陳　娟，王一超，崔　蓉△，劉曉曉，張寶旭

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 1. 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，2. 毒理學(xué)系，北京　100191)

·論著·

1,3-二苯-1,3-丙二酮對(duì)可卡因致小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的影響

陳娟1，王一超1，崔蓉1△，劉曉曉2，張寶旭2

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 1. 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，2. 毒理學(xué)系，北京100191)

[摘要]目的：探討1,3-二苯-1,3-丙二酮(1,3-diphenyl-1,3-propanedione，DPPD)對(duì)可卡因所致小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的影響。方法： 36只雄性健康的ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、可卡因組、3個(gè)DPPD預(yù)給藥組(200、400、800 mg/kg)和DPPD單獨(dú)給藥組(800 mg/kg)。對(duì)照組灌胃給予1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫3 d；可卡因組灌胃給予1%吐溫2 d，第3天皮下注射可卡因；3個(gè)DPPD預(yù)給藥組小鼠分別灌胃給藥(DPPD 200、400、800 mg/kg)3 d，第3天給藥30 min后皮下注射可卡因；DPPD單獨(dú)給藥組用DPPD 800 mg/kg灌胃給藥3 d。給予可卡因20 min后處死小鼠，采用高效液相色譜法-熒光檢測(cè)器檢測(cè)小鼠腦組織中多巴胺(dopamine，DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)的含量，采用高效液相色譜法-紫外檢測(cè)器檢測(cè)小鼠腦組織中谷氨酸(glutamic acid，Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的含量，比較各組間神經(jīng)遞質(zhì)的水平。結(jié)果： 與對(duì)照組相比，可卡因組小鼠腦中DA和GABA含量明顯升高(P<0.01和P<0.05)，Glu含量顯著降低(P<0.05)。與可卡因組相比，DPPD預(yù)給藥組(200、400、800 mg/kg)小鼠腦中DA含量明顯下降(P<0.01)，DPPD預(yù)給藥200 mg/kg組小鼠腦中GABA含量明顯下降(P<0.05)。DPPD預(yù)給藥200 mg/kg組小鼠腦中DA、5-HT、Glu和GABA含量與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論： 低劑量DPPD可逆轉(zhuǎn)可卡因致小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變。

[關(guān)鍵詞]1,3-二苯-1,3-丙二酮；可卡因；神經(jīng)遞質(zhì)；小鼠；色譜法，高壓液相

可卡因是強(qiáng)天然中樞神經(jīng)興奮劑，因其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮作用而易導(dǎo)致成癮和濫用?？煽ㄒ蜃饔糜谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)可影響多種神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，導(dǎo)致其功能紊亂，影響的神經(jīng)遞質(zhì)主要包括多巴胺(dopamine，DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)、去甲腎上腺素、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和膽堿能遞質(zhì)系統(tǒng)等[1-5]。

1,3-二苯-1,3-丙二酮(1,3-diphenyl-1,3-propanedione, DPPD)是從甘草中提取的成分，是姜黃素的β-二酮類似物。多項(xiàng)研究顯示，DPPD對(duì)前列腺癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌、白血病等多種腫瘤具有抑制作用[6-9]，對(duì)二甲基甲酰胺、對(duì)乙酰氨基酚、四氯化碳、可卡因引起的小鼠化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[10-13]。研究表明DPPD可通過(guò)抗氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)保護(hù)多巴胺神經(jīng)元[14]，可明顯減弱可卡因誘發(fā)的小鼠自主活動(dòng)量的增加[13]，提示DPPD對(duì)可卡因所致的小鼠神經(jīng)毒性具有拮抗作用。此前的研究已證實(shí)DPPD可通過(guò)小鼠血腦屏障[15]，表明DPPD可到達(dá)小鼠腦組織并有可能發(fā)揮相關(guān)的生理作用。本研究檢測(cè)不同處理組小鼠腦組織中單胺類(DA和5-HT)和氨基酸類(Glu和GABA)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，旨在探討DPPD對(duì)可卡因所致小鼠腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的影響。

