張雪蓮， 周尊海， 張利強(qiáng)， 王 博， 賈玉芳， 梁愛斌

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200090； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科，上海 200065； 3. 上海賽金生物醫(yī)藥有限公司，上海 201203； 4. 濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)寧 272011)

?

·基礎(chǔ)研究·

As2O3誘導(dǎo)NB4、HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

張雪蓮1， 周尊海1， 張利強(qiáng)3， 王 博1， 賈玉芳4， 梁愛斌2

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200090； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科，上海 200065； 3. 上海賽金生物醫(yī)藥有限公司，上海 201203； 4. 濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)寧 272011)

目的 探討三氧化二砷(As2O3)在體外抑制急性早幼粒白血病(acute promyelocyticleukemia， APL)細(xì)胞NB4、HL-60細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法 通過WST-8法檢測(cè)上述兩個(gè)細(xì)胞株的增殖抑制曲線;用AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡;用Real time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53、C-myc、Survivin在As2O3處理前后的表達(dá)變化，同時(shí)用Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P53在As2O3處理前后的表達(dá)變化。結(jié)果 As2O3能夠顯著抑制兩種細(xì)胞增殖, Westernblot檢測(cè)及Realtime PCR結(jié)果顯示，As2O3處理引起了兩種細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8 、Caspase-9基因表達(dá)水平增加，且蛋白表達(dá)水平上都出現(xiàn)了活性形式的Caspases。NB4細(xì)胞中Survivin、C-myc、Bcl-2的基因表達(dá)水平都顯著降低，突變型p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的量同樣顯著下降；HL-60細(xì)胞的C-myc表達(dá)水平顯著降低，但Survivin、Bcl-2表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論 As2O3能在藥物臨床濃度范圍內(nèi)有效抑制急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60、NB4的細(xì)胞增殖, 但方式不同；1.5μmol/L濃度的As2O3對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制體現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞分化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制只體現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞分化。HL-60細(xì)胞中高表達(dá)的Survivin、Bcl-2抑制了細(xì)胞的凋亡。NB4、HL-60細(xì)胞株中P53基因的細(xì)胞遺傳學(xué)變異的不同可能是As2O3對(duì)這兩種細(xì)胞增殖抑制機(jī)制差異的主要原因之一。

As2O3； 細(xì)胞凋亡； NB4； HL-60； survivin； p53

20世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)醫(yī)務(wù)工作者最早發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)(acute promyelocytideukmia, APL)有顯著療效。此后國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病的治愈率達(dá)到了90%。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)As2O3可以誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化和凋亡[1]。 NB4細(xì)胞在低濃度條件下，As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞趨向分化，而在高濃度條件下，As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞趨向凋亡[2]。在PML-RARa融合蛋白陰性的HL-60細(xì)胞中，同樣表現(xiàn)出低濃度As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞分化，高濃度As2O3誘導(dǎo)凋亡的現(xiàn)象[3]，但誘導(dǎo)凋亡所需的濃度大幅度高于NB4細(xì)胞。陳賽娟等發(fā)現(xiàn)了As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞系分化與凋亡的分子機(jī)制[4]，揭示了NB4細(xì)胞中的PML-RARa融合蛋白是As2O3的靶蛋白。但在PML-RARa融合蛋白陰性的HL-60細(xì)胞中，深入探討As2O3誘導(dǎo)凋亡的研究較少，為此本研究對(duì)比研究了在藥理濃度條件下As2O3誘導(dǎo)NB4和HL-60細(xì)胞分化與凋亡過程中的區(qū)別，探討其分子機(jī)制的異同，以期為As2O3臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑

HL-60和NB4細(xì)胞系由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院引進(jìn)。As2O3購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司；RPMI 1640、IMDM培養(yǎng)基及FBS購(gòu)自Gibco公司；Cell Counting Kit-8購(gòu)自同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I購(gòu)自BD公司；BCA蛋白定量分析試劑盒、Chemiluminescent HRP Substrate購(gòu)自Thermo公司；RNAsimple總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自Applied Biosystems公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NB4、HL-60細(xì)胞用含有5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞密度保持在(1×105～5×105)/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 WST-8法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

