假地楓皮根皮提取液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

趙　氚，何　玲

·論著·

假地楓皮根皮提取液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

趙氚，何玲

[摘要]目的評(píng)價(jià)八角屬植物假地楓皮的根皮提取液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法采用經(jīng)神經(jīng)竽長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞，以神經(jīng)生長(zhǎng)因子為陽(yáng)性對(duì)照, 在無(wú)血清和有血清培養(yǎng)條件下分別對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行MTT染色測(cè)定；以未分化的PC12 為效應(yīng)細(xì)胞，采用圖象分析法顯微觀測(cè)分化細(xì)胞的百分率。結(jié)果假地楓皮根皮提取液對(duì)經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的增殖以及未分化PC12細(xì)胞凸起的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。結(jié)論初步確認(rèn)假地楓皮根皮提取液可能有促進(jìn)神經(jīng)增殖和生長(zhǎng)的作用。

[關(guān)鍵詞]假地楓皮；PC12細(xì)胞；增殖；分化

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是一種對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化、新陳代謝等方面具有重要調(diào)控作用的活性多肽[1]。NGF作為一種靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子維持著特定神經(jīng)元的存活和發(fā)育，它能促進(jìn)發(fā)育中的感覺(jué)神經(jīng)元及交感神經(jīng)元的存活和分化，營(yíng)養(yǎng)成熟的神經(jīng)元，維持其正常的生物學(xué)功能，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起修復(fù)、營(yíng)養(yǎng)作用。然而NGF的某些蛋白質(zhì)性質(zhì)(如化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，半衰期短，藥代動(dòng)力學(xué)特性欠佳，且不易通過(guò)血腦屏障等)限制了其成為理想的臨床用藥。此外，NGF可以與其低親和力 p75NTR受體相互作用引起神經(jīng)元死亡，這或許也是影響其臨床應(yīng)用的因素之一。因此，尋找小分子NGF類(lèi)似物成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)八角屬植物進(jìn)行了更為廣泛的藥理活性研究，相關(guān)研究結(jié)果表明利用PC12細(xì)胞模型，八角屬植物紅茴香根皮(IlliciumangustisepalumA.C.Smith)中的化學(xué)成分可能對(duì)PC12細(xì)胞有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[3]。本研究選用PC12細(xì)胞作為體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行觀察，并采用MTT法和圖像分析法考察另一種八角屬植物假地楓皮根皮提取液對(duì)PC12細(xì)胞增殖、分化的影響，期望得到結(jié)論，并希望今后能為從八角屬植物根皮中純化其活性成分、探討其化學(xué)性質(zhì)提供一些參考[4]。

1材料與方法

1.1材料PC12細(xì)胞由中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心提供、保存；注射用鼠NGF購(gòu)自武漢海特生物制藥股份有限公司；假地楓皮根皮提取液由浙江泰康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；新生小牛血清購(gòu)自PAA Laboratories GmbH；DMEM粉末購(gòu)自Invitrogen Corporation；MTT購(gòu)自Amresco公司。

1.2方法(1)MTT方法：參照文獻(xiàn)[3]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)NGF誘導(dǎo)分化的PC12，復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105，接種于96孔板，5% CO2、37℃分別在無(wú)血清培養(yǎng)條件下或有血清正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分成：假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組、以及假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與陽(yáng)性藥NGF(300 μg/L)聯(lián)合用藥組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組給予NGF，NGF用磷酸鹽緩沖液配制成4 000 μmol/L的母液濃度備用，給藥時(shí)15 μl/孔/200 μl，終濃度為300 μg/L。陰性對(duì)照組給予與陽(yáng)性對(duì)照等體積的磷酸鹽緩沖液15 μl/孔/200 μl。各組各劑量采用3批細(xì)胞，重復(fù)3個(gè)孔。培養(yǎng)48 h后，加入MTT，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570 nm處的光吸收(OD570nm)。(2)圖像分析法：參照文獻(xiàn)[3]。將未分化的PC12細(xì)胞復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度5×103接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，將培養(yǎng)細(xì)胞分成：假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組、以及假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別與陽(yáng)性藥NGF(50 μg/L)聯(lián)合用藥組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組。每組設(shè)5孔細(xì)胞，每孔隨機(jī)觀測(cè)20個(gè)細(xì)胞，共100個(gè)細(xì)胞。24、48、72 h進(jìn)行光鏡觀察，計(jì)數(shù)突起生長(zhǎng)細(xì)胞(≥2倍細(xì)胞直徑)占總細(xì)胞的百分率。增殖率(%)=(給藥組OD值-陰性對(duì)照組OD值)/陰性對(duì)照組OD值×100%。

