吳 丹，馮 健，莫顯剛，劉應(yīng)才

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科，貴州貴陽 550004）

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技術(shù)方法

改良的乳小鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法

吳 丹1，馮 健1，莫顯剛2，劉應(yīng)才1

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科，貴州貴陽 550004）

【摘要】目的 建立一種穩(wěn)定而快速的乳小鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。方法 用多聚賴氨酸預(yù)包被處理培養(yǎng)皿，采用兩步法（0.25%胰酶4℃過夜，0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白的膠原消化液37℃短時(shí)多次消化），通過差速貼壁70 min+5-溴脫氧尿嘧啶的使用來純化心肌細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化，臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率，α-actinin特異性免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞并計(jì)算純度。結(jié)果心肌細(xì)胞形態(tài)良好，自發(fā)搏動，細(xì)胞成活率可達(dá)到98%，純度可達(dá)到95%。結(jié)論 本方法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞存活率高，純度高，是一種理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

【關(guān)鍵詞】乳小鼠；心肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)

目前，對于心血管疾病機(jī)制的研究，在器官與組織水平上，通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠建立的心血管動物模型作出了極大的貢獻(xiàn)；在細(xì)胞分子水平上，原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞作為一種體外實(shí)驗(yàn)研究模型無可替代，它既能夠排除神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌等因素的干擾而單獨(dú)地觀察研究心臟的發(fā)育以及心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制［1］，同時(shí)具有自發(fā)搏動性，保持了其在體內(nèi)的許多結(jié)構(gòu)和功能。關(guān)于嚙齒類動物心肌細(xì)胞培養(yǎng)要追溯到20世紀(jì)60年代，Harary and Farley［2］首次從成年大鼠分離培養(yǎng)出心肌細(xì)胞。近些年來，大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)越來越成熟，然而小鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)卻十分困難，由于心肌細(xì)胞為高度分化的近終末細(xì)胞［3］，喪失增殖分裂分化能力等特點(diǎn)，并且心肌細(xì)胞的培養(yǎng)存在存活率低、活力差、純度低、易于污染等問題，本實(shí)驗(yàn)基于以往乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)和方法加以改進(jìn)［4，5］，建立了一種新型的乳小鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，此方法高效，穩(wěn)定，能獲得大量的心肌細(xì)胞，活力好、存活率高、純度高。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料：出生0～3 d的乳小鼠，雌雄不限，SPF級 ，生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2013-17，使用許可證：SYXK（川）2013-181。由四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，恒溫水浴箱，顯微眼科手術(shù)剪刀、鑷子三套，倒置相差顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，恒溫離心機(jī)，澳洲胎牛血清（Bovogen），多聚賴氨酸，DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone），胰酶，II型膠原酶（Gibico），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）（Sigma），青鏈霉素雙抗，40 g/L多聚甲醛，Triton X-100（Amresco），α-actinin（博士德），Dylight488標(biāo)記的抗小鼠IgG（博士德），DAPI （Beyotime）。

1.1.2試劑的配制：配制含10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗的高糖DMEM/F12完全培養(yǎng)液，用完全培養(yǎng)液配制膠原消化液（0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳小鼠心肌細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)：

1.2.1.1心肌組織的分離：取出生0～3 d的乳小鼠20只，浸泡于75%的酒精中8～10 s消毒后迅速送入超凈工作臺，將其固定于無菌泡沫板上，用眼科剪將乳小鼠胸骨正中偏左的皮膚剪開，用鑷子分離皮膚，充分暴露胸部，換另一把眼科剪做一縱向切口打開胸腔，盡量不要超出第一次剪開的皮膚范圍，忌打開腹腔，以免引起污染，根據(jù)心臟的搏動，順勢將心臟擠出。

取心臟放入冰冷的PBS緩沖液中吹打清洗，盡量將紅細(xì)胞清洗干凈，用眼科鑷輔助眼科剪將多余的心房及周圍肺組織等去除，隨后將心臟移到另一個(gè)干凈的培養(yǎng)皿，將心臟剪裂2～3下（裂而不斷的程度即可），共清洗3遍。（此步驟在冰上操作）。

