵條件；紅曲霉；洛伐他汀

0　引言

紅曲在我國(guó)有著悠久的歷史，主要應(yīng)用于發(fā)酵食品、色素等方面。近年來(lái)，紅曲霉的次級(jí)代謝物洛伐他汀成為研究的熱點(diǎn)，它是一種膽固醇合成抑制劑，能有效地抑制膽固醇生物合成過(guò)程中關(guān)鍵酶HMG- Co還原酶的活性［1］。洛伐他汀產(chǎn)量受培養(yǎng)基［2］和培養(yǎng)條件的影響很大，在條件不適時(shí)產(chǎn)量極微，甚至不產(chǎn)生。因此，本試驗(yàn)從紅曲霉固態(tài)發(fā)酵條件入手，通過(guò)選擇不同碳源和氮源，研究其對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響，為科學(xué)利用紅曲霉提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

菌種，安卡紅曲取自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2儀器和試劑

SW- CJ- 2G型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；GMSX- 280型高壓滅菌鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；甲醇（色譜純），天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品；95%乙醇（分析純），萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠產(chǎn)品。

洛伐他汀，配置成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；乙醇提取液（75%）的配制為25 mL蒸餾水中加入無(wú)水乙醇75 mL，混勻；中性氧化鋁預(yù)處理柱用中性氧化鋁置于130℃烘箱中烘烤4 h，使用前稱(chēng)5 g裝柱（玻璃柱），用10 mL甲醇活化。

1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用土豆培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)基（g/L）為葡萄糖60 g，蛋白胨20 g，NaNO310 g，MgSO4·7H2O 5 g，KH2PO410 g，121℃滅菌20 min［3］；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：大米經(jīng)清洗，放置于水中浸泡15 h后取出，蒸煮至大米顆粒分散、微黏狀態(tài)。蒸煮后的大米置于塑料發(fā)酵培養(yǎng)瓶中，于121℃，0.1 MPa的滅菌鍋內(nèi)滅菌30 min。

1.4培養(yǎng)方法

（1）試管斜面菌種培養(yǎng)。挑取1環(huán)貯藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，于31℃恒溫箱中擴(kuò)大培養(yǎng)1周，置于4～5℃冰箱中貯藏備用。

（2）孢子懸液的制備。斜面種子試管加無(wú)菌生理鹽水，將孢子刮下置于三角瓶中。以轉(zhuǎn)速200 r/min在搖床上放置0.5～1.0 h，觀察孢子狀態(tài)，孢子完全活化分散開(kāi)后，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾孢子液，濾液即為單孢子懸液，最后將孢子稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1× 106～1×107個(gè)/ mL。

（3）固態(tài)發(fā)酵。將三角瓶中的孢子懸液按照一定的接種量接種，于裝有50 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL培養(yǎng)容器中，于30℃恒溫培養(yǎng)20 d［4］。

1.5洛伐他汀含量測(cè)定方法［5］

1.5.1色譜條件

色譜柱采用Phenomenex kromasil 5U 100A C18型，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相為甲醇+水（90+ 10），流速1.0 mm/min，壓力140 Bar，波長(zhǎng)237 nm，保留時(shí)間5～6 min，進(jìn)樣體積10 μL；該方法檢出最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg/kg。

1.5.2測(cè)定步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制。用洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液200mg/L逐級(jí)配制0，0.04，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列。

（2）樣品處理及測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取混勻樣品1.0 g 于25 mL容量瓶或試管中，加入乙醇提取液15 mL左右（平行做3份），超聲波提取30 min，補(bǔ)加提取液至刻度，收集濾液。準(zhǔn)確吸取濾液5.0 mL，通過(guò)預(yù)先活化好的中型氧化鋁小柱，用9.0 mL甲醇（3.0，3.0，3.0 mL分3次）洗脫。收集洗脫液定容10.0 mL，用高效液相色譜測(cè)定。通過(guò)被測(cè)樣品液組分與標(biāo)準(zhǔn)液保留時(shí)間對(duì)比進(jìn)行定性，利用被測(cè)樣品液組分的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)液峰面積對(duì)比進(jìn)行定量。

（3）結(jié)果計(jì)算。

1.6培養(yǎng)條件對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

1.6.1碳源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

分別添加5%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油［6］、玉米粉為附加碳源，按照固態(tài)發(fā)酵方法進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過(guò)1.5中的檢測(cè)方法檢測(cè)洛伐他汀的含量。

