謝玲紅 顧棟樺

1.浙江省湖州市計(jì)劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站(313000)；2.浙江省湖州市中心醫(yī)院

·臨床研究·

宮頸液基細(xì)胞學(xué)樣本中DAPK基因甲基化的檢測(cè)及臨床意義

謝玲紅1顧棟樺2

1.浙江省湖州市計(jì)劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站(313000)；2.浙江省湖州市中心醫(yī)院

目的：探討在液基細(xì)胞學(xué)樣本中檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌及其癌前病變的DAPK基因的甲基化臨床意義。方法：收集2014年6月～2015年6月在本單位就診或體檢婦女的宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查樣本231例，在滿足細(xì)胞學(xué)診斷后，用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)樣本中DAPK基因的甲基化狀態(tài)，同時(shí)做宮頸組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：總體樣本中宮頸液基細(xì)胞學(xué)DAPK基因的甲基化率為16.9%(39/231)，NILM、ASC-US、LISL、HISL、SCC各組中，DAPK基因的甲基化率分別為3.8%(2/53)、3.9%(2/52)、13.8%(8/58)、37.1%(23/62)、66. 7%(4/6)，HISL組和SCC組基因甲基化率高于NILM、ASC-US和LISL組。根據(jù)宮頸組織病理學(xué)診斷結(jié)果，宮頸炎、宮頸濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)各組中，DAPK基因的甲基化率分別為3.6%(2/55)、4.0%(2/50)、24.8%(28/113)、53.9%(7/13)，SCC組和CIN組DAPK基因甲基化率高于宮頸炎組和宮頸濕疣組；SCC組基因甲基化率高于CIN組。CINⅢ組DAPK基因甲基化率高于CINⅠ及CINⅡ組，而CINⅠ及CINⅡ組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：宮頸液基細(xì)胞學(xué)樣本中，SCC和HISL的DAPK基因的甲基化率相對(duì)較高，臨床上可以利用少量液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)樣本，作為診斷宮頸癌及癌前病變的輔助診斷指標(biāo)。

甲基化；DAPK基因；宮頸液基細(xì)胞

宮頸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一[1]。宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查作為早期篩查方法，能夠發(fā)現(xiàn)宮頸癌的早期病變，但非宮頸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其準(zhǔn)確率有待進(jìn)一步提高。利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞以提高細(xì)胞學(xué)診斷效果，對(duì)促進(jìn)宮頸癌早期病變篩查具有重要意義。死亡蛋白相關(guān)激酶(DAPK)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要蛋白，可以通過(guò)多種途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡[2]。有研究表明，在許多腫瘤組織中DAPK基因啟動(dòng)子區(qū)域存在高頻率的甲基化狀態(tài)[3-6]，宮頸癌組織中DAPK基因也存在著高甲基化狀態(tài)，并且DAPK基因的甲基化可以做為一個(gè)宮頸癌預(yù)后判斷的標(biāo)志[7-8]。本研究應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測(cè)宮頸液基細(xì)胞學(xué)樣本中的DAPK基因的甲基化狀態(tài)，探討其對(duì)宮頸癌及早期病變的診斷價(jià)值以及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年6月～2015年6月在湖州市中心醫(yī)院及市計(jì)劃生育指導(dǎo)站就診或體檢婦女的宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查樣本，平均年齡43(21～65)歲。細(xì)胞學(xué)診斷采用TBS分類系統(tǒng)，均有宮頸組織病理學(xué)診斷。

1.2 方法

將所有宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查樣本置于細(xì)胞保存液(Hologic公司，美國(guó))中，樣本用于液基細(xì)胞病理學(xué)診斷后；剩余部分置4℃保存，用于DAPK基因甲基化的檢測(cè)。

1.2.1 DNA的提取及修飾 DNA提取使用美國(guó)QIAGEN公司的DNA抽提試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟操作，提取的DNA樣本經(jīng)SmartSpec plus核酸蛋白測(cè)定儀(BIO-RAD公司，美國(guó))測(cè)定濃度后，置-20℃冰箱保存。取2μg細(xì)胞DNA加入50μl的0.2mmol/L NaOH溶液中，37℃孵育10min，再加入3 mol/L亞硫酸氫鈉(PH 5.0)520μl與10 mmol/L氫醌30μl混合液，50℃孵育16h進(jìn)行堿基修飾。修飾后的DNA用DNA純化試劑盒(上海生工公司)純化，并測(cè)定濃度后在-20℃保存。宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞DNA做為陽(yáng)性對(duì)照，空白液基細(xì)胞保存液做為陰性對(duì)照。