1.2.1.2心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：將心臟組織吸入玻璃培養(yǎng)瓶中，加入0.25%胰酶（含EDTA）10 mL，靜置，4°C過夜（12～16 h）。第2天，取出過夜的心臟組織，加入完全培養(yǎng)液 10 mL，37°C恒溫水浴5 min，中止胰酶的消化作用；棄去上清液，加入膠原消化液10 mL（注意棄上清液時(shí)勿把心臟組織吸走）。置于37°C的恒溫水浴箱，1 min用手輕搖。棄上清液，將心臟組織移入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入12 mL膠原消化液，置于37°C恒溫水浴箱上，用手輕搖30 min，將上清液移入新的離心管中。重復(fù)消化3～4次，僅見絮狀樣物質(zhì)即心肌組織消化徹底。將收集的上清液離心1 000 r/min 5 min，棄上清液，加完全培養(yǎng)液30 mL，輕輕拍打管壁使得細(xì)胞懸浮于其中，隨后接種在100 mm培養(yǎng)皿中，放于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育70 min，差速貼壁以除去成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等非心肌細(xì)胞。輕輕吸出細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染液染色計(jì)數(shù)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠猛耆囵B(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，加入BrdU使其在培養(yǎng)液的終濃度為0.1 mmol/L，輕輕混勻后，將其接種到在事先用多聚賴氨酸預(yù)包被處理過的6孔板中，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，換無BrdU的完全培養(yǎng)基，以后每隔48 h換液1次。

1.2.2臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率：取心肌細(xì)胞懸液90 μL加入0.4%臺盼藍(lán)染液10 μL均勻混合，靜置3 min左右后，取1～2滴已混勻的細(xì)胞懸液沿著蓋玻片邊緣滴入，將計(jì)數(shù)板放置于倒置相差顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，未著上色折光性強(qiáng)的圓形細(xì)胞為活的心肌細(xì)胞，染成藍(lán)色的為死細(xì)胞。隨機(jī)取4個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞的存活率（%）=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%，重復(fù)計(jì)數(shù)計(jì)算5次。

1.2.3心肌細(xì)胞搏動和形態(tài)學(xué)觀察：將心肌細(xì)胞接種到多聚賴氨酸預(yù)包被處理過的100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的搏動頻率、節(jié)律、強(qiáng)度，以判斷心肌細(xì)胞的活力，觀察心肌細(xì)胞的生長狀態(tài)、形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.2.4心肌細(xì)胞純度鑒定（α-actinin免疫熒光染色）：將心肌細(xì)胞以1～2×105的密度接種于預(yù)先放有經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)包被處理過的無菌玻片的24孔板中，制成細(xì)胞爬片；貼壁培養(yǎng)48 h后取出爬片，用0.01 mmol/L的 PBS緩沖液漂洗3次，（每次2 min）；以40 g/L的多聚甲醛固定液固定5～10 min，每孔加0.5 mL，吸去固定液，用0.01 mmol/L 的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；用3%Triton X-100室溫打孔通透30 min，吸去通透液，0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min（避免晃動）；加入200 μL 5%白蛋白37度孵育60 min，甩去多余液體，不洗；取1∶100稀釋的200 μL α-actinin抗體滴加到接種有心肌細(xì)胞的蓋玻片上，4°C冰箱過夜，用0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；滴加1：100稀釋的Dylight488標(biāo)記的抗小鼠IgG室溫避光孵育60 min，用0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；用DAPI染液進(jìn)行染核，室溫避光孵育3～5 min，0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；用吸水紙吸干爬片上的液體，滴加含抗熒光猝滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀察采集圖像，免疫熒光染色陽性的為心肌細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡下視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞總數(shù)，重復(fù)5次（陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù) ×100%）。

表1　心肌細(xì)胞存活率的測定Tab.1 Determination of the survival rate of cardiomyocytes

2　結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞分離純化、存活率測定及比較

實(shí)驗(yàn)顯示，用多聚賴氨酸預(yù)包被處理培養(yǎng)皿，采用兩步法（0.25%胰酶4°C過夜，0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白的膠原消化液37°C短時(shí)多次消化），可以獲得大量的心肌細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率可達(dá)98%以上（表1），明顯比傳統(tǒng)混合酶消化法（78.18%）、兩步法（90.47%）分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞存活率高（圖1）。此方法簡便、經(jīng)濟(jì)、細(xì)胞貼壁培養(yǎng)好，利用差速貼壁法［6］除去成纖維細(xì)胞等非心肌細(xì)胞以及加入化學(xué)試劑BrdU抑制殘余成纖維細(xì)胞的生長增殖［7］，在培養(yǎng)2～5 d后觀察視野中絕大多數(shù)細(xì)胞為搏動的心肌細(xì)胞或者連接成片的心肌細(xì)胞團(tuán)，未見明顯的成纖維細(xì)胞等非心肌細(xì)胞生長增殖。

圖1　3種方法培養(yǎng)心肌細(xì)胞的存活率及純度比較Fig.1 Survival rates and purity of the cardiomyocytes cultured by 3 methods.