取細(xì)胞密度為1×105/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按不同給藥方式將上述三個(gè)細(xì)胞系各分8組，其中6組為實(shí)驗(yàn)組(As)： 加入As2O3后使各組終濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0μmol/L；1組為對(duì)照組(Ac)： 不含藥物只含細(xì)胞的培養(yǎng)基；1組為空白組(Ab)： 不含細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，每孔加入CCK-8 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)3～5h后，測(cè)定波長(zhǎng)450nm處的D。根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率： 細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

取細(xì)胞密度為1×105/ml的細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞系分為兩組： 未加藥的對(duì)照組和加入終濃度為1.5μmol/L As2O3的實(shí)驗(yàn)組。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72h 后將細(xì)胞離心、洗滌，加入AnnexinⅤ及PI染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

收集藥物處理24h、48h、72h的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在ABI Prism 7500系統(tǒng)上擴(kuò)增目的基因。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列

1.6 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

收取藥物處理后細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度，煮沸變性。經(jīng)SDS-PAGE，之后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1h，并一抗4℃孵育過夜，二抗孵育，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)，Image QuantTMLAS 4000凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)與對(duì)照組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3對(duì)HL-60 、NB4細(xì)胞增殖抑制

兩細(xì)胞株在不同濃度As2O3處理48h條件時(shí)的增殖抑制率結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩株細(xì)胞系之間的增殖抑制率有顯著差異(P<0.05，n=5)。從As2O3濃度-細(xì)胞增殖抑制率關(guān)系圖(圖1)可得知，NB4對(duì)As2O3的細(xì)胞增殖抑制敏感性與HL-60接近，但略高。利用Grahpad Prism 5軟件計(jì)算得到NB4、HL-60的IC50值分別為1.3μmol/L、2.1μmol/L。

2.2 As2O3處理各細(xì)胞系的凋亡情況

以1.5μmol/L的As2O3處理細(xì)胞，在不同時(shí)間(24h、48h、72h)用AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，在NB4中凋亡細(xì)胞比例迅速上升，由24h的5.43%上升到48h的52.56%,72h的70.67%，見圖2 A-D。而HL-60凋亡細(xì)胞數(shù)量并未隨著As2O3處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，只是從對(duì)照的1.38%增加到 72h 的2.38%，見圖2 E～H?？梢钥闯鯪B4細(xì)胞對(duì)1.5μmol/L 的As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感度強(qiáng)，而HL60對(duì)1.5μmol/L 的As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抵抗性。

圖1 不同濃度As2O3對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率(n=5)Fig.1 Effect of As2O3 on inhibition rate of cell proliferation in NB4 and HL60 cells

圖2 A-D、E-H分別表示HL60、NB4細(xì)胞系control、24h、48h、72h的細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The result of Flow cytometric with Annexin-V/PI staining

2.3 As2O3處理過程中各細(xì)胞株的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況

1.5μmol/L As2O3作用于NB4、HL-60后，兩個(gè)細(xì)胞株在細(xì)胞增殖抑制率接近的情況下，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡率差距顯著的現(xiàn)象。為了探究這一現(xiàn)象背后分子機(jī)制的異同，檢測(cè)了1.5μmol/L As2O3處理后，兩種細(xì)胞中Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Bax及Survivin、C-myc、CD11b等基因表達(dá)的變化趨勢(shì)，也考察了NB4細(xì)胞中的突變型p53基因的表達(dá)變化。同時(shí)也分析了各基因在不同細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)情況。

As2O3處理前后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2、Survivin基因在HL-60細(xì)胞株中mRNA表達(dá)水平明顯高于NB4，是NB4細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平的2～8倍。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因在藥物處理后各基因表達(dá)水平增長(zhǎng)趨勢(shì)及幅度較為接近，見圖3A、B、C。在對(duì)As2O3誘導(dǎo)凋亡敏感的NB4細(xì)胞株中，Survivin基因的mRNA表達(dá)水平在藥物處理的24h時(shí)就顯著下降；Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平在藥物處理的24h時(shí)也已明顯下降，見圖4D；在對(duì)As2O3誘導(dǎo)凋亡不敏感的HL60細(xì)胞株中，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平在藥物處理的72h內(nèi)下降不明顯，見圖3D，Survivin基因的mRNA表達(dá)水平在藥物處理48h后才明顯下降，見圖4D。