1 材料與方法

1.1儀器

Waters高效液相色譜儀包括Waters 1525 Binary HPLC Pump、Waters 717 puls Autosampler、Waters 2475 Multi λ Fluorescence Detector(用于DA和5-HT的檢測(cè))和Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector(用于Glu和GABA的檢測(cè))。其他儀器有4 ℃高速離心機(jī)(Thermo scientific)、XW-80A旋渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)、D-130型手持式超細(xì)勻漿器(德國(guó)Wiggens公司)和恒溫水浴鍋(精科華瑞儀器有限公司)。

1.2試劑

主要試劑有多巴胺鹽酸鹽、5-羥色胺鹽酸鹽(Sigma-Aldrich公司)，Glu、GABA(純度99%，J & K科技有限公司)，DPPD(純度99%，德國(guó)Merck公司)，鹽酸可卡因(青海制藥廠)，2,4-二硝基氟苯(純度99.0%，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)，乙二胺四乙酸二鈉、無(wú)水乙酸鈉、鹽酸(分析純，北京化工廠)，冰醋酸(純度≥99.5%)、碳酸氫鈉(純度≥99.8%，北京化工廠)，乙腈、甲醇(純度≥99.9%，美國(guó)Honeywell B & J公司)，高氯酸(分析純，天津市東方化工廠)，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水(電阻率18 MΩ·cm)。

1.3DA和5-HT測(cè)定的色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry?C18柱(150 mm×3.9 mm，5 μm)；保護(hù)柱：Waters Symmetry?C18柱(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaAc(含0.1 mmol/L Na2EDTA)-甲醇(體積比95 ∶5，pH=6.0)；流速：0.8 mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：280 nm；熒光波長(zhǎng)：330 nm；室溫：24 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[16]。DA和5-HT的加標(biāo)回收率分別為95.2%～100.4%和82.4%～100.6%。DA的日內(nèi)和日間精密度分別為2.6%～9.0%和1.8%～8.7%，5-HT的日內(nèi)和日間精密度分別為2.1%～6.2%和2.2%～10.7%。

1.4Glu和GABA測(cè)定的色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry?C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保護(hù)柱：Waters Symmetry?C18(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流動(dòng)相：30 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 5.6)-乙腈(體積比3 ∶1)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：24 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[17]。Glu和GABA的加標(biāo)回收率分別為91.5%～98.7%和94.0%～97.7%。Glu的日內(nèi)和日間精密度分別為2.8%～7.2%和3.1%～8.2%，GABA的日內(nèi)和日間精密度分別為2.6%～6.0%和2.5%～5.6%。

1.5動(dòng)物分組及處理

雄性健康的ICR小鼠36只，SPF級(jí)，體重18～20 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠放在塑料籠中，自由采食，適應(yīng)48 h后稱重，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、可卡因組、3個(gè)DPPD預(yù)給藥組和DPPD單獨(dú)給藥組，每組6只。對(duì)照組灌胃給予1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫3 d；可卡因組灌胃給予1%吐溫2 d，第3天皮下注射可卡因80 mg/kg；3個(gè)DPPD預(yù)給藥組分別灌胃給藥DPPD 200、400和800 mg/kg，3 d，第3天分別給藥30 min后皮下注射可卡因80 mg/kg；DPPD單獨(dú)給藥組灌胃給予DPPD 800 mg/kg，3 d?？煽ㄒ蚪M和3個(gè)DPPD預(yù)給藥組的小鼠給予可卡因20 min后處死。