2.2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及比較

剛分離消化下來的心肌細(xì)胞懸浮于細(xì)胞液中呈圓形或者橢圓形，培養(yǎng)2～4 h后細(xì)胞開始貼壁生長，剛開始細(xì)胞呈單個(gè)、圓形，6～8 h后偶見單個(gè)心肌細(xì)胞搏動，搏動頻率較慢，呈梭形。24 h后細(xì)胞幾乎完全貼壁且均勻分布，伸出偽足，呈梭形、星形或不規(guī)則多邊形（圖2A），細(xì)胞搏動明顯，頻率和節(jié)律不一致，約60～100次/min不等；48 h后細(xì)胞伸出的偽足相互形成交聯(lián)，成簇成團(tuán)，交織密集呈網(wǎng)狀（圖2B），呈同步收縮，約120～140次/min。通過多聚賴氨酸預(yù)包被培養(yǎng)皿 +兩步法分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞數(shù)目明顯比傳統(tǒng)混合酶消化法、兩步法分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞數(shù)目多（圖3）。

2.3心肌細(xì)胞純度鑒定及比較

在倒置熒光顯微鏡下可見：在胞漿中輔肌動蛋白（α-actinin）特異性染成綠色為免疫熒光染色陽性，DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色（圖4，5），證實(shí)是心肌細(xì)胞；細(xì)胞胞漿不著色，胞核呈藍(lán)色的為非心肌細(xì)胞。結(jié)果顯示95%以上的細(xì)胞中α-actinin染色都為陽性（表2），純度明顯高于傳統(tǒng)混合酶消化法（75%）、兩步法（89.75%）分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞（圖1，5），可見該方法分離培養(yǎng)得到的心肌細(xì)胞純度高，少見其他非心肌細(xì)胞的生長。

圖2　普通光學(xué)顯微鏡下心肌細(xì)胞（標(biāo)尺=200 μm）（A）Cardiomyocytes cultured for 24 hours；（B）Cardiomyocytes cultured for 48 hoursFig.2 Cardiomyocytes observed under a light microscope（Bar=200 μm）

圖3　普通光學(xué)顯微鏡下3種方法分別培養(yǎng)48h的心肌細(xì)胞（標(biāo)尺=200 μm）（A）Traditional mixed enzyme digestion method；（B）Two-step method；（C）The polylysine pre-packs culture dish+two-step methodFig.3 Cardiomyocytes cultured for 48 hours in 3 methods，observed under a light microscope（Bar=200 μm）

表2　心肌細(xì)胞純度（±s，n=10）Tab.2 Purity of the cardiomyocytes（±s，n=10）

表2　心肌細(xì)胞純度（±s，n=10）Tab.2 Purity of the cardiomyocytes（±s，n=10）

實(shí)驗(yàn)次數(shù)Experiment times心肌細(xì)胞純度/% Purity of cardiomyocytes/% 1 95.31±1.45 2 95.52±2.01 3 95.28±1.83 4 95.44±1.95 5 95.61±2.31

3　討論

近年來，關(guān)于心血管疾病研究的各領(lǐng)域，基于心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)的信號通路、離子通道、基因表達(dá)等方面的探索研究，在細(xì)胞與分子水平揭示心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及防治機(jī)制起著不可替代的作用。心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)儼然已成為心血管研究中的一種根本方法和重要技術(shù)。目前，對于成年鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)相對難度系數(shù)大，因此，乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)更加應(yīng)用廣泛。然而，乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)各個(gè)過程極易受各種處理因素及相關(guān)操作水平的干擾，一直存在心肌細(xì)胞的貼壁率低、成活率低、搏動率少以及純度低等諸多不足，這些將會對隨后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大的影響，因此如何使消化分離下來的心肌細(xì)胞達(dá)到理想的成活率、純度是亟待解決的瓶頸問題。

