石 亮，張 晨，向志光，鄧儀晨，蘇靜芬，劉云波

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871）

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腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的狨猴P53基因沉默

石 亮1，張 晨2，向志光1，鄧儀晨1，蘇靜芬1，劉云波1

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871）

【摘要】目的 在細(xì)胞和整體動(dòng)物水平，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)絨猴p53基因表達(dá)。方法 對(duì)狨猴p53基因做生物信息學(xué)分析，針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)shRNA干擾序列，構(gòu)建在腺相關(guān)病毒載體上，轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞（cos-7），在細(xì)胞水平用熒光定量PCR檢測(cè)p53mRNA抑制效果，以Western blot方法檢測(cè)p53蛋白水平表達(dá)變化；優(yōu)選shRNA干擾序列，包裝含shRNA干擾序列的8型腺相關(guān)病毒，靜脈注射感染狨猴；手術(shù)取少量肝臟組織，用Western blot和免疫組化方法檢測(cè)p53蛋白水平的變化。結(jié)果 細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)有效RNA干擾靶點(diǎn)，mRNA干擾效率分別為（82.7±8.1）%和（80.7±7.5）%（P＜0.05）；蛋白表達(dá)下調(diào)（77.3±11.5）%和（73.7±10.7）%（P＜0.05）；2只絨猴感染病毒后，經(jīng)活體熒光成像分析可見病毒在肝臟、睪丸、頸部等位置分布，狨猴肝臟P53蛋白經(jīng)Western blot、免疫組化分析未見明顯變化。結(jié)論 本研究在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)絨猴P53基因表達(dá)下調(diào)，但整體動(dòng)物水平狨猴肝臟P53蛋白表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯變化；今后需在感染方式等方面做進(jìn)一步優(yōu)化。

【關(guān)鍵詞】AAV8；P53；RNA干擾；狨猴

RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，廣泛應(yīng)用于基因功能研究與基因治療領(lǐng)域。利用RNAi的方法已經(jīng)成功在嚙齒類動(dòng)物的受精卵中下調(diào)基因的表達(dá)，建立相關(guān)的動(dòng)物模型［1］，但是在狨猴上還沒(méi)有相應(yīng)研究。腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）是一種重要的基因載體，主要用于基因治療、基因功能研究、動(dòng)物模型建立，相對(duì)慢病毒、腺病毒等病毒載體有著它獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，安全性高、免疫原性低、長(zhǎng)期表達(dá)等［2］?？梢岳肁AV介導(dǎo)RNA干擾實(shí)現(xiàn)動(dòng)物水平基因表達(dá)的改變。P53是一種重要的腫瘤抑制基因。在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變，他們中的大多數(shù)是錯(cuò)義突變進(jìn)而減少p53腫瘤抑制活性。研究表明p53除了具有腫瘤抑制功能外，還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、參與免疫反應(yīng)等多種生理過(guò)程［3］。相關(guān)的研究主要集中在嚙齒類動(dòng)物，但由于與人親緣性較遠(yuǎn)，應(yīng)用受到許多因素的限制。狨猴是一種很小的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其生理學(xué)、行為學(xué)以及細(xì)胞因子激素水平等與人非常相似。因此研究非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物基因調(diào)控對(duì)于基因功能與疾病治療具有重要意義。在細(xì)胞水平上的驗(yàn)證，由于狨猴細(xì)胞系較少且轉(zhuǎn)染效率不高，選用cos-7細(xì)胞，設(shè)計(jì)的干擾靶點(diǎn)序列與非洲綠猴p53基因完全同源［4］。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，以AAV為載體，希望在狨猴體內(nèi)下調(diào)p53蛋白，進(jìn)而研究p53基因及下游相關(guān)基因功能，以期建立一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的基因調(diào)控的策略。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

狨猴3只，體重分別為345 g、355 g、360 g，年齡分別為2歲9月、3歲1月、3歲3月，全部雄性，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北方資源中心提供。飼養(yǎng)條件：溫度25℃ ～30℃，濕度45% ～80%，12 h照明/12 h黑暗（8：00～20：00亮燈），單籠飼養(yǎng)，自由飲水，早晚喂食，中午喂食水果。

1.2P53基因shRNA干擾載體構(gòu)建

根據(jù)狨猴p53基因的序列，依照shRNA的設(shè)計(jì)原則在Life Technology在線設(shè)計(jì)若干靶點(diǎn)的shRNA序列。將目的片段構(gòu)建載體質(zhì)粒PAAV-luciferaseshRNA上，轉(zhuǎn)化，酶切鑒定，測(cè)序。測(cè)序引物為U6-F：5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3'。對(duì)照組選用不和任何基因同源性的Scramble序列。

1.3熒光定量PCR

提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行SYBR-Green法熒光定量 PCR。P53基因所用引物為 F：5'-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3'，R：5'-CTCCGTCA TGTGCTGTGACT-3'預(yù)計(jì)擴(kuò)增出220 bp的目的片段，內(nèi)參基因GAPDH所用引物F：5'-ACATCATCC CTGCCTCTACTGG-3'，R：5'-AGTGGGTGTCGCT GTTGAAGTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度260 bp［5］。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s共 40個(gè)循環(huán)。同一樣品做三次重復(fù)，采用2-△△Ct進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4Western Blot