1.6.2氮源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

分別添加2%的有機(jī)氮源大豆粉［7］、蛋白胨［8］、酵母膏，以及無(wú)機(jī)氮源NaNO3［9］，NH4NO3，NH4Cl為附加氮源。

2　結(jié)論

2.1碳源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

碳源是紅曲霉生長(zhǎng)代謝重要的物質(zhì)之一，提供菌體代謝所需要的能量，同時(shí)也是構(gòu)成菌體細(xì)胞及各種代謝產(chǎn)物的主要成分。

碳源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作為附加碳源時(shí)都能不同程度的增加，其中葡萄糖作為附加碳源時(shí)洛伐他汀的產(chǎn)量最高，達(dá)到13.6 mg/g，有顯著差異，因此葡萄糖是該菌株固態(tài)發(fā)酵的最適碳源。

2.2氮源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

圖1　碳源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

氮在微生物的生長(zhǎng)代謝中具有重要的作用，因?yàn)榈厥菢?gòu)成微生物細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的重要成分。因此，在微生物生長(zhǎng)過(guò)程和代謝產(chǎn)物的合成過(guò)程中，氮源也是必須的。以固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)洛伐他汀的含量，以蛋白胨為附加氮源洛伐他汀的產(chǎn)量最高，與其他幾種氮源相比差異比較明顯。大豆粉與酵母膏之間差異不顯著，NaNO3與NH4Cl之間差異也不顯著，總體來(lái)講有機(jī)氮源洛伐他汀產(chǎn)量大于無(wú)機(jī)氮源，因此選擇影響最大的蛋白胨作為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的氮源。

氮源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2　氮源種類(lèi)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)洛伐他汀固態(tài)發(fā)酵條件的分析，確定了分別以葡萄糖和蛋白胨作為發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的輔助碳源和氮源，此外還有一些其他因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物也有著不可忽視的影響。例如，接種量大小、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)紅曲中的洛伐他汀含量達(dá)到較高值時(shí)，其中的毒害物質(zhì)桔霉素含量的高低也是應(yīng)關(guān)注的關(guān)鍵點(diǎn)，在以后的工作中有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］沈平，伍軍，李浩然，等.紅曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（3）：47-79.

［2］童愛(ài)均，呂旭聰，劉曉艷，等.固體發(fā)酵基質(zhì)和外加碳氮源對(duì)紅曲霉色素產(chǎn)量的影響［J］.中國(guó)調(diào)味品，2015（5）：5-10.

［3］陳勉華，吉達(dá)維，馬人杰，等.不同發(fā)酵基質(zhì)對(duì)紅曲重要代謝產(chǎn)物的影響［J］.中國(guó)釀造，2013（3）：22-24.

［4］許贛榮，陳曄，陳蘊(yùn)，等.無(wú)桔霉素高比例開(kāi)環(huán)式莫納可林K紅曲產(chǎn)品的生產(chǎn)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004（10）：59-63.

［5］羅仁才，孫開(kāi)奇，謝申猛，等.紅曲中洛伐他汀總量的測(cè)定方法［J］.衛(wèi)生研究，2003（2）：157-158.

［6］Miyake T，Uchitomi K，Zhang M Y，et al. Effects of the principal nutrients on lovastatin production by monascus pilosus［J］. Biosci Biotechnol Biochem，2006，70（5）：1 154-1 159.

［7］熊曉輝，張李陽(yáng)，韋策，等.紅曲霉菌產(chǎn)Monacolin K固體發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（1）：9-13.

［8］董永勝，劉同軍，賈士儒，等.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K工藝條件的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007（6）：27-30.

［9］童振字，周立平，陳旭峰.響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉菌株Monascus purpureus WX液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K工藝條件［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（1）：35-40.

Effects of Fermentation Conditions of Monascus Lovastin Production

ZHANG Jiangning，DING Weiying，YANG Chun
（Agricaltural Products Processing Research Insitute，Shanxi Acadeing of Agricultural Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Abstract：In this experiment，the operational factors on lovastatin in yield by solid- state fermentation are studied，the result show that the optimum conditions is glucose and peptone as additive carbon source and nitrogen source.

Key words：fermentation；monascus；lovastatin

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ463

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.014

文章編號(hào)：1671- 9646（2016）05a- 0050- 02

收稿日期：2016- 01- 30

基金項(xiàng)目：山西省青年科技研究基金項(xiàng)目（2015021144）。

作者簡(jiǎn)介：張江寧（1981—），女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。