1.6樣品處理

在冰面上迅速取出小鼠腦組織，用生理鹽水洗凈表面的血液后，用濾紙吸干后稱重，-80 ℃保存。測(cè)定前，稱取腦組織，按照1 ∶5比例(重量/體積比)加入0.1 mol/L高氯酸溶液，冰浴勻漿。勻漿液渦旋1 min，混勻后置于4 ℃高速離心機(jī)中14 000 r/min離心30 min，取上清液分成兩份，一份經(jīng)0.22 μm PES聚醚砜過(guò)濾器過(guò)濾后，采用高效液相色譜法-熒光檢測(cè)器檢測(cè)小鼠腦組織中DA和5-HT的含量[16]；另一份取上清液100 μL，加入1%(體積分?jǐn)?shù))2,4-二硝基氟苯50 μL及0.5 mol/L碳酸氫鈉100 μL，85 ℃水浴衍生30 min，用流動(dòng)相定容至10 mL，采用高效液相色譜法-紫外檢測(cè)器檢測(cè)小鼠腦組織中Glu和GABA的含量[17]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1DPPD對(duì)小鼠腦組織中DA和5-HT含量的影響

如圖1A所示，與對(duì)照組相比，可卡因組小鼠腦組織中DA含量顯著升高(P<0.01)；與可卡因組相比，3個(gè)DPPD預(yù)給藥組(200、400、800 mg/kg)及DPPD單獨(dú)給藥組(800 mg/kg)小鼠腦中DA含量明顯下降(P<0.01)，且DPPD預(yù)給藥組(200、800 mg/kg)及DPPD單獨(dú)給藥組小鼠腦中DA含量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，DPPD預(yù)給藥400 mg/kg組和800 mg/kg組小鼠腦中5-HT含量明顯升高(P<0.01和P<0.05，圖1B)；可卡因組、DPPD預(yù)給藥200 mg/kg組及DPPD單獨(dú)給藥組小鼠腦中5-HT含量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2DPPD對(duì)小鼠腦組織中Glu和GABA含量的影響

如圖1C所示，與對(duì)照組相比，可卡因組(P<0.05)、DPPD預(yù)給藥400 mg/kg和800 mg/kg組及DPPD單獨(dú)給藥組小鼠腦組織中Glu含量明顯下降(P<0.01)。可卡因組、DPPD預(yù)給藥400 mg/kg組(P<0.05)和DPPD預(yù)給藥800 mg/kg組(P<0.01)小鼠腦中GABA含量明顯高于對(duì)照組(圖1D)。與可卡因組相比，DPPD預(yù)給藥400 mg/kg組(P<0.05)、DPPD預(yù)給藥800 mg/kg組及DPPD單獨(dú)給藥組小鼠腦中Glu含量明顯下降(P<0.01)；DPPD預(yù)給藥200 mg/kg組小鼠腦中GABA含量明顯下降(P<0.05)。

*P<0.05, **P<0.01, compared with control group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with cocaine group. n=6, but one mouse died in DPPD pretreatment 400 mg/kg group and DPPD group (n=5). DA, dopamine; 5-HT, 5-hydroxytryptamin; Glu, glutamic acid; GABA, γ-aminobutyric acid; DPPD, 1,3-diphenyl-1,3-propanedione. 圖1　DPPD對(duì)可卡因致小鼠腦組織中DA、5-HT、Glu、GABA含量變化的影響Figure 1　Effects of DPPD on DA, 5-HT, Glu, and GABA contents of brain in mice administered with cocaine

3討論

可卡因是強(qiáng)天然中樞神經(jīng)興奮劑，目前認(rèn)為可卡因發(fā)揮強(qiáng)化效應(yīng)最主要的機(jī)制是通過(guò)抑制DA再攝取?？煽ㄒ蚺c多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transpor-ter，DAT)結(jié)合，阻斷DAT把DA由突觸間隙轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致DA在突觸間隙的異常積累，持續(xù)作用于突觸后體而讓使用者產(chǎn)生欣快感[18]。Liu等[19]報(bào)道急性注射可卡因30 mg/kg可分別增加大鼠紋狀體和伏核中DA水平23.6%和25.1%。另一項(xiàng)研究結(jié)果也顯示可卡因急性給藥后可增加大鼠紋狀體中DA的濃度[20]。本研究中，與對(duì)照組相比，可卡因組小鼠腦組織中DA含量顯著升高，而3個(gè)DPPD預(yù)給藥組及DPPD單獨(dú)給藥組小鼠腦中DA含量與可卡因組相比均明顯下降，提示DPPD可逆轉(zhuǎn)可卡因所致小鼠腦組織中DA含量的升高。

