王　超,孫春曉,喬洪金**,叢　超,3,王際英,張利民

(1.青島大學生命科學學院，山東青島　266071；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東煙臺　264006；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上?！?01306)

不同營養(yǎng)方式下小球藻生長與光合作用的變化*

王超1,孫春曉2,喬洪金2**,叢超2,3,王際英2,張利民2

(1.青島大學生命科學學院，山東青島266071；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東煙臺264006；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306)

摘要：【目的】研究小球藻在自養(yǎng)條件下和以乙酸為碳源的異養(yǎng)、混養(yǎng)條件下生長以及光合作用的變化?！痉椒ā恳孕∏蛟錍hlorella sorokiniana為研究對象，通過測定OD550和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)葉綠素熒光研究其生長情況和光合作用的變化?！窘Y(jié)果】小球藻在初始接種濃度為5×106個/mL的條件下，異養(yǎng)和混養(yǎng)的生長速度顯著快于自養(yǎng)，到達穩(wěn)定期僅需1.5 d，而自養(yǎng)生長需要9 d；葉綠素熒光參數(shù)自養(yǎng)大于混養(yǎng)，而混養(yǎng)又大于異養(yǎng)，有效光量子產(chǎn)量混養(yǎng)比自養(yǎng)降低21.5%，異養(yǎng)比自養(yǎng)降低98.1%；混養(yǎng)的Rubisco酶基因mRNA表達量最高，分別是異養(yǎng)和自養(yǎng)的3.2倍和1.8倍?！窘Y(jié)論】小球藻在混養(yǎng)條件下光系統(tǒng)僅受到微弱抑制，生長速度和最高細胞密度均高于其它營養(yǎng)方式，適合規(guī)?；囵B(yǎng)。

關(guān)鍵詞：小球藻自養(yǎng)異養(yǎng)混養(yǎng)光合作用

0引言

【研究意義】小球藻是一種可進行多種營養(yǎng)方式的單細胞綠藻，其營養(yǎng)方式主要分為3種：一是利用光能和CO2進行光合自養(yǎng)生長；二是在黑暗條件下利用有機碳源和O2進行異養(yǎng)生長，類似于微生物的發(fā)酵作用[1-2]；三是在光照條件下利用有機碳源進行混養(yǎng)生長，光合作用和發(fā)酵作用同時進行[3-4]。由于營養(yǎng)方式多樣，生長快，光合效率高，且富含蛋白、脂肪和多糖等物質(zhì)，小球藻在光合作用機理研究[5-6]，抗生素與抗腫瘤等藥物的開發(fā)[7-8]，食品和水產(chǎn)飼料[8-9]，高密度規(guī)?；囵B(yǎng)與生物柴油煉制[10-12]，以及污水處理[13-14]等方面都有應(yīng)用。【前人研究進展】乙酸是一種很多種類的微藻都可以利用的碳源，可顯著促進微藻在異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下快速生長。早在1960年，Pringsheim等[15]就報道乙酸能引起衣藻的不正常光合作用，并微弱地抑制小球藻的光合活性。接著，Eppley等[16]在衣藻中發(fā)現(xiàn)光合作用產(chǎn)生的ATP和還原力被直接用于同化乙酸。此后，許多學者以衣藻作為材料對乙酸的效應(yīng)進行研究。一方面，乙酸抑制衣藻光反應(yīng)及其相關(guān)過程：減少氧氣釋放[17]，抑制光捕獲蛋白的表達[18]；另一方面，乙酸降低衣藻暗反應(yīng)的相關(guān)活性：降低碳酸酐酶活性[19]，抑制Rubisco酶的表達[20]和光合固碳[17]?！颈狙芯壳腥朦c】盡管在20世紀60年代乙酸被成功地應(yīng)用于研究小球藻的乙醛酸循環(huán)[21-23]，但是之后有關(guān)此方面的研究報道很少。隨著小球藻規(guī)?；a(chǎn)的開展，需進一步研究小球藻在乙酸條件下的光合營養(yǎng)機制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以小球藻為材料，研究其在添加乙酸的條件下，自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下的生長變化，以及光合作用光反應(yīng)和暗反應(yīng)的變化，旨在為小球藻的異養(yǎng)和混養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)條件