2結(jié)果

在有血清的正常培養(yǎng)條件下，假地楓皮根皮提取液中劑量和高劑量組均對(duì)PC12細(xì)胞有明顯促增殖作用，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。受試藥各劑量組未見(jiàn)細(xì)胞毒性，與NGF(300 μg/L)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯協(xié)同增效作用。見(jiàn)表1。

表1假地楓皮根皮提取液在有血清培養(yǎng)條件下對(duì)

NGF分化的PC12細(xì)胞的增殖作用

注：與陰性對(duì)照組相比aP<0.05

在無(wú)血清的培養(yǎng)條件下，假地楓皮根皮提取液各劑量組均對(duì)PC12細(xì)胞有明顯促增殖作用，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。受試藥各劑量組未見(jiàn)細(xì)胞毒性，與NGF(300 ng/ml)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖未見(jiàn)協(xié)同增效作用。見(jiàn)表2。

表2　假地楓皮根皮提取液在無(wú)血清培養(yǎng)條件下

注：與陰性對(duì)照組相比aP<0.05

與陰性對(duì)照組相比，假地楓皮根皮提取液各劑量組均能顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)，第2天(48 h)誘導(dǎo)分化活性最強(qiáng)，第3天分化細(xì)胞百分?jǐn)?shù)遞減，并且呈劑量相關(guān)性。受試藥各劑量組與NGF(50 μg/L)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)促進(jìn)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)有明顯的協(xié)同增效作用。見(jiàn)表3。

3討論

本研究結(jié)果分析表明, 假地楓皮根皮提取液具有顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞分化的作用，且與NGF有明顯的協(xié)同增效作用。假地楓皮根皮提取液在受試劑量對(duì)PC12細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性，均能顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下(缺營(yíng)養(yǎng)損傷時(shí))的

表3假地楓皮根皮提取液對(duì)PC12細(xì)胞的

促神經(jīng)分化作用(每孔20個(gè)細(xì)胞)

促增殖作用強(qiáng)于在有血清正常培養(yǎng)條件下的作用。與NGF聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖未見(jiàn)協(xié)同增效作用。這從細(xì)胞水平為中藥促神經(jīng)生長(zhǎng)的機(jī)制提供了佐證。在實(shí)驗(yàn)中,盡管獲得假地楓皮根皮提取液具有明顯促PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的數(shù)據(jù), 但這方面的研究還是相當(dāng)初步的, 藥物的體內(nèi)過(guò)程, 與機(jī)體相互作用之后, 再作用于神經(jīng)細(xì)胞的效應(yīng)如何, 尚有待進(jìn)一步的探索。此外，真正具有臨床應(yīng)用前景的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類(lèi)似物,應(yīng)主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)或?qū)γ庖摺?nèi)分泌等系統(tǒng)無(wú)明顯的負(fù)面影響[5]。因此，利用PC12 細(xì)胞突起生長(zhǎng)為指標(biāo)進(jìn)行假地楓皮根皮提取液促神經(jīng)分化作用的確定,體外作用是肯定的但作用機(jī)制是不確定的,只能作為一種很實(shí)用的初級(jí)模型。假地楓皮根皮提取液目標(biāo)活性的確定需通過(guò)作用機(jī)制的選擇篩選以及體內(nèi)試驗(yàn)完成。

[參考文獻(xiàn)]

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(本文編輯：張陣陣)

Effect of Illicium jadifengpi B.N.Chang root bark extract on the enhancement of nerve growth

Zhao Chuan，He Ling

(NavyGeneralHospital,Beijing100048,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effect of Illicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract on the enhancement of nerve growth.Methods By using NGF as the positive control, the survival rate of the NGF-induced PC12 cells was detected with MTT staining under the culture conditions without or with serum. At the same time, by using the proliferated PC12 as reactive cells, the proliferating rate of PC12 cells was observed with the image analysis method under microscopy.ResultsIllicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract could produce good effects on the proliferation of the NGF-induced PC12 cells and the growth of the undifferentiated PC12 cells.ConclusionIt was preliminarily identified that Illicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract might contain a neurotrophic factor-like substance, which could enhance the proliferation and growth of nerve cells.

[Key words]Illicium jadifengpi B.N.Chang; PC12 cell; Proliferation; Differentiation

[作者單位]100048北京，海軍總醫(yī)院(趙氚)；中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室(何玲)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R283.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.011

(收稿日期：2016-01-23)