不同劑量阿司匹林對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生功能的影響

王永彬　張　璐　陳美娜　秦橋基　張學(xué)志　黃　歡

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，山東　青島　266003)

不同劑量阿司匹林對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生功能的影響

王永彬張璐陳美娜秦橋基張學(xué)志黃歡

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，山東青島266003)

〔摘要〕目的探討不同劑量阿司匹林對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)血管新生功能的影響。方法4周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，處死后分離右心室，提取原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)阿司匹林濃度不同分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(1、10、100、1 000、5 000 μmol/L)，分別檢測(cè)其對(duì)CMECs的增殖能力、細(xì)胞遷移能力和纖維連接蛋白(FN)水平的影響。結(jié)果培養(yǎng)48 h后，阿司匹林1、10、100 μmol/L組與對(duì)照組比較細(xì)胞量和凋亡指數(shù)(AI)值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅濃度為1 000和5 000 μmol/L組與對(duì)照組比較細(xì)胞量和AI值差異顯著(P<0.05)；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示1、10、100 μmol/L阿司匹林組的劃痕間距均顯著小于對(duì)照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的Transwell遷移數(shù)顯著高于對(duì)照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的成管個(gè)數(shù)顯著高于對(duì)照組，5 000 μmol/L阿司匹林組的成管個(gè)數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其余組的相應(yīng)指標(biāo)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FN的分析結(jié)果顯示除1 μmol/L阿司匹林組外其余濃度組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論阿司匹林對(duì)CMECs作用低濃度時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移作用，并能顯著誘導(dǎo)FN分泌；高濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制增殖和遷移作用，但是對(duì)FN的分泌具有促進(jìn)作用。

〔關(guān)鍵詞〕阿司匹林；心?。晃⒀軆?nèi)皮細(xì)胞；血管新生

心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)是心臟微循環(huán)的重要組成部分，占整個(gè)心臟細(xì)胞總量的1/3，可以影響心肌灌流水平〔1〕。CMECs能夠分泌一氧化氮和前列環(huán)素等舒張血管的活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)心肌組織的血氧供應(yīng)平衡〔2〕。阿司匹林能夠調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能〔3〕，但鮮有研究報(bào)道其對(duì)CMECs的作用。本研究旨在探討不同濃度的阿司匹林對(duì)CMECs的作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑4周齡雄性SD大鼠，體重90～110 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(蓉)2007-2002，SPF級(jí)，飼養(yǎng)于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。磷酸鹽緩沖液(PBS)、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(含4 mmol/L谷氨酰胺和4 500 mg/ml葡萄糖)、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素溶液(含10 000 U/ml青霉素，10 000 μg/ml鏈霉素)均購(gòu)自Hyclone(Logan，UT，USA)，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco(Auckland，NZ)，基質(zhì)膠、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購(gòu)自BD(NJ，USA)，纖維連接蛋白(FN)ELISA試劑盒購(gòu)自R&D(MN，USA)，絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、山羊抗兔IgG二抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記均購(gòu)自Abcam(MA，USA)，偏聚二氟乙烯(PVDF)膜和化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CMECs培養(yǎng)頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下分離心臟，去除心外膜，分離右心室并用PBS沖洗，剪碎后加入3 g/ml Ⅱ型膠原酶吹打混勻，8 min后加入2.5 g/L的胰蛋白酶，在37℃水浴中消化15 min，加入適量DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%的青霉素/鏈霉素溶液)終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min離心5 min，棄上清，加DMEM培養(yǎng)基重懸后接種至培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)6 h后棄去未貼壁細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其后每2 d換液1次，每4 d傳代1次。

1.2.2細(xì)胞處理和分組CMECs培養(yǎng)2～3代后，消化離心，重懸后制成細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)需求接種至細(xì)胞培養(yǎng)板上，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組添加不同濃度(1、10、100、1 000、5 000 μmol/L)的阿司匹林，對(duì)照組僅添加培養(yǎng)基。

1.2.3CMECs的增殖能力檢測(cè)CMECs以5×103/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞全部貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基200 μl，培養(yǎng)48 h后加入25 μl的MTT試劑，37℃反應(yīng)4 h后，棄上清，用200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解細(xì)胞內(nèi)的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，以對(duì)照組細(xì)胞為100%，計(jì)算其余孔內(nèi)細(xì)胞量。

1.2.4CMECs的凋亡細(xì)胞檢測(cè)10×10 mm的蓋玻片滅菌后置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，CMECs以1×105/孔接種于24孔板內(nèi)，24 h后按實(shí)驗(yàn)分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基2 ml，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行TUNEL染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。細(xì)胞核被4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染成藍(lán)色熒光，為有核細(xì)胞；染色陽性呈綠色熒光，為凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)10個(gè)視野內(nèi)CMECs總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5CMECs的劃痕實(shí)驗(yàn)CMECs以2×105/孔接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞密度達(dá)到90%，用滅菌后的一次性1 ml吸頭在細(xì)胞生長(zhǎng)平面上劃動(dòng)，每孔劃動(dòng)一次，保持每孔的劃痕長(zhǎng)度和深度一致。劃動(dòng)后去除漂浮的細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基，依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同濃度的阿司匹林，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察劃痕間距。