所用小球藻藻種(Chlorella sorokiniana)由中國科學院海洋研究所饋贈。細胞培養(yǎng)在光照恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，溫度30℃，由冷熒光燈管提供的光照強度為80 μmol ·m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h。自養(yǎng)(AT)培養(yǎng)采用BBM培養(yǎng)基[24]，異養(yǎng)(HT)和混養(yǎng)(MT)培養(yǎng)則采用BBM培養(yǎng)基加上30 mmol/L的乙酸鈉，初始接種濃度為5×106個/mL，其中異養(yǎng)培養(yǎng)瓶以黑色塑料布包裹避光，每種處理均重復(fù)3次。

1.2細胞生長的測定

微藻的生長通過在紫外分光光度計上(Shimadzu UV-1800，日本)測量550 nm處吸光度的變化來反映。同時用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，得到細胞個數(shù)與OD550的標準曲線，根據(jù)OD550值就可以轉(zhuǎn)換出每毫升細胞數(shù)。自養(yǎng)培養(yǎng)每天取樣一次，異養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)每隔半天取樣一次。

1.3光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)葉綠素熒光的測定

使用具有調(diào)制熒光技術(shù)的Imaging-PAM系統(tǒng)(Heinz Walz，德國)測量PSⅡ的原位葉綠素熒光，該系統(tǒng)連接到一臺安裝有視窗軟件的PC獲取數(shù)據(jù)。使用慢速動力學程序自動誘導葉綠素熒光。分別取自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下對數(shù)生長期中期的藻液，首先暗適應(yīng)15 min，然后使用飽和脈沖激發(fā)藻液，立即測量最小(F0)和最大(Fm)熒光值，計算出PSⅡ的最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。然后，光化光被打開，藻液開始光合作用，光照樣品的最大熒光值(Fm′)被記錄。PSⅡ的有效光化學量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)、相對電子傳遞速率rETR，非光化學淬滅NPQ按照下列公式計算：

Y(Ⅱ) = (Fm′-F)/Fm′,

(1)

rETR=Y(Ⅱ)·PAR·0.84·0.5,

(2)

NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′。

(3)

其中,PAR是光合有效輻射，0.84是植物的經(jīng)驗性吸光系數(shù)，0.5是假設(shè)植物吸收的光能被兩個光系統(tǒng)均分。

1.4Rubisco酶mRNA表達量的測定

分別取自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下對數(shù)生長期中期的藻液，離心收集后采用Trizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用定量PCR,設(shè)計引物擴增Rubisco大亞基上的片段(正向引物：5′-CAGCGGTAGCGGCAGAATC-3′；反向引物：5′-CTTCACCAGGAACAGGCTCG-3′)和內(nèi)參基因18S rRNA上的片段(正向引物：5′-CTGAGAAACGGCTACCACATC-3′；反向引物：5′-CCCCACCCGAAATCCAAC-3′)，PCR體系包含：10 μmol·L-1正向和反向引物各0.5 μL、無菌雙蒸水10.5 μL和PCR mix (SYBR Green Realtime PCR Master Mix，大連寶生物公司) 12.5 μL，待測樣品cDNA 1 μL，每個樣品重復(fù)3次。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，60℃退火延伸1 min，35個循環(huán)，然后進行55～95℃的熔解曲線分析，熒光波長為490 nm，在icycler real-time quantity PCR儀(BIO-RAD公司，美國)上進行反應(yīng)。數(shù)據(jù)處理采用△△Ct相對定量法。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0(SPSS Inc.，美國)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVAs)，結(jié)果用平均數(shù)±標準差(M±SD)表示。若存在顯著差異，則應(yīng)用Duncan多重比較法確定組間差異，當P < 0.05時，表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同營養(yǎng)方式下小球藻的生長情況