As2O3處理前后HL-60細(xì)胞中Bax基因表達(dá)無顯著上升，但NB4細(xì)胞中Bax基因在藥物處理后其mRNA 表達(dá)水平上升趨勢(shì)快、增加幅度大，見圖3E。

Bcl-2/Bax值(mRNA表達(dá)水平比值)在兩細(xì)胞系中表達(dá)水平有著明顯的差異P<0.01，見圖3中F所示，Bcl-2/ Bax表達(dá)水平的比值在NB4中下降趨勢(shì)顯著，24h后即迅速下降，由未處理時(shí)的4.47下降到藥物處理48h時(shí)的0.86。在NB4細(xì)胞株中Bcl-2/Bax值接近1的時(shí)間與細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡的時(shí)間基本一致。HL-60細(xì)胞株中的Bcl-2/ Bax表達(dá)水平的比值在藥物處理前后一直在6.71～8.48之間波動(dòng)，下降趨勢(shì)不明顯，Bcl-2基因的表達(dá)量一直顯著大于Bax。

藥物處理后，NB4細(xì)胞、HL-60細(xì)胞中的C-myc的基因表達(dá)水平急劇下降，處理24h的表達(dá)量與未處理前相比分別下降了60.5%和47.9%；兩者細(xì)胞中C-myc的基因表達(dá)水平下降幅度與其對(duì)As As2O3的增殖抑制敏感度強(qiáng)弱呈正相關(guān)(r=0.7582)。

在As2O3誘導(dǎo)下NB4細(xì)胞中p53基因表達(dá)量稍有增加，而P53缺失的HL60細(xì)胞中則檢測(cè)不到p53基因的表達(dá)，見圖4C。

圖3 As2O3處理NB4、HL60細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax及C-myc等基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of As2O3 on mRNA expression of Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2, Bax and C-myc in NB4 and HL60 cellsA、B、C、D、E分別表示As2O3處理前后，各細(xì)胞株中caspase3/8/9、Bcl-2、Bax基因表達(dá)變化情況；F表示As2O3處理前后，各細(xì)胞株中Bcl-2與Bax基因表達(dá)水平比值的變化情況；誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)，n=3；*P<0.05； **P<0.01

圖4 As2O3處理NB4、HL60細(xì)胞不同時(shí)間C-myc、CD11b、p53及Survivin等基因表達(dá)的變化Fig.4 Effect of As2O3 on the mRNA expression of C-myc、CD11b、P53 and Survivin in NB4 and HL60誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)，n=3,*P<0.05； ** P<0.01

2.4 As2O3處理過程中各細(xì)胞系的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

NB4細(xì)胞在As2O3處理12h時(shí)，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9已經(jīng)都出現(xiàn)裂解帶，并且隨著As2O3處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的前體蛋白表達(dá)量呈不斷增加的趨勢(shì)，其活性形式的蛋白量也明顯增加。Bax蛋白表達(dá)量也表現(xiàn)出了隨著As2O3處理時(shí)間的延長(zhǎng)而上升的趨勢(shì),Bcl-2則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)(圖5)。這說明NB4細(xì)胞內(nèi)，在蛋白水平上Bcl-2/ Bax比值也是不斷下降的,與基因表達(dá)比值變化趨勢(shì)一致。

HL-60細(xì)胞在As2O3處理12h時(shí)，Caspase-3、Caspase-8出現(xiàn)了裂解帶，而Caspase-9直到72h時(shí)才出現(xiàn)裂解帶。隨著As2O3處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase3、Caspase8、Caspase9的前體蛋白表達(dá)量呈不斷增加的趨勢(shì)，但其活性形式的蛋白表達(dá)量沒有明顯的增加。Bax蛋白表達(dá)量也表現(xiàn)出了隨著As2O3處理時(shí)間的延長(zhǎng)而略上升的趨勢(shì)(圖5)，但Bcl-2蛋白表達(dá)量下降的趨勢(shì)不明顯。

NB4細(xì)胞中突變型P53蛋白在As2O3誘導(dǎo) 12h 后表達(dá)量即明顯下降，24h后急劇下降，48h后細(xì)胞內(nèi)的突變型P53蛋白已檢測(cè)不到(圖5)，與此同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象(圖2C)。HL60細(xì)胞中則始終檢測(cè)不到突變型P53蛋白(圖5)。

