乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和miR-210的表達(dá)及其調(diào)控

藍(lán)永洪　牛海艷　王　晗　楊　智　江朝娜　符碧薇　齊亞靈

(海南醫(yī)學(xué)院，海南　?？凇?71199)

乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和miR-210的表達(dá)及其調(diào)控

藍(lán)永洪牛海艷王晗楊智江朝娜符碧薇齊亞靈

(海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199)

〔摘要〕目的探討乳腺癌MCF-7細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與microRNA-210(miR-210)的表達(dá)情況及二者之間的調(diào)控關(guān)系。方法應(yīng)用Western印跡和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)分別檢測MCF-7細(xì)胞中HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。分別構(gòu)建針對HIF-1α和miR-210的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，觀察HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。結(jié)果MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α和miR-210表達(dá)，轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后HIF-1α和 miR-210的表達(dá)明顯下降；轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后HIF-1α表達(dá)沒有變化，但miR-210的表達(dá)明顯下降。結(jié)論乳腺癌MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α和miR-210表達(dá)，HIF-1α可正向調(diào)控miR-210的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕缺氧誘導(dǎo)因子-1α；microRNA-210；乳腺癌；調(diào)控關(guān)系

腫瘤生長迅速，其增生速度超過周圍血管的生長速度，導(dǎo)致局部缺氧，缺氧是多數(shù)實體腫瘤的特征〔1〕。缺氧與腫瘤的侵襲、血管生成和凋亡有關(guān)，并且增加了轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，影響預(yù)后〔2〕。作為低氧誘導(dǎo)產(chǎn)物，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與miR-210在乳腺癌組織中均明顯上調(diào)〔3，4〕，且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)〔5，6〕，但是HIF-1α與miR-210在乳腺癌生物學(xué)行為中如何相互調(diào)控仍需深入探討。本研究觀察miR-210與HIF-1α的表達(dá)情況，分析二者在乳腺癌細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶和OPTI-MEM購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，HIF-1α和miR-210的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體購自武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司，引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠快速配制試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒、小鼠抗人HIF-1α抗體、小鼠抗人Actin抗體、辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自碧云天生物技術(shù)公司，總RNA提取試劑盒(DP430)、cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR103)、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑(FP205)購自北京天根生化科技有限公司，CO2培養(yǎng)箱(4750E)購自美國NuAire公司，超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，微型垂直電泳槽(VE180)、半干轉(zhuǎn)移電泳槽(VE 386)購自上海天能科技有限公司，核酸蛋白測定儀購自德國Eppendorf公司，熒光定量 PCR 儀(Mx3005P)購自美國Agilent公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，以1×105/孔的密度接種6孔板，待細(xì)胞密度約為90%后，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，實驗分為對照組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染A液：將10 μl Lipo2000加至240 μl的Opti-MEM中輕輕混勻，室溫靜置5 min；轉(zhuǎn)染B液：將4 μl質(zhì)粒體或陰性對照加至246 μl Opti-MEM中輕輕混勻，將A 液與B液混勻，靜置20 min；對6孔板的細(xì)胞進(jìn)行換液，每孔加2 ml的Opti-MEM，然后將500 μl混合液加入6孔板中，輕輕混勻，6 h后進(jìn)行換液，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后觀察HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。

1.3Western印跡檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)取MCF-7細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，加入終濃度為1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的SDS裂解液，吹打數(shù)下，使裂解液和MCF-7細(xì)胞充分接觸，然后用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，吸至微量離心管，4℃14 000 r/min離心5 min，吸取上清液，采用二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白質(zhì)行8%SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含4% BSA的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)1封閉1 h，PBST洗膜，加入鼠抗人HIF-1α抗體(1∶500)和內(nèi)參Actin(1∶1 000)，4℃過夜，PBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000)，并于室溫下孵育1 h，PBST洗膜，采用DAB顯色，觀察結(jié)果，并進(jìn)行灰度值分析，計算HIF-1α/Actin的灰度值作為蛋白相對表達(dá)量。

1.4實時熒光定量PCR檢測miR-210的表達(dá)引物由公司合成，其中反轉(zhuǎn)錄特異性引物序列為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC-3′；miR-210的上游引物序列為：5′-CGCCTGTGCGTGTGACAGCG-3′，下游：GTGCAGGGTCCGAGGT，產(chǎn)物大小71 bp；內(nèi)參U6上游引物序列為：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，產(chǎn)物大小89 bp。取MCF-7細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，檢測總RNA濃度，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其反應(yīng)體系為20 μl，分別加入RNA模板1 μg，10×RT Mix 2 μl，Super Pure dNTP(2.5 nmol/L ench)2 μl，特異性引物2 μl，Quant Reverse Transcriptase 1 μl，然后加RNase-Free ddH2O至20 μl，徹底混勻后簡短離心，37℃孵育60 min，置于-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，其反應(yīng)體系為20 μl，分別加入cDNA模板1 μl，2× SuperReal PreMix Plus 10 μl ，上游引物0.6 μl，下游引物0.6 μl，50×ROX Reference 0.4 μl，然后加RNase-Free ddH2O至20 μl，徹底混勻后簡短離心，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 15 min，95℃ 10 s，62℃ 31 s，45個循環(huán)，以2-△△Ct值表示miR-210的相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果