經(jīng)測定，小球藻藻液OD550值與細胞個數(shù)的換算公式為y=2×107x(R2=0.99，y是每毫升細胞個數(shù)，x是OD550值)。小球藻在自養(yǎng)條件下經(jīng)歷0.5 d的延滯期后進入對數(shù)生長期，9 d左右結(jié)束對數(shù)生長期，然后進入一個緩慢生長的穩(wěn)定期；在異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下，經(jīng)歷0.5 d的延滯期后迅速進入對數(shù)生長期，在1.5 d左右完成對數(shù)生長進入穩(wěn)定期，混養(yǎng)生長基本維持細胞密度不變，而異養(yǎng)生長出現(xiàn)細胞密度緩慢下降的現(xiàn)象(圖1)。混養(yǎng)生長最高細胞密度可達(3.0±0.2)×107個/mL，顯著高于異養(yǎng)生長的最高細胞密度(2.7±0.4)×107個/mL(P<0.05)，混養(yǎng)和異養(yǎng)生長的最高細胞密度又顯著高于自養(yǎng)生長的最高細胞密度(2.3±0.2)×107個/mL(P<0.05)。

2.2不同營養(yǎng)方式下小球藻的葉綠素熒光參數(shù)

如表1所示，小球藻在自養(yǎng)條件下的各項葉綠素熒光參數(shù)均顯著高于異養(yǎng)和混養(yǎng)條件(P<0.05)，而混養(yǎng)條件的各項參數(shù)又顯著高于異養(yǎng)條件(P<0.05)。在異養(yǎng)條件下，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)和rETR值均不到自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下的10%，NPQ值分別是自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下的21.7%和36.0%?；祓B(yǎng)條件下Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR和NPQ分別比自養(yǎng)條件下下降13.2%、21.5%、21.9%和40.0%。

圖1不同營養(yǎng)方式下小球藻的生長曲線

Fig.1Growth curves of Chlorella sorokiniana under different trophic modes

2.3不同營養(yǎng)方式下小球藻Rubisco酶的mRNA表達量

如圖2所示，以Rubisco酶大亞基基因(rbcL)mRNA的表達量代表Rubisco酶的表達量，小球藻在混養(yǎng)條件下Rubisco酶的表達量最高，分別是異養(yǎng)和自養(yǎng)條件下的3.2倍和1.8倍，而自養(yǎng)條件下的表達量是異養(yǎng)條件的1.8倍，三者之間的差異顯著(P<0.05)。

以HT組為參照進行歸一化處理，標注不同英文字母的組具有顯著性差異(P<0.05)

Transcript level of rbcL in AT and MT is normalized to that in HT.Values with different letters are significantly different (P<0.05)

圖2不同營養(yǎng)方式下小球藻rbcL基因mRNA的相對表達量

Fig.2Messenger RNA expression of rbcL gene under different trophic modes in Chlorella sorokiniana

表1不同營養(yǎng)方式下小球藻葉綠素熒光參數(shù)的比較

Table 1Comparison of chlorophyll fluorescence parameters under different trophic modes in Chlorella sorokiniana

樣品SampleFv/FmY(Ⅱ)rETRNPQAT0.713±0.003a0.538±0.009a18.000±0.265a0.060±0.012aHT0.061±0.010b0.010±0.004b0.250±0.212b0.013±0.004bMT0.619±0.005c0.422±0.008c14.067±0.252c0.036±0.003c

注：同一列中上標英文字母不同的組與同組數(shù)據(jù)相比差異顯著，P<0.05

Note:Values within the same column with different letters are significantly different (P<0.05)

3討論

小球藻在無光和有光條件下均可以利用乙酸進行生長，并且生長速度顯著快于自養(yǎng)生長，對數(shù)生長期顯著縮短，據(jù)報道，混養(yǎng)條件下的細胞生長速率可以大約看作是自養(yǎng)和異養(yǎng)生長速率之和[3,25-26]，這與文章的結(jié)果基本一致(圖1)。許多研究者證明乙酸主要是經(jīng)過乙醛酸循環(huán)被利用[21,23,27]，而乙醛酸循環(huán)是獨立于光合作用的，因而乙酸可以在黑暗條件下被小球藻利用。