1.2.6CMECs遷移能力的Transwell檢測(cè)CMECs以1×105/室接種于Transwell小室的上室，并按照實(shí)驗(yàn)分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基，下室中添加DMEM培養(yǎng)基和10 ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)8 h后用多聚甲醛固定2 h，足量PBS清洗去除濾膜上沒有遷移的細(xì)胞，采用結(jié)晶紫染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.7CMECs成管能力檢測(cè)向24孔板內(nèi)以200 μl/孔添加Matrigel基質(zhì)膠，按照實(shí)驗(yàn)分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CMECs 48 h后，將細(xì)胞重懸并以1×105/孔接種至已經(jīng)鋪膠的24孔板中，培養(yǎng)6 h后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)5個(gè)視野并取平均數(shù)。

1.2.8CMECs中FN水平的測(cè)定CMECs以1×105/孔接種至12孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照操作說明書進(jìn)行ELISA檢測(cè)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，計(jì)算各樣本中FN水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析和SNK檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1阿司匹林對(duì)CMECs增殖和凋亡的影響成功分離培養(yǎng)得到的原代CMECs呈“鵝卵石”或“鋪路石”狀貼壁生長(zhǎng)〔3〕，阿司匹林濃度為1、10、100 μmol/L組與對(duì)照組比較細(xì)胞量和AI值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅濃度為1 000和5 000 μmol/L組與對(duì)照組比較細(xì)胞量和AI值差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2阿司匹林對(duì)CMECs遷移能力及分泌FN水平的影響1、10、100 μmol/L阿司匹林組的劃痕間距均顯著小于對(duì)照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的Transwell遷移數(shù)顯著高于對(duì)照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的成管個(gè)數(shù)顯著高于對(duì)照組，5 000 μmol/L阿司匹林組的成管個(gè)數(shù)顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)，其余組的相應(yīng)指標(biāo)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CMECs中FN表達(dá)水平隨阿司匹林濃度增加而增加，除1 μmol/L阿司匹林組外其余濃度組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1　阿司匹林對(duì)CMECs增殖和凋亡的影響±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

表2　阿司匹林對(duì)CMECs遷移能力及分泌FN水平的影響±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

冠心病是我國(guó)第二順位的死亡原因，且發(fā)病率仍在不斷增加，其基本病理過程是心肌缺血，所以亦被稱為缺血性心肌病，其治療關(guān)鍵是恢復(fù)心肌的有效血液灌注，因此延長(zhǎng)缺血心肌的存活能力，防止不可逆的損傷是治療和預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵〔4〕。CMECs是近年來研究發(fā)現(xiàn)的心肌微循環(huán)的重要部分，在維持心肌微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，CMECs直接接觸血液和組織細(xì)胞，受到來自血液和組織細(xì)胞的雙重調(diào)節(jié)，也是心肌細(xì)胞受損時(shí)最早且最易受損的靶細(xì)胞，CMECs的變化是心臟損傷/恢復(fù)過程的關(guān)鍵〔5〕。阿司匹林是廣泛應(yīng)用于心血管疾病治療和預(yù)防的藥物，其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧化酶(COX)、降低血栓素(TX)A2和抑制前列腺素合成達(dá)到抑制炎癥和血小板聚集的作用，因?yàn)檠“鍥]有細(xì)胞核，不能自行合成COX，所以阿司匹林對(duì)血小板的抑制作用持久且不可逆轉(zhuǎn)〔6〕。目前普遍認(rèn)為抗血小板聚集的作用是阿司匹林保護(hù)心血管作用的主要機(jī)制，但是亦有證據(jù)顯示阿司匹林的其他效應(yīng)也發(fā)揮了重要作用，如對(duì)EPCs的增殖能力、遷移能力等〔7〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對(duì)CMECs的增殖和凋亡具有一定的影響，但是僅在濃度較大的時(shí)候表現(xiàn)出顯著的效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞可以通過垂體生長(zhǎng)激素的作用產(chǎn)生PGI2，可以代償性地彌補(bǔ)阿司匹林對(duì)COX的抑制作用。這可能是其增殖活性和AI在低濃度阿司匹林的誘導(dǎo)下并未表現(xiàn)出差異的解釋之一。血管新生的過程包括內(nèi)皮和基底膜的溶解連接，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和黏附，最終形成新的毛細(xì)血管，因此CMECs的遷移能力是其是否能夠影響血管新生功能的作用評(píng)價(jià)指標(biāo)〔8〕。FN是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一族高分子蛋白，具有多種生物活性，能夠增強(qiáng)細(xì)胞間粘連及細(xì)胞與基質(zhì)的粘連，是血管修復(fù)的重要因子。研究顯示血管硬化程度與FN水平具有顯著的負(fù)相關(guān)性，血漿中FN的缺乏將導(dǎo)致血管通透性增加，引起血漿外滲，有效循環(huán)血量降低，導(dǎo)致局部供養(yǎng)不足〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林同樣具有促進(jìn)CMECs分泌FN的作用，且這一作用表現(xiàn)出劑量依賴性。然而阿司匹林作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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〔2015-08-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R54

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2617-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.022

第一作者：王永彬(1974-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科方面的研究。