1.2.2 PCR檢測(cè) DAPK甲基化基因的引物：上游引物 5'-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3'；下游引物 5'-CCC TCC CAA ACG CCG A-3'。 DAPK非甲基化基因的引物：上游引物 5'- GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3'；下游引物 5'- CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度106bp。引物由上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系包括10×PCR Buffer 2μl、MgCl2(25mmol/L) 2μl、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)混合物(2mmol/L) 2μl、上游引物(10μmol/L)2μl、下游引物(10μmol/L)2μl、Taq酶 0.2μl、模板DNA 4μl，加滅菌水至20μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，38個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，至4℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理分析，各組間比較使用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本收集情況

共收集樣本231例，其中高度上皮內(nèi)病變(HISL)62例，低度上皮內(nèi)病變(LISL)58例，意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)52例，未見(jiàn)上皮內(nèi)病變/惡性細(xì)胞(NILM)53例，鱗狀細(xì)胞癌(SCC) 6例。

2.2 標(biāo)本中DAPK基因的甲基化檢測(cè)

樣本中DAPK基因經(jīng)甲基化引物擴(kuò)增后，在瓊脂糖凝膠上可觀察到106bp電泳條帶。由于樣本中混有正常的上皮細(xì)胞和其它細(xì)胞，且DAPK基因?yàn)殡s合性甲基化狀態(tài)，所以用非甲基化引物仍可擴(kuò)增出同樣大小的電泳條帶。而不存在DAPK基因甲基化的樣本中，只能觀察到非甲基化引物擴(kuò)增的條帶(圖1)。在231例樣本中共發(fā)現(xiàn)39例樣本存在DAPK基因的甲基化狀態(tài)，總樣本的DAPK基因甲基化率為16.88%。

2.3 不同細(xì)胞學(xué)診斷中DAPK基因的甲基化情況

不同細(xì)胞學(xué)診斷組織中DAPK基因甲基化率見(jiàn)表1。NILM組、ASC-US組與LISL組間基因甲基化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，HISL組和SCC組基因甲基化比例均高于NILM組(χ2=18.65、P=0.00，χ2=23.34、P=0.00)和ASC-US組(χ2=18.26、P=0.00，χ2=22.89、P=0.00)，HISL組和SCC組基因甲基化比例也高于LISL組(χ2=8.49、P=0.00，χ2=9.98、P=0.00)，HISL組和SCC組間無(wú)差異(χ2=1.998、P=0.16)。

U非甲基化引物PCR產(chǎn)物 M甲基化引物PCR產(chǎn)物

圖1 DAPK基因的甲基化特異性PCR檢測(cè)

2.4 不同病理學(xué)診斷組織中DAPK基因甲基化情況

不同病理學(xué)診斷組織中DAPK基因的甲基化率見(jiàn)表1。 DAPK基因甲基化率在宮頸炎組與宮頸濕疣組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.01，P=0.92)，CIN組高于宮頸炎組和宮頸濕疣組(χ2=11.27，P=0.00；χ2=9.99，P=0.00)，SCC組也高于宮頸炎組和宮頸濕疣組(χ2=23.08，P=0.00；χ2=20.94，P=0.00)，并高于CIN組(χ2=4.91，P=0.03)。CINⅢ組中甲基化率高于CINⅠ及CINⅡ組(χ2=11.31，P=0.00；χ2=4.04，P=0.04)，而CINⅠ與CINⅡ組間甲基化率無(wú)差異(χ2=1.45，P=0.23)。見(jiàn)表1。

表1 不同診斷方法下診斷結(jié)果及DAPK基因甲基化情況(例)