有研究表明除了抑制DA的再攝取，可卡因還可抑制5-HT的再攝取，增加其在突觸間隙的水平[2]。可卡因急性給藥后可增加小鼠或大鼠中不同腦區(qū)5-HT的水平[21-22]，但也有研究顯示可卡因給藥后，大鼠腦中DA水平顯著增加，而5-HT水平無(wú)明顯變化[23]。本研究中，可卡因組、DPPD 200 mg/kg預(yù)給藥組與對(duì)照組間5-HT水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中、高劑量DPPD預(yù)給藥組的5-HT水平明顯高于對(duì)照組，提示DPPD有可能影響小鼠腦中5-HT水平。

研究顯示Glu可能通過(guò)改變神經(jīng)元可塑性、產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶而參與藥物的成癮過(guò)程[3]。GABA可調(diào)節(jié)可卡因引起的行為反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)多巴胺受體間接發(fā)揮作用[5]。可卡因給藥后對(duì)Glu和GABA含量的影響不同研究所得結(jié)論不完全一致。有研究發(fā)現(xiàn)可卡因急性給藥可增加大鼠不同腦區(qū)中Glu水平[24-26]，但也有研究表明急性或慢性可卡因給藥并不會(huì)改變大鼠紋狀體中Glu水平[19]。Wydra等[27]發(fā)現(xiàn)可卡因給藥后大鼠腦中DA水平顯著增高，而腹側(cè)蒼白球區(qū)中Glu水平?jīng)]有變化，GABA水平顯著降低。Miguéns等[28]則發(fā)現(xiàn)可卡因給藥可顯著增加大鼠伏隔核中GABA水平。本研究中，可卡因組Glu水平明顯低于對(duì)照組，GABA水平明顯增高；低劑量DPPD預(yù)給藥組GABA水平明顯降低，中、高劑量DPPD預(yù)給藥組Glu水平明顯低于對(duì)照組和可卡因組，而GABA水平明顯高于對(duì)照組；DPPD單獨(dú)給藥組Glu水平明顯低于對(duì)照組和可卡因組，提示DPPD對(duì)Glu和GABA含量均有一定的影響。

本研究是在已有研究[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，該研究結(jié)果提示DPPD對(duì)可卡因所致的小鼠神經(jīng)毒性具有拮抗作用?？煽ㄒ虻淖饔脵C(jī)制目前尚未完全明了，但很多研究證實(shí)可卡因可影響多種神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。本研究選擇了與可卡因相關(guān)的4種神經(jīng)遞質(zhì)(DA、5-HT、Glu和GABA)進(jìn)行測(cè)定，旨在了解DPPD是否有可能拮抗可卡因所致小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，為DPPD作為可能的可卡因治療藥物提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究中3個(gè)DPPD預(yù)給藥組的劑量與文獻(xiàn)[13]中報(bào)道的一致，同時(shí)，參考文獻(xiàn)[13]中可卡因的給藥劑量，預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇的可卡因劑量分別為50 mg/kg和80 mg/kg，每個(gè)劑量組小鼠3只，預(yù)實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，正式實(shí)驗(yàn)中可卡因劑量確定為80 mg/kg。為了解DPPD自身對(duì)小鼠腦區(qū)4種神經(jīng)遞質(zhì)的含量是否有影響，本研究安排了DPPD單獨(dú)給藥組與可卡因組和DPPD預(yù)給藥組同時(shí)實(shí)驗(yàn)。由于實(shí)驗(yàn)中只考察了高劑量DPPD單獨(dú)給藥對(duì)小鼠4種神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，所以無(wú)法確定中、低劑量DPPD單獨(dú)給藥時(shí)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量產(chǎn)生的影響。

