張風(fēng)賓，郭占軍，吳忱思，張瑞星

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050011）

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線粒體DNA D-loop區(qū)多態(tài)性與肝癌預(yù)后的研究

張風(fēng)賓，郭占軍，吳忱思，張瑞星

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050011）

【摘要】目的 通過對(duì)線粒體DNA D-loop區(qū)的堿基測(cè)序，了解其多態(tài)性及突變情況，并探討其與肝癌發(fā)病機(jī)率及預(yù)后的關(guān)系。方法 提取49個(gè)乙型肝炎后肝癌病人的肝癌組織，癌旁組織和血液中的線粒體DNA，用測(cè)序法測(cè)定線粒體DNA D-loop區(qū)的堿基序列，了解其單核苷酸多態(tài)性和變異情況，并分析其與肝癌發(fā)病率及2年生存率的關(guān)系。結(jié)果 通過觀察發(fā)現(xiàn)，肝癌病mtDNA突變情況與肝癌預(yù)后無明確相關(guān)，而1個(gè)SNP位點(diǎn)（核苷酸150 C/T）與肝癌的生存期之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。經(jīng)COX回歸分析，發(fā)現(xiàn)150位點(diǎn)為肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；150C的患者生存期顯著短于150T的生存期（相對(duì)危險(xiǎn)度，0.246；95%CI，0.070-0.861；P=0.028）。結(jié)論通過分析在線粒體DNAD-loop區(qū)的多態(tài)性，可以幫助篩別預(yù)后不良的肝癌患者。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞肝癌；線粒體DNA D-loop；突變；單核苷酸多態(tài)性

肝細(xì)胞肝癌是常見惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，是男性第五大好發(fā)腫瘤，是女性第七常見腫瘤［1］，是第二常見的死亡病因［2］，每年有將近50萬的病人死于肝癌［2］。肝癌在中國(guó)也是常見腫瘤，中國(guó)每年肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為29.9/100 000 和27.7/100 000［3］。危險(xiǎn)因素包括B型、C型肝炎病毒和酒精濫用［4］。乙型肝炎病毒感染在我國(guó)是一非常嚴(yán)重的問題，因我國(guó)有9千3百萬的乙型肝炎病毒攜帶者，2千萬的慢性乙型肝炎患者［5］。酒精濫用在中國(guó)也逐年上升，6.6%的男性和0.1%的女性診斷為酒精濫用［6］。許多患者進(jìn)展為肝病，如酒精性肝炎和肝硬化，直至肝癌。雖然隨著檢查手段的改善，肝癌已能較早發(fā)現(xiàn)；但因其復(fù)發(fā)率較高，肝癌患者的預(yù)后仍然較差。雖然現(xiàn)在已明確許多因素，如腫瘤的數(shù)目、大小，數(shù)量，細(xì)胞分化程度，門脈瘤栓和肝臟炎癥程度，都與肝癌的復(fù)發(fā)與預(yù)后相關(guān)，但對(duì)于過氧化損傷與肝癌的預(yù)后關(guān)系，則研究較少［7、8］。肝炎病毒感染和酒精濫用導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)氧化損傷加重，進(jìn)而導(dǎo)致DNA的變化包括線粒體DNA的不穩(wěn)定性［9-11］。線粒體基因體是長(zhǎng)16 kb閉環(huán)雙鏈，含有37個(gè)基因，包括2個(gè)rRNA和22 tRNA［12］。因?yàn)榫€粒體 DNA產(chǎn)生 ROS并且缺少DNA修復(fù)功能，所以線粒體DNA比核DNA更容易損傷［13］。在許多癌癥中，包括肝炎病毒導(dǎo)致的肝癌中，DNA突變頻發(fā)于線粒體DNA的非編碼區(qū)域，稱作D-loop區(qū)［12、14、15］，其包含有1122 bp（nucleotides 16，024-16，569 and 1-576；www.mitomap.org）.因其含有復(fù)制的起始鏈和轉(zhuǎn)錄的主要啟動(dòng)子［16］，所以它對(duì)線粒體基因組的復(fù)制和表達(dá)有著重要的調(diào)節(jié)作用。D-loop區(qū)的序列變化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，但是因?yàn)闆]有測(cè)定血液標(biāo)本的序列，所以這些序列變化代表體細(xì)胞變異還是單核苷酸多態(tài)性還是未知。雖然目前有一些研究通過測(cè)定血DNA發(fā)現(xiàn)了一些SNPs（single nucleotide polymorphism，下同）位點(diǎn)，但現(xiàn)在幾乎沒有SNPs被篩選出來以預(yù)測(cè)癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后［17-19］。本研究中，通過測(cè)定肝癌患者的外周血、癌旁及肝癌組織中的mtDNA D-loop 區(qū)DNA序列，發(fā)現(xiàn)了92個(gè)SNPs和25個(gè)突變位點(diǎn)，并通過與正常對(duì)照組比較，篩查出了與肝癌預(yù)后相關(guān)的SNPs位點(diǎn)［16］，并證實(shí)了這些突變和SNPs與肝癌預(yù)后的預(yù)測(cè)強(qiáng)度。