裂解細(xì)胞或組織，測(cè)定濃度，取相同量蛋白與buffer混勻，沸水煮5 min變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4°C孵育過(guò)夜，二抗室溫1 h，進(jìn)行曝光。最后結(jié)果用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.5AAV8的包裝

AAV載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（8型）三質(zhì)粒法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，離心棄除雜質(zhì)，過(guò)濾除菌，濃縮，純化，QPCR測(cè)定病毒滴度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6病毒注射動(dòng)物

一只作為對(duì)照組，注射含有scramble序列的對(duì)照病毒。兩只作為實(shí)驗(yàn)組，注射含有shRNA1的病毒。按照其體重以2×1012vg/kg后肢靜脈注射［6］。在注射后的1 d、1周、2周、3周進(jìn)行活體熒光成像檢測(cè)，監(jiān)測(cè)病毒的侵嗜情況。四周后，鹽酸氯胺酮（3 mg/kg）肌內(nèi)注射麻醉動(dòng)物，手術(shù)取米粒般大小的肝臟組織。Western blot和免疫組化方法檢測(cè)肝臟p53蛋白水平的變化情況。

1.7免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育 10 min，PBS浸泡5 min，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液微波爐修復(fù)，5% 山羊血清封閉 30 min，滴加一抗（p53抗體，1∶100）37℃孵育2 h，PBS沖洗，先后滴加適量二抗工作液I和II，PBS沖洗。DAB顯色，自來(lái)水沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著性。

2　結(jié)果

2.1腺相關(guān)病毒shRNA干擾載體構(gòu)建

根據(jù)狨猴p53基因序列信息和shRNA干擾序列設(shè)計(jì)基本原則，設(shè)計(jì)出兩個(gè)有效靶點(diǎn)。靶點(diǎn)序列與我們?cè)诩?xì)胞水平驗(yàn)證的非洲綠猴p53基因完全同源。具體序列信息和對(duì)應(yīng)狨猴p53基因的位置見表1。

圖1　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后熒光表達(dá)圖（×40，標(biāo)尺=50 μm）Note.A：Under an ordinary microscope.B：Under a fluorescent microscope.Fig.1 The fluorescence image of plasmid expression at 48 hours after transfection.（×40，Bar=50 μm）

2.2細(xì)胞水平p53基因沉默效率檢測(cè)

為驗(yàn)證設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列的有效性，轉(zhuǎn)染干擾序列的質(zhì)粒48 h后，對(duì)照質(zhì)粒中含有GFP報(bào)告基因，在熒光顯微鏡下驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，證明構(gòu)建的含干擾序列的質(zhì)粒成功進(jìn)入細(xì)胞，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

熒光定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct進(jìn)行分析。如圖2所示，對(duì)應(yīng)的2個(gè)靶點(diǎn)序列p53基因mRNA表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。其中shRNA1 mRNA水平沉默效率（82.7±8.1）%，shRNA2 mRNA水平沉默效率為（80.7±7.5）%。兩個(gè)靶點(diǎn)對(duì)p53基因在mRNA水平均有明顯的沉默效率。

Western blot結(jié)果用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。如圖3所示，對(duì)應(yīng)的2個(gè)靶點(diǎn)序列p53蛋白表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。其中shRNA1蛋白水平沉默效率（77.3±11.5）%，shRNA2蛋白水平沉默效率為（73.7±10.7）%。兩個(gè)靶點(diǎn)對(duì)p53蛋白有明顯的降低，蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)結(jié)果基本保持一致。

2.3活體熒光成像

活體熒光成像技術(shù)檢測(cè)病毒在狨猴體內(nèi)的侵嗜情況。見圖4，上下兩只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物都注射含有PAAV-luciferase-shRNA病毒。可以發(fā)現(xiàn)注射病毒后1 d睪丸處就有少量熒光，1周后頸部位置也出現(xiàn)熒光，3周后可以看見后肢大腿、頸部、睪丸、腹部等都有不同程度的熒光。證明病毒進(jìn)入對(duì)應(yīng)位置，相應(yīng)熒光位置有高效的侵嗜性，可以推測(cè)肝臟有病毒的侵嗜。

圖2　P53基因mRNA表達(dá)Note.*compared with the control group（P＜0.05）Fig.2 The mRNA expression of P53 gene

2.4肝臟組織p53基因沉默效率檢測(cè)

免疫組化方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組p53蛋白的變化，如圖5所示，p53蛋白在正常的肝臟組織中表達(dá)很低，只有少量肝臟細(xì)胞有核染色，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異。采用Western blot方法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中p53蛋白水平的變化。如圖6所示，通過(guò)Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，實(shí)驗(yàn)組 p53蛋白水平沉默效率為（7.3± 8.9）%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）不能證明有蛋白水平變化。