心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要包括組織塊貼壁法和酶消化分離法兩種［8］。組織塊貼壁法［9］雖然操作簡便，經(jīng)濟(jì)，但由于組織塊貼壁不良、培養(yǎng)周期長、含大量成纖維細(xì)胞等非心肌細(xì)胞且不是每一塊組織都能長出細(xì)胞，成功率低，現(xiàn)在已幾乎不用。酶消化分離法主要使用的酶是胰酶和膠原酶，胰酶不僅對組織間蛋白成分起分解作用還對細(xì)胞膜蛋白、胞內(nèi)的微管微絲有很強(qiáng)的破壞作用，因此單獨(dú)的胰酶長時(shí)間的消化造成大量的心肌細(xì)胞喪失貼壁和自發(fā)搏動的能力，極大的影響細(xì)胞的活力和存活率，此外經(jīng)胰酶消化處理后的組織可釋放出大量的絮狀般膠原蛋白，難以將上清液分離開，獲得的心肌細(xì)胞數(shù)目少且活力差。膠原酶主要是對細(xì)胞與細(xì)胞間的膠原纖維起分解作用，適當(dāng)?shù)膽?yīng)用膠原酶可將成團(tuán)的心肌細(xì)胞充分分散開從而增加心肌細(xì)胞消化數(shù)目，其作用力緩和，對心肌細(xì)胞損傷小，但是難以完全消化。目前，大多數(shù)采用的是傳統(tǒng)混合酶（胰酶 +膠原酶）消化［10，11］，盡管分離消化下來的細(xì)胞數(shù)目多，但是仍存在細(xì)胞貼壁不佳、活性不好以及純度不高等問題。

圖4　心肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定（標(biāo)尺=200 μm）（A）Green is α-actinin specific staining；（B）Blue is the DAPI-stained cell nucleus；（C）Overlapping image of specific staining with α-actinin and DPAI-stained cell nucleus.Fig.4 Immunofluorescence identification of the cardiomyocytes（Bar=200 μm）

圖5　3種方法分別培養(yǎng)的心肌細(xì)胞（標(biāo)尺=100 μm）（A）Traditional mixed enzyme digestion method；（B）Two-step method；（C）The polylysine pre-packs culture dish+two-step methodFig.5 Morphology of the cardiomyocytes cultured by the 3 methods（Bar=100 μm）

本文觀察了傳統(tǒng)混合酶消化法、二步法及多聚賴氨酸預(yù)包被處理+二步法分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示不論是存活率還是細(xì)胞純度二步法（0.25%胰酶4°C過夜，0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白的膠原消化液37°C短時(shí)多次消化）分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)混合酶消化法，而在二步法的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)皿進(jìn)行多聚賴氨酸預(yù)包被處理后，不僅可以獲得更多的心肌細(xì)胞，而且細(xì)胞貼壁更好、成活率更高，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，搏動好，純度更高。

（1）多聚賴氨酸預(yù)包被處理培養(yǎng)皿：由于小鼠的心肌細(xì)胞比較脆弱易損［12］，在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)步驟中分離消化時(shí)間和力度把握不佳，就會出現(xiàn)細(xì)胞貼壁不佳甚至幾乎不貼壁的現(xiàn)象，因此，用細(xì)胞外基質(zhì)組分（如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或者人工基質(zhì)如多聚賴氨酸）來預(yù)包被細(xì)胞培養(yǎng)皿可促進(jìn)心肌細(xì)胞貼壁生長［13］。

（2）0.25%胰酶（含EDTA）4°C過夜：EDTA是鈣離子的鰲合劑，一種非酶性消化物，主要作用是破壞細(xì)胞間的連接，在胰酶中加EDTA可增強(qiáng)胰酶的消化作用，降低對細(xì)胞的損害，具有更佳的消化效果，而胰酶在37°C，pH 8.0條件下消化作用最強(qiáng)，嚴(yán)重破壞心肌細(xì)胞，4°C條件過夜下可抑制胰酶的活性。加入0.25%胰酶（含EDTA）4°C過夜對心肌組織進(jìn)行預(yù)消化，既能溫和緩慢地分解消化組織間蛋白，使緊密的組織結(jié)構(gòu)變得疏松，也不會對細(xì)胞本身造成損傷破壞，提高細(xì)胞成活率。