1　材料和方法

1.1組織標(biāo)本和線粒體DNA的提取

收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科49例肝癌病人（所有患者的肝功能屬Child-Pugh分級(jí)A或B，肝總膽紅素水平＜301 mol/L）的癌組織、癌旁組織和血液，立即放-70℃存放。所有病人標(biāo)本的收集經(jīng)過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。用MitochondrialDNAExtractionKit（Genmed Scientific Inc，Shanghai，China）提取線粒體DNA，所有線粒體DNA放-20℃存放備用。

1.2PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序

D-loop用正義引物 5'-CCCCATGCTTACAA GCAAGT-3‘和 反 義 引 物 5'-GCTTTGAGGAG GTAAGCTAC-3'擴(kuò)增［31］，PCR試劑盒采用 PCR Master Mix Kit（Promega，Madison，WI），通過 PCR System 9700 Thermocycle（Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA）擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)品經(jīng)凈化處理后用Abiprism Genetic Analyzer 3100（Applied Biosystem）進(jìn)行測(cè)序分析。如果同病人癌組織和血液及癌旁組織比較有序列變化，這種變化就定義為變異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Kaplan-Meier、log-rank test和 Cox回歸分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有的統(tǒng)計(jì)處理操作均應(yīng)用SPSS 11.5軟件（SPSS Company，Chicago，IL），P值小于0.05定義為有統(tǒng)計(jì)意義。

2　結(jié)果

49例患者中臨床分期一期13人，二期36人；所有病人在肝癌切除術(shù)后均未接受放化療等輔助治療。我們對(duì)49例入組病人每3月進(jìn)行一次隨訪，得到了2年生存情況。2年之內(nèi)共27例患者死亡。收集的臨床資料使用Kaplan-Meier和 log-rank處理。結(jié)果顯示：患者的性別、年齡、Child分級(jí)和腫瘤數(shù)目與2年生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而腫瘤分期、腫瘤大小和門脈瘤栓則差異存在顯著性（表1）。與預(yù)期相符，不同分期患者的2年生存率具有明顯差別，腫瘤分期I期的為76.9%，而II期僅有33.3%；差異具有顯著性（P＜0.05）；腫瘤直徑＞5 cm的生存期明顯短于腫瘤直徑＜5 cm患者；合并有門脈瘤栓的患者均在隨訪期內(nèi)死亡。以上數(shù)據(jù)表明，腫瘤分期、腫瘤大小和門脈瘤栓為影響肝癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

我們檢測(cè)了92個(gè)SNPs與肝癌生存期之間的關(guān)系，在每個(gè) SNP位點(diǎn)，49例患者被分為2組，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，在150位點(diǎn)，存在2年生存率的顯著差異，150C的生存期顯著短于150T （P=0.028）（圖1），我們發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)與肝癌預(yù)后相關(guān)。為了進(jìn)一步分析150位點(diǎn)、腫瘤分期、腫瘤大小、門脈瘤栓這4個(gè)可能因素對(duì)患者預(yù)后的影響，我們將其引入COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型，多因素分析顯示，150位點(diǎn)和門脈瘤栓是影響預(yù)后的獨(dú)立因素（表2）。150C基因型的患者2年生存期顯著短于150T（相對(duì)危險(xiǎn)度，0.246；95%CI，0.070-0.861；P= 0.028）。以上數(shù)據(jù)提示150位點(diǎn)的基因型對(duì)肝癌的生存期具有顯著影響。