3 討論

宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素影響的復(fù)雜過(guò)程。腫瘤的形成與基因功能的表達(dá)失調(diào)有關(guān)，既有癌基因的異常激活，也有抑癌基因的抑制失活，基因啟動(dòng)子的甲基化是抑癌基因失活的一個(gè)重要機(jī)制[9]。DAPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要蛋白，可以通過(guò)多種途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡[2]。趙先蘭等[10]對(duì)宮頸組織研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸炎-CIN-鱗狀細(xì)胞癌的疾病譜中DAPK基因的甲基化率呈明顯增高趨勢(shì)，認(rèn)為DAPK基因的甲基化在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起著重要作用。但目前對(duì)宮頸癌DAPK基因的甲基化研究大多以組織材料為主，而采用宮頸脫落細(xì)胞研究較少。本研究在液基細(xì)胞學(xué)樣本中成功檢測(cè)到DAPK基因甲基化狀態(tài)。在臨床檢驗(yàn)工作中許多液基細(xì)胞學(xué)樣本在制作完液基薄片后常有剩余，而PCR是一種較敏感的甲基化檢測(cè)方法。因此，在臨床實(shí)際工作中對(duì)液基細(xì)胞學(xué)樣本檢測(cè)DAPK基因甲基化是可行的。

本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，在宮頸炎、宮頸濕疣、宮頸CIN、宮頸鱗狀細(xì)胞癌病理診斷下，其DAPK基因的甲基化率不盡相同，在CIN病變中明顯升高，提示DAPK基因的甲基化可能是宮頸鱗癌發(fā)生過(guò)程中的早期狀態(tài)。在宮頸上皮內(nèi)瘤變中，CINⅢ與宮頸鱗癌的關(guān)系更為密切，而CINⅢ病變更易發(fā)展為鱗狀細(xì)胞癌。本研究結(jié)果顯示，CINⅢ組DAPK基因的甲基化率明顯高于CINⅠ及CINⅡ組，而細(xì)胞病理診斷HISL的病變包含了CINⅡ和CINⅢ兩種病變，所以如果檢測(cè)到DAPK基因存在甲基化狀態(tài)，同樣是HISL的患者可能更需要得到臨床的重視。因此，利用液基細(xì)胞學(xué)樣本檢測(cè)DAPK基因的甲基化對(duì)宮頸病變的診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，甲基化特異性PCR在宮頸液基細(xì)胞學(xué)樣本中能夠檢測(cè)到DAPK基因的甲基化狀態(tài)，且該檢測(cè)對(duì)在宮頸癌及癌前病變的診斷具有一定的輔助診斷價(jià)值。

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[責(zé)任編輯：董 琳]

Detection of DNA methylation of DAPK gene in cervical liquid-based cytology specimens and its clinical significance

XIE Linghong1, GU Donghua2

1.Publicity&EducationTechnicalAdvisingCenterforFamilyPlanningofHuzhouCity,Zhejiang313000；2.HuzhouCityCentralHospital

Objective: To explore the clinical significance of DAPK gene methylated in detecting squamous cell carcinomas and squamous intraepithelial lesions of cervical liquid-based cytology specimens. Method: From June 2014 to June 2015, 231 liquid based cervical cytology samples from women who had visited hospital or had

physical examination were collected. After Cytological diagnosis, the residual specimens were used to examine methylation of DAPK gene by methylation-specific polymerase chain reaction approach. Result: The total rate of DAPK gene methylation was 16.9% (39/231). Rate of DAPK gene methylation in NILM group, ASC - US group, LISL group, HISL group, or SCC group was 3.8% (2/53), 3.9% (2/52), 13.8% (8/58), 37.1% (23/62), 66.7% (4/6), respectively. The rate of DAPK gene methylation in SCC or HISL group was significantly higher than that in NILM, ASC-US or LISL group. According to cervical biopsy specimens examination, the rate of DAPK gene methylation in chronic cervicitis group, cervical condylomata group, CIN or SCC group was 3.64%(2/55), 4.00%(2/50), 24.78%(28/113), 53.85%(7/13), respectively. The rate of DAPK gene methylation in SCC group or CIN group was significantly higher than that in chronic cervicitis or cervical condylomata group, and the rate of DNA methylation in SCC group was higher than that in CIN group. For CIN samples, The rate of DAPK gene methylation was significantly in CINⅢ group was higher than that in CINⅠgroup and CINⅡgroup, but there was no significant difference between CINⅠgroup and CIN Ⅱgroup. Conclusion: In liquid based cervical cytology samples, The DNA methylation of DAPK gene in HSIL group or SCC group is higher, so detection of DAPK gene methylation can be as an auxiliary diagnostic indicator to cervical cancer and precancerous lesions.

Methylation ；DAPK gene；Cervical liquid-based cytology

2016-05-23

2016-08-02

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.10