圖5 Western blot法檢測(cè)各細(xì)胞系的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 Effect of As2O3 on expression of apoptosis-related protein in NB4 and HL60 cells detected by Western blotting

3 討 論

As2O3通過促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增生、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。

已有的研究表明, C-myc作為一種原癌蛋白,有推進(jìn)細(xì)胞周期、促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞分化的作用[6]。CDllb是髓系細(xì)胞分化的重要標(biāo)志，在髓系細(xì)胞逐漸分化成熟過程中的表達(dá)會(huì)逐漸升高[7]。在本研究中，As2O3處理后HL-60的CDllb基因表達(dá)水平不斷上升，C-myc基因表達(dá)水平不斷下降，表明在1.5μmol/L的As2O3濃度處理72h內(nèi)，HL-60趨向于分化，細(xì)胞增殖被抑制。NB4在As2O3處理后CD11b基因的表達(dá)水平先小幅度上升，48h后細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，同時(shí)細(xì)胞CD11b表達(dá)量下降。而在此過程中C-myc基因表達(dá)水平不斷下降。表明在1.5μmol/L As2O3濃度處理后，NB4細(xì)胞經(jīng)歷了分化過程后又趨向凋亡，從而細(xì)胞增殖被抑制。

正如As2O3對(duì)NB4細(xì)胞表現(xiàn)出的誘導(dǎo)凋亡作用一樣，As2O3抗腫瘤的作用還表現(xiàn)在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的凋亡主要通過兩條途徑進(jìn)行一條為死亡受體途徑，亦稱外源性途徑；另一條途徑稱為線粒體途徑，亦稱內(nèi)源性途徑。已有的一些研究表明As2O3可以直接抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng),激活Caspase-8或者Caspase-9、Caspase-3 等機(jī)制誘導(dǎo)凋亡[8]。

As2O3處理后，兩株細(xì)胞的Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9在基因及蛋白水平的表達(dá)上都顯示出了上升的趨勢(shì)。在Western blot檢測(cè)中，4～12h內(nèi) Caspases-3、Caspases-8在兩株細(xì)胞中都出現(xiàn)了活性形式，且NB4中Caspase-9也出現(xiàn)了活性形式,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。而在HL-60細(xì)胞中，Caspase-9的活性形式在72h時(shí)才出現(xiàn)，顯著晚于 NB4。Caspase-8、Caspase-9活性形式的出現(xiàn)說明在我們所選用的藥物濃度條件下，As2O3可以誘導(dǎo)兩株細(xì)胞凋亡信號(hào)激活，并最終激活了細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者caspase-3。在這兩株細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑中的起始因子Caspase-8和線粒體途徑中的起始因子Caspase-9在As2O3處理后都出現(xiàn)了基因及蛋白水平的表達(dá)增強(qiáng)，表明這兩條凋亡途徑都被激活。

細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，NB4細(xì)胞在As2O3處理24h、48h、72h后，早中期細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比分別顯著增加，見圖2A-D；HL-60細(xì)胞在同樣的時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比無明顯變化，見圖2E-H。說明這兩株細(xì)胞對(duì)As2O3誘導(dǎo)的凋亡敏感度有顯著區(qū)別，NB4對(duì)As2O3誘導(dǎo)凋亡高度敏感，而HL60對(duì)As2O3誘導(dǎo)凋亡則是耐受的。

HL-60和NB4相比較，在對(duì)As2O3細(xì)胞增殖生長(zhǎng)抑制敏感度方面接近，但在As2O3誘導(dǎo)的凋亡敏感度方面，NB4顯著敏感于HL-60。并且，HL-60在As2O3處理后凋亡通路被激活卻沒有明顯的凋亡現(xiàn)象。為了解釋這些現(xiàn)象，檢測(cè)了凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促進(jìn)基因Bax在基因及蛋白水平的表達(dá)情況及凋亡抑制基因Survivin在基因水平的表達(dá)情況。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起著非常重要的作用, 它們通過維持抗凋亡、促凋亡成員的平衡來維持線粒體膜的完整性[9],細(xì)胞中單獨(dú)的Bcl-2表達(dá)水平的下降或Bax表達(dá)水平的上升并不能決定細(xì)胞是否凋亡，而Bcl-2/Bax比值的降低則表明細(xì)胞走向凋亡[10-11]。Survivin蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)Survivin基因可以直接抑制Caspase-3和 Caspase-7的活性，從而阻斷細(xì)胞的凋亡過程[12]。研究結(jié)果顯示在兩株細(xì)胞中其Survivin基因?yàn)楦弑磉_(dá)，說明與文獻(xiàn)報(bào)道的造血系統(tǒng)腫瘤經(jīng)常存在Survivin過度表達(dá)情況一致[13]。