3　討論

mtDNA D-loop區(qū)的SNPs和突變位點(diǎn)已經(jīng)用來預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)病情況［16］。本研究通過對(duì) mtDNA（堿基16190-583）的測(cè)序進(jìn)一步研究了SNPs和突變位點(diǎn)與肝癌術(shù)后生存期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)150（C/T）位點(diǎn)與2年生存率有關(guān)，多因素分析顯示，150（C/ T）是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，D-loop區(qū)不同的SNPs在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有不同的作用，150位點(diǎn)位于高突變1區(qū)（HV2），而以前我們發(fā)現(xiàn)的與食管鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的位點(diǎn)位于高變1區(qū)［19］。在這些突變熱點(diǎn)區(qū)域，腫瘤和生殖細(xì)胞的mtDNA都極易發(fā)生突變，其中的原因還不得而知。但我們的研究提示其在腫瘤預(yù)后方面具有重要作用。150C患者的生存期明顯較短且生存曲線下降迅速（圖1），但其中的原因需要進(jìn)一步研究。

表1　患者基本臨床資料Tab.1 Clinical data of the HBV-HCC patients

表2　預(yù)后相關(guān)資料多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the prognostic information

圖1　150位點(diǎn)生存分析Fig.1 Cumulative survival of patients with 150 locus tumors

mtDNA D-loop區(qū)是線粒體基因組復(fù)制和表達(dá)的重要調(diào)控區(qū)，這一區(qū)域的SNPs可能影響mtDNA的復(fù)制，從而影響呼吸鏈的功能，使細(xì)胞能量供應(yīng)發(fā)生障礙，產(chǎn)生大量的活性氧。活性氧可以對(duì)細(xì)胞核基因組產(chǎn)生損害從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［20］。線粒體單倍型類群H和U提供了雜合細(xì)胞體模型［21］，已經(jīng)證實(shí)這些人的遺傳變異情況是由于氧化磷酸化功能不同而引起。與以前報(bào)道相符，本研究發(fā)現(xiàn)TNM分期、門靜脈瘤栓、腫瘤大小和肝細(xì)胞肝癌的預(yù)后相關(guān)，依據(jù)2015 NCCN臨床指南，直徑＜3 cm的腫瘤是適于手術(shù)切除的，但我們也切除較大直徑的腫瘤，畢竟大多數(shù)患者就診時(shí)腫瘤直徑已超過3厘米。我們的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于腫瘤直徑＜5 cm的患者，行肝癌切除2年生存率可以達(dá)到80%。

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〔修回日期〕2016-02-24

Investigation of the association between mitochondrial D-loop polymorphisms and hepatocellular carcinoma outcome

ZHANG Feng-bin，GUO Zhan-jun，WU Chen-si，ZHANG Rui-xing
（Department of Gastroenterology and Hepatology，The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China）

【Abstract】Objective To investigate the accumulation of mutations and single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the displacement loop（D-loop）of mitochondrial DNA（mtDNA）might be associated with cancer risk and disease outcome.Methods We obtained cancerous and noncancerous liver tissues from 49 HBV-related HCC patients at the Fourth Hospital of Hebei Medical University.mtDNA of the liver tissues was extracted with Mitochondrial DNA Extraction Kit.Mutation and polymorphism were confirmed by repeated analysis.We assessed the prediction power of D-loop SNPs in hepatocellular carcinoma（HCC）patients.Results No mutation in these HCC patients had prediction power for postoperational survival，whereas one SNP site（nucleotide 150 C/T）was identified by the log-rank test for statistically significant prediction of HCC survival.In an overall multivariate analysis，allele 150 was identified as an independent predictor of HCC outcome.The length of survival of patients with allele 150C was significantly shorter than that of patients with allele 150T（relative risk，0.246；95%CI，0.070-0.861；P=0.028）.Conclusions The analysis of genetic polymorphisms in the mitochondrial D-loop helps to identify patient subgroups at high risk of a poor disease outcome.

【Key words】Hepatocellular carcinoma，HCC；Mitochondrial D-loop；Mutation；Single nucleotide polymorphisms，SNP；Survival analysis

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）04-0058-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.010

［基金項(xiàng)目］河北省科技廳資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：132777185。

［通訊作者］張風(fēng)賓（1981-）男，主治醫(yī)師，碩士研究生學(xué)歷，主要研究方向?yàn)橄滥[瘤，Email：zhangfengbin1981@163.com