小球藻在異養(yǎng)條件下表現(xiàn)出極低的光合效率(表1，圖2)，表明其光系統(tǒng)已經(jīng)大部分失去活性，暗反應(yīng)的關(guān)鍵酶Rubisco酶也僅維持本底表達量，在此條件下小球藻完全依賴發(fā)酵作用產(chǎn)生的能量維持生長和分裂，表現(xiàn)出類似于真菌的營養(yǎng)特性。而在混養(yǎng)條件下，其光合效率與自養(yǎng)條件相比也受到一定的抑制(表1)，其中代表潛在最大光合作用效率的Fv/Fm以及實際光合作用效率的Y(Ⅱ)均低于自養(yǎng)條件，這與Pringsheim等[15]、Heifetz等[17]、Kroymann等[28]的報道一致。然而，混養(yǎng)條件下的Rubisco酶的mRNA表達量要顯著高于自養(yǎng)條件，表明至少在轉(zhuǎn)錄水平上Rubisco酶未受到抑制。但是mRNA表達量不能代表最終蛋白表達量，因此需要進一步研究Rubisco酶活性以確定暗反應(yīng)是否也受到混養(yǎng)條件的抑制。

4結(jié)論

小球藻在乙酸為碳源的異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下均能極快生長，僅1.5 d就可以到達穩(wěn)定期，但異養(yǎng)條件下光系統(tǒng)已大部分失去活性，而混養(yǎng)生長光系統(tǒng)僅受到微弱抑制，既保留異養(yǎng)發(fā)酵生長的特性，又可以進行自養(yǎng)條件下的光合作用，因此生長速度和最終的生物量均高于其它營養(yǎng)方式，適合規(guī)模化放大培養(yǎng)。

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(責任編輯：米慧芝)

Variation of Growth and Photosynthesis in Chlorella sorokiniana Under Different Trophic Modes

WANG Chao1，SUN Chunxiao2，QIAO Hongjin2，CONG Chao2,3，WANG Jiying2，ZHANG Limin2

(1.College of Life Science，Qingdao University，Qingdao，Shandong，266071，China；2.Key Laboratory of Marine Ecological Restoration，Shandong Marine Resource and Environment Research Institute，Yantai，Shandong，264006，China；3.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai，201306，China)

Abstract:【Objective】The variation of growth and photosynthesis of microalgae was studied and compared under autotrophic condition and hetero- and mixotrophic conditions with acetate as carbon source.【Methods】With Chlorella sorokiniana as material,the changes of growth and photosynthesis were reflected by determining the OD550and the chlorophyll fluorescence from photosystem Ⅱ(PS Ⅱ).【Results】The growth rates of hetero- and mixotrophic conditions were significantly higher than that of autotrophic condition.It was only 1.5 d for cells reaching stationary phase under hetero- and mixotrophic conditions,but 9 d for cells under autotrophic condition.The parameters of chlorophyll fluorescence under autotrophic condition were significantly higher than that under hetero- and mixotrophic conditions,and that under mixotrophic condition were significantly higher than that under heterotrophic condition.The effective PS Ⅱ quantum yield under mixo- and heterotrophic condition was reduced 21.5% and 98.1%,respectively,compared with that of autotrophic condition.The mRNA expression of Rubisco gene under mixotrophic condition were highest,and 3.2-fold and 1.8-fold of that under hetero- and autotrophic conditions,respectively.【Conclusion】The photosystems of Chlorella under mixotrophic condition only slightly inhibited.In addition,the growth rate and maximal cell density under mixotrophic condition were higher than other conditions.Therefore,mixotrophic growth mode is suitable for large-scale cultivation.

Key words:Chlorella sorokiniana，autotrophic，heterotrophic，mixotrophic，photosynthesis

收稿日期：2016-02-21

作者簡介：王超(1982-)，女，講師，主要從事藻類生物技術(shù)研究。

中圖分類號:Q945.1

文獻標識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)02-0115-05

修回日期：2016-04-05

*山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金項目(BS2013HZ018)，國家自然科學基金青年基金項目(31201973)，海洋生物產(chǎn)業(yè)——水生動物營養(yǎng)與飼料研發(fā)創(chuàng)新示范平臺項目(201303003)和山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GHY115006)資助。

**通訊作者：喬洪金(1983-)，男，副研究員，碩士生導師，主要從事藻類生物技術(shù)研究，E-mail：hongjinqiao@hotmail.com。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(2):115～119

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-12

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160512.0904.002.html