As2O3處理NB4細(xì)胞后，與Survivin基因和Bcl-2基因表達(dá)快速下調(diào)。Survivin基因表達(dá)的下調(diào)解除了對(duì)線粒體中細(xì)胞色素C釋放及Caspase-3 活性的的抑制,消除了凋亡抑制環(huán)節(jié)；同時(shí)NB4細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下降，且Bcl-2/bax比值下降，意味著線粒體膜通透增加，有利于細(xì)胞色素C的釋放，促進(jìn)凋亡信號(hào)的傳遞[14]，在NB4細(xì)胞中，As2O3從抑制Survivin基因表達(dá)和上調(diào)Bcl-2/bax比值兩個(gè)方面，解除抑制凋亡因素，促進(jìn)凋亡信號(hào)沿著線粒體途徑向下傳遞。這是NB4細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的重要原因。而在HL-60細(xì)胞中，Bcl-2表達(dá)量是NB4中表達(dá)量的4～9倍，并且隨著As2O3處理時(shí)間增加而上調(diào)；同時(shí)Bcl-2/bax比值也在As2O3處理過程中沒有明顯的變化，表明線粒體途徑在在As2O3處理過程仍然被高表達(dá)的Bcl-2抑制；表達(dá)量未明顯下降的Survivin同樣是抑制HL-60細(xì)胞中線粒體途徑的重要因素。HL-60細(xì)胞株中Caspases-9活性形式的出現(xiàn)較晚，也可以證實(shí)該細(xì)胞中線粒體途徑被抑制。HL-60細(xì)胞中，Caspase-3、Caspase-8在12h時(shí)就出現(xiàn)了活性形式，而Caspases-9活性形式的出現(xiàn)較晚，說明HL-60細(xì)胞在As2O3誘導(dǎo)12h內(nèi)死亡受體途徑最先激活，并且由此途徑激活了Caspase3,而線粒體途徑在As2O3誘導(dǎo)72h后才被激活。雖然 12h 后HL60細(xì)胞中就出現(xiàn)了活性形式的Caspase3，但由于Survivin基因表達(dá)未顯著下降，細(xì)胞內(nèi)的Survivin蛋白抑制了Caspase3的活性，使得凋亡信號(hào)的向下傳導(dǎo)被阻斷，所以HL-60并沒有走向凋亡。這些研究結(jié)果提示： 在NB4細(xì)胞中，As2O3通過線粒體途徑和死亡受體途徑有效地誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞凋亡；而在HL-60細(xì)胞中，Bcl-2及Survivin不能被As2O3有效地抑制，線粒體途徑的激活被顯著延滯，通過死亡受體途徑產(chǎn)生的活性形式的Caspase3也被Survivin抑制了活性，導(dǎo)致了HL60細(xì)胞凋亡的抑制。

兩種細(xì)胞在p53基因的細(xì)胞遺傳學(xué)變異上有顯著的區(qū)別[15]，NB4細(xì)胞中存在野生型p53基因的突變，HL60細(xì)胞中p53基因缺失，NB4細(xì)胞中有突變型p53基因及蛋白的表達(dá)，HL60細(xì)胞中則沒有p53基因及蛋白的表達(dá)，并且這兩種細(xì)胞都存在Survivin基因的過度表達(dá)[16]。Survivin與p53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，兩者之間的關(guān)系密切，通過直接相互作用及p2l-Rb-E2F信號(hào)通路等相互作用。有研究表明野生型p53在體內(nèi)可與Survivin啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制Survivin基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)及p53基因的突變，由于顯性負(fù)效應(yīng)作用，突變型P53蛋白抑制了野生型p53蛋白的功能，喪失了對(duì)Survivin基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而可以使Suvivin基因的異常高表達(dá)[17-18]。