圖3　P53蛋白表達(dá)Note.A：Western blot image.B：The results of gray scale analysis.*Compared with the control group（P＜0.05）.Fig.3 The expression of p53 protein

3　討論

狨猴是最小型的實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其體型小、繁殖快、遺傳進(jìn)化及生理生化方面與人類相近，是人類疾病研究的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，常用于神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)、藥物毒理、腫瘤等方面研究［7］。目前利用靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立穩(wěn)定的基因調(diào)控方法還面臨巨大的困難，如基因敲除方法面臨陽(yáng)性打靶率低和移植成活率不高以及缺陷基因造成胚胎致死。本研究希望利用RNAi技術(shù)在狨猴體內(nèi)實(shí)現(xiàn)p53基因表達(dá)的下調(diào)。在細(xì)胞水平的驗(yàn)證，由于狨猴的細(xì)胞系較少并且體外轉(zhuǎn)染效率較低，所以選用cos-7細(xì)胞，設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列在狨猴和非洲綠猴都完全同源，都位于p53基因的開放閱讀框中。

圖4　注射病毒后活體熒光圖像（標(biāo)尺=500 μm）Note.Fluorescent colors represent the degree of invaded viruses：red＞yellow＞green，the deeper color means a higher degree virus invasion.（Bar=50 μm）Fig.4 In vivo fluorescence imaging after injection of virus

AAV由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣（分裂和非分裂細(xì)胞）、免疫源性低、在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)［8］，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。目前AAV有幾十種不同的血清型，各個(gè)血清型對(duì)組織細(xì)胞有不同侵嗜性。AAV-8對(duì)肝臟、肌肉等有很強(qiáng)的親和性，活體熒光成像的結(jié)果與前期研究基本相同［9］。肝臟部位只有少量熒光，可能由于熒光透射性較弱或者病毒注射量偏少。手術(shù)取少量肝臟組織，不會(huì)造成動(dòng)物的死亡而進(jìn)行后續(xù)研究。在肝臟中沒(méi)有檢測(cè)到p53蛋白的變化，后續(xù)需要在感染方式與序列靶點(diǎn)做進(jìn)一步優(yōu)化，以及處死動(dòng)物檢測(cè)睪丸、大腿肌肉、頸部等位置p53蛋白是否變化。

圖5　狨猴肝臟組織p53蛋白免疫組化圖（×40，標(biāo)尺=100 μm）Note.The arrows indicate P53 protein immunohistochemical stainingFig.5 The p53 protein in the marmoset liver. （×40，Bar=100 μm）

圖6　注射病毒后狨猴肝臟p53蛋白表達(dá)Note.A：Western blot image.B：The results of gray scale analysis. #Compared with the control group（P＞0.05）Fig.6 The expression of liver p53 protein after injection of virus

綜上所述，本研究以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，利用8型腺相關(guān)病毒作為載體，在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)了p53蛋白的降低，在狨猴動(dòng)物水平的研究還需優(yōu)化條件與完善策略。

致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所檢測(cè)中心佟巍老師，劉先菊老師提供指導(dǎo)，感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所北方資源中心尚海全、肖沖、馬喜山等老師在實(shí)驗(yàn)操作的幫助。

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〔修回日期〕2016-02-25

Adeno-associated virus mediated p53 gene silence in marmosets

SHI Liang1，ZHANG Chen2，XIANG Zhi-guang1，DENG Yi-chen1，SU Jing-fen1，LIU Yun-bo1
（Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China；2.College of Life Science，Peking University，Beijing 100871）

【Abstract】Objective To decrease the p53 gene expression at cellular and animal levels in marmoset using RNA interference technique.Methods The shRNA interference sequences were designed and inserted into the adeno-associated virus vector plasmid after bioinformatics analysis.The plasmids were transfected into African green monkey kidney cos-7 cells.The suppression of p53 mRNA was detected by real-time PCR，and the changes of p53 protein expression were detected by Western bolt.The adeno-associated virus-8 was injected through the hind leg vein.The changes of p53 protein expression in the liver tissue was detected by Western blot and immunohistochemistry.Results We screened two RNA interference effective arget sequences.The expression of p53 mRNA was suppressed（82.7±8.1）%and（80.7± 7.5）%，respectively（P＜0.05），and the expression of p53 protein was decreased（77.3±11.5）%and（73.7± 10.7）%，respectively（P＜0.05）.The two marmosets after virus infection showed that there were virus distributions in the liver，testes，and neck detected by in vivo fluorescence imaging.The expression of p53 in the marmoset liver was detected by western blot，immunohistochemistry analysis showing no obvious changes.Conclusions In the present study，the decrease of P53 gene expression at cellular level is achieved，however，the liver P53 protein in the marmoset liver is not significantly changes.Further optimization of the way of infection is needed in the future.

【Key words】AAV8 virus；p53；RNA interference；Marmoset

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）04-0053-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.009

［基金項(xiàng)目］國(guó)家科技支撐計(jì)劃（No.2014BAI03B01）。

［作者簡(jiǎn)介］石亮（1988-），男，碩士研究生，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。

［通訊作者］劉云波，男，教授，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail：yunboliu@126.com。