（3）用完全培養(yǎng)液來配膠原消化液，既能終止胰酶對組織細(xì)胞蛋白的再消化，又能為細(xì)胞生存提供營養(yǎng)成分，避免在消化過程中造成對細(xì)胞的損害或者活力降低。由于乳小鼠心肌細(xì)胞對酶的消化特別敏感，如果酶的濃度過高或者用量過大，細(xì)胞將會喪失貼壁和搏動的能力，造成細(xì)胞成活率降低，但濃度過低，消化不足時(shí)，細(xì)胞將會聚集成團(tuán)，造成細(xì)胞密度急劇減少，無法滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。Ⅱ型膠原酶的濃度控制在0.5mg/mL～1.0 mg/mL可達(dá)到理想的消化，在膠原酶中加入白蛋白（5 mg/ ml），保護(hù)細(xì)胞，提高消化分離的細(xì)胞質(zhì)量。

（4）37°C短時(shí)多次消化，不僅可讓膠原酶充分消化組織，以便獲得足夠數(shù)目的心肌細(xì)胞，而且可降低因長時(shí)間的消化造成對細(xì)胞的損傷，避免出現(xiàn)消化過度以及隨之而來的細(xì)胞貼壁差，成活率低，搏動少，純度低等問題。由于小鼠心肌細(xì)胞比較脆弱，分離消化過程中，不宜用玻璃棒進(jìn)行攪拌消化或吸管吹打消化，振蕩力度不宜過大，每次都應(yīng)在37℃恒溫水浴輕輕震蕩下消化，以提高心肌細(xì)胞的獲得率。此外，溫度超過37℃時(shí)不但大大降低酶的活性，也會大大的降低細(xì)胞的活力；消化酶的作用時(shí)間對心肌細(xì)胞的獲得有很大影響，一般消化3～5次，每次消化時(shí)間應(yīng)控制在8 min以內(nèi)，消化時(shí)間過長、次數(shù)過多，則獲得的心肌細(xì)胞活力不佳，貼壁不良；時(shí)間過短，次數(shù)過少，消化不足，則獲得的心肌細(xì)胞量少。此外，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀莸谋砻鎻埩坷瓝p傷細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)通過長期反復(fù)的實(shí)踐證明，應(yīng)用多聚賴氨酸預(yù)包被處理培養(yǎng)皿+兩步法分離消化心臟組織，聯(lián)合差速貼壁法（貼壁70 min）+化學(xué)試劑抑制法（在培養(yǎng)基中加0.1 mmol/LBrdU）純化心肌細(xì)胞，能夠建立一種理想的乳小鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，有助于心肌細(xì)胞形態(tài)、電生理、生化、分子生物學(xué)及生物力學(xué)等方面實(shí)驗(yàn)的開展，滿足心血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

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〔修回日期〕2015-12-15

An improved method for primary culture of neonatal mouse cardiomyocytes

WU Dan1，F(xiàn)ENG Jian1，MO Xian-gang2，LIU Ying-cai1
（1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Southest Medical University，Luzhou Sichuan 646000，China；2.Department of Geriatrics，the Hospital Affiliated to Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

【Abstract】Objective To establish a stable and fast method for primary culture of mouse cardiomyocytes. Methods Dishes were coated with polylysine firstly.A two-step approach was used to isolate and digest mouse cardiomyocytes cells（0.25%trypsin in 4°C overnight and 0.5 mg/mL to 1.0 mg/mL collagenase+5 mg/mL albumin collagen digestion liquid in 37°C for short-time digestion），then the cardiomyocytes were purified through differential adhesion for 70 min and 5-bromodeoxyuridine（BrdU）.The cell morphology was observed under an inverted microscope. The survival rate of cardiacmyocytes was detected by trypan-blue staining and their purity was identified by α-actinin immunofluorescence staining.Results The cardiomyocytes were in good shape and pulsed spontaneously.The survival rate of the cardiomyocytes reached 98%and the purity was 95%.Conclusions This method described in this study is an ideal method for primary culture of mouse cardiomyocytes with a high survival rate and high purity.

【Key words】Neonatal mouse；Cardiomyocytes；Primary cell culture

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0062-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.011

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金（編號：31300946，31260250），滬州市人民政府-滬州醫(yī)學(xué)院科技戰(zhàn)略合作科技項(xiàng)目（2013LZLY-J22）。

［作者簡介］吳丹（1991-）女，碩士研究生，研究方向：冠心病的基礎(chǔ)與臨床，Email：15681536087@163.com。

［通訊作者］馮健（1982-）男，主治醫(yī)師，博士，研究方向：冠心病的基礎(chǔ)與臨床，Email：415623fj@163.com。