As2O3處理后，NB4細(xì)胞中p53基因的表達(dá)量沒有明顯變化,見圖4C，但突變型P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的水平呈現(xiàn)出顯著的下降,見圖5。說明As2O3降低了突變型P53蛋白對(duì)野生型P53正常生理功能的抑制。已有的研究證實(shí)As2O3通過破壞PML及PML-NBs降解PML/RARa，從而保護(hù)P53正常的生理功能[19]。Joe等研究結(jié)果也顯示，在NB4細(xì)胞中As2O3通過P53途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。據(jù)此可推斷出As2O3誘導(dǎo)后,NB4細(xì)胞中野生型P53的功能得到恢復(fù)，有效抑制了Survivin基因的表達(dá)，從而解除了Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制,使NB4細(xì)胞最終走向凋亡。HL60細(xì)胞中直接抑制Survivin基因表達(dá)的p53基因缺失，造成As2O3不能通過p53信號(hào)通路直接抑制Survivin基因表達(dá)，所以，HL-60細(xì)胞在As2O3誘導(dǎo)后Survivin基因下調(diào)不顯著。由于As2O3誘導(dǎo)HL-60走向分化的同時(shí)也顯著下調(diào)C-myc基因表達(dá)，所以HL-60細(xì)胞增殖被顯著抑制[21]。但高表達(dá)的Survivin基因制仍然繼續(xù)抑制細(xì)胞凋亡途徑。這可能是NB4和HL60細(xì)胞對(duì)As2O3的細(xì)胞增殖抑制率相近，而對(duì)Al2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率差異顯著的原因之一。

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Mechanisms of arsenic trioxide-induced apoptosis in NB4 and HL60 cells

ZHANGXue-lian1，ZHOUZun-hai1，ZHANGLi-qiang3,WANGBo1，JIAYu-fang4，LIANGAi-bin2

(1. Dept. of Endocrinology， Yangpu Hospital, Tongji University， Shanghai 200090， China； 2. Dept. of Hematology， Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065， China； 3. Shanghai Cellgene bio Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201203, China； 4. Dept. of Gynecology， Jining First People’s Hospital， Jining 272011, Shandong Province, China)

Objective To investigate the mechanism of arsenic trioxide (As2O3) -induced apoptosis in acute promyelocytic leukemia(APL)NB4 and HL60 cells．Methods NB4 and HL60 cells were treated with As2O3at different concentrations. Cell proliferation was determined by WST-8 assay. The apoptosis rate was detected by flow cytometry with annexinV-FITC/PI double staining．The mRNA expression of apoptosis-related genes caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2,Bax, the proto-oncogene C-myc, survivin, p53 and granulocytes differentiation antigen CD11b was detected by RT-PCR. The expression of apoptosis-related proteins caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2，Bax was determined by Western blotting. Results Arsenic trioxide proliferation of NB4 and HL60 cells with similar sensitivity. As2O3induced apoptosis of NB4 cells, but induced HL-60 differentiation to mature stage. Western blot detection and RT-PCR results showed that As2O3treatment caused up-regulation of Bax, caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, CD11b mRNA levels, and protein levels of caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 in both cell lines. The expression of survivin, C-myc, Bcl-2 and mutated p53 in NB4 cells treated with As2O3significantly decreased. The expression of C-myc in HL60 cells treated with As2O3significantly decreased, but survivin and Bcl-2 expression levels were not changed. Conclusion Arsenic trioxide can effectively inhibit proliferation of NB4 and HL60 cells, and induce apoptosis of NB4 cells, while induce HL-60 differentiation to mature stage. These effects may be associated with the altered expression of survivin, Bcl-2 and mutated p53 genes.

arsenic trioxide; cell apoptosis; NB4； HL-60; survivin; p53

10.16118/j.1008-0392.2016.03.002

2015-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270615)；上海市衛(wèi)生局科研基金(20134470)

張雪蓮(1979—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail: 13761219860@163.com

梁愛斌.E-mail： 1ab7182@#edu.cn

R 551

A

1008-0392(2016)03-0008-08