本研究以小鼠全腦組織為樣本，未測(cè)定不同處理組小鼠不同腦區(qū)4種神經(jīng)遞質(zhì)的含量，且樣本量較少，同時(shí)，采取單一時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，無(wú)法反映4種神經(jīng)遞質(zhì)含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，這是本研究的局限性，但本研究測(cè)定的4種神經(jīng)遞質(zhì)均取自同一只小鼠腦組織，可綜合反映可卡因及DPPD對(duì)4種神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，DPPD對(duì)4種神經(jīng)遞質(zhì)含量均有一定的影響，且低劑量DPPD可很好地逆轉(zhuǎn)可卡因?qū)A、Glu和GABA含量變化的影響。研究結(jié)果中，DPPD中、高劑量組所得結(jié)果與低劑量組不完全一致，其原因可能與樣本量較少有關(guān)，也可能和DPPD與可卡因間復(fù)雜的相互作用有關(guān)。我們猜測(cè)DPPD對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響可能有著與可卡因相類似的作用，DPPD可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與靶點(diǎn)結(jié)合抑制了可卡因的作用?？傊?，DPPD與神經(jīng)遞質(zhì)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系及劑量-效應(yīng)關(guān)系均有待進(jìn)一步的深入研究。

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(2016-02-02 收稿)

(本文編輯：任英慧)

Effects of 1,3-diphenyl-1,3-propanedione on neurotransmitter contents of brain in mice administered with cocaine

CHEN Juan1, WANG Yi-chao1, CUI Rong1△, LIU Xiao-xiao2, ZHANG Bao-xu2

(1. Department of Occupational and Environmental Health Sciences, 2. Department of Toxicology, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China)

ABSTRACTObjective：To investigate the possible reversal effects of 1,3-diphenyl-1,3-propanedione (DPPD) for cocaine-induced content changes of neurotransmitters of brain in mice. Methods: In this study, 36 healthy ICR male mice were randomly divided into control group, cocaine group, three DPPD pretreatment groups (200, 400, and 800 mg/kg) and DPPD alone group (800 mg/kg). The mice in control group were administered intragastrically with 1% Tween 80 for 3 d, and the mice in cocaine group were administered intragastrically with 1% Tween 80 for 2 d before cocaine was injected subcutaneously on the 3rd day. The mice in the three DPPD pretreatment groups were administered intragastrically (DPPD 200, 400, and 800 mg/kg) for 3 d before cocaine was injected subcutaneously 30 min after the administration on the 3rd day. The mice in DPPD alone group were administered intragastrically with DPPD at dose of 800 mg/kg for 3 d. The mice were sacrificed 20 minutes after cocaine injection. The contents of dopamine (DA) and 5-hydroxytryptamin (5-HT) in the mice brain were determined by high performance liquid chromatography (HPLC)-fluorescence detector, the contents of glutamic acid (Glu) and γ-aminobutyric acid (GABA) in the mice brain were determined by HPLC-ultraviolet detector, and the neurotransmitter levels were compared between the groups. Results: The results showed that as compared with the control group, DA and GABA contents in cocaine group increased significantly (P<0.01 and P<0.05), while Glu content decreased (P<0.05). As compared with cocaine group, the DA levels in the three DPPD pretreatment groups (200, 400, and 800 mg/kg) all decreased significantly (P<0.01). In DPPD 200 mg/kg pre-administration group, GABA content decreased (P<0.05), and the contents of the four kinds of neurotransmitters had no statistical differences with those of the control group. Conclusion: DPPD may have potential reversal effects of the content changes of neurotransmitters in mice brain induced by cocaine at a lower dose.

KEY WORDS1,3-Diphenyl-1,3-propanedione; Cocaine; Neurotransmitter; Mice; Chromatography, high pressure liquid

[中圖分類號(hào)]R996.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-167X(2016)03-0398-05

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.004

△ Corresponding author’s e-mail, cuirong19@sohu.com

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