2.1HIF-1α和miR-210的表達(dá)MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α蛋白的表達(dá)，將實時熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，MCF-7細(xì)胞中存在miR-210的表達(dá)，見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)HIF-1α的shRNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α(0.082±0.008)和miR-210的表達(dá)水平明(0.306±0.04)顯低于對照組(0.353±0.004、1.056±0.116)(P<0.05)，見圖2。

圖2　轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況

2.3轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)miR-210的shRNA轉(zhuǎn)染后，與對照組(0.332±0.011)相比，轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)(0.306±0.019)沒有明顯變化(P>0.05)，而miR-210的表達(dá)水平明顯下降(0.235±0.021 vs 1.016±0.034)(P<0.05)，見圖3。

圖3　轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況

3討論

乳腺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，已躍居女性惡性腫瘤的首位或第二位〔7〕。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后、導(dǎo)致患者死亡的主要原因〔8～10〕。HIF-1是缺氧條件下存在于哺乳動物和人體的一種轉(zhuǎn)錄因子〔11〕。研究證實HIF-1主要以異源二聚體形式存在，由120 kD的α亞基(HIF-1α)和91/93/94 kD(3種分子量)的β亞基(HIF-1β)組成。HIF-1α和HIF-1β同屬于Bhlh-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族，HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過α亞基完成，具有一個或多個有效的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，直接或間接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物反應(yīng)影響基因轉(zhuǎn)錄〔12〕。微小RNA(miRNA)作為小RNA的一種，可與其靶mRNA的非翻譯區(qū)特異性結(jié)合引起靶mRNA的翻譯抑制或降解，在細(xì)胞的生長分化等過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用〔13〕。miR-210是低氧應(yīng)答中的主要miRNA，因為迄今為止，miR-210在低氧狀態(tài)下，在所有的細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)〔14〕。本研究結(jié)果說明miR-210隨著HIF-1α的變化而變化，而HIF-1α不受miR-210水平的影響，表明HIF-1α可以調(diào)節(jié)miR-210的表達(dá)，其原因可能為，HIF-1α可在miR-210啟動子處直接與轉(zhuǎn)錄起始位點上游大約40 bp的缺氧反應(yīng)原件(HER)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而正向調(diào)控miR-210的表達(dá)，然后可能通過miR-210作用于靶基因在乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用，從而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，因此對于HIF-1α和miR-210的進(jìn)一步研究有可能為乳腺癌的靶向治療方面提供新的思路和策略。

4參考文獻(xiàn)

1Semenza GL.Intratumoral hypoxia，radiation resistance and HIF-1〔J〕.Cancer Cell，2004；5(5)：405-6.

2Vordermark D.Hypoxia-specific targets in cancer therapy：role of splice variants〔J〕.BMC Med，2010；(8)：45.

3趙婷婷，苗智峰，劉省宇，等.HIF-1α的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014；22(4)：850-4.

4張楠，李少游，鞏雅寧，等.miRNA-210對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2013；20(3)：289-94.

5Kronblad A，Jirstrom K，Ryden L，etal.Hypoxia inducible factor-1alpha is a prognostic marker in premenopausal patients with intermediate to highly differentiated breast cancer but not a predictive marker for tamoxifen response〔J〕.Int J Cancer，2006；118(10)：2609-16.

6Hong L，Yang J，Han Y，etal.High expression of miR-210 predicts poor survival in patients with breast cancer：a meta-analysis〔J〕.Gene，2012；507(2)：135-8.

7Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics，2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009；59(4)：225-49.

8Li Q，Wu M，Wang H，etal.Ezrin sinlencing by small hairpin rna reverses metastaic behaviors of human breast cancer cells〔J〕.Cancer Lett，2008；261(1)：55-63.

9Gonealves A，Esterni B，Bertucei F，etal.Postoperative serum proteomic profiles may predict metastatic relapse in high-risk primary breast cancer patients receiving adjuvant chemotherapy〔J〕.Oncogene，2006；25(7)：981-9.

10敬巧.HIF-1α與惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010；26(24)：3552-4.

11Nagaraju GP，Bramhachari PV，Raghu G，etal.Hypoxia inducible factor-1α：Its role in colorectal carcinogenesis and metastasis〔J〕.Cancer Lett，2015；366(1)：11-8.

12Ioannou M，Paraskeva E，Baxevanidou K，etal.HIF-1α in colorectal carcinoma：review of the literature〔J〕.J BUON，2015；20(3)：680-9.

13Khoshnaw SM，Green AR，Powe DG，etal.MicroRNA involvement in the pathogenesis and management of breast cancer〔J〕.J Clin Pathol，2009；62(5)：422-8.

14Kulshreshtha R，F(xiàn)erracin M，Wojcik SE，etal.A microRNA signature of hypoxia〔J〕.Mol Cell Biol，2007；27(5)：1859-67.

〔2014-12-11修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：海南省自然科學(xué)基金(No.814301)；海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金(No.HY2013-12)

通訊作者：齊亞靈(1967-)，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤基因診斷及生物治療研究。

〔中圖分類號〕R730

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2623-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.025

第一作者：藍(lán)永洪(1978-)，男，碩士，副研究員，主要從事分子病理學(xué)研究。