許　珂，王興玲，劉艷麗

(1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院 生殖中心，河南 鄭州 450052；2.河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

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大鼠卵巢組織兩個自體移植部位移植效果的比較

許珂1,2，王興玲1，劉艷麗1

(1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院 生殖中心，河南 鄭州 450052；2.河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

[摘要]目的探討去勢SD大鼠自體卵巢組織兩種不同移植方法的效果比較。 方法按照移植部位不同將SD大鼠隨機分為腎被膜下移植組、頸部皮下移植組和對照組，每組20只。記錄各組手術所用時間、移植后大鼠動情周期變化，并給予HMG促排卵48 h后回收卵巢組織進行HE染色觀察組織學變化和計算卵子存活率。結果腎被膜下組較頸部皮下組所用手術時間短，分別為(18.8±2.5) min和(20.7±2.8)min，P<0.05；腎被膜下組與頸部皮下組移植后大鼠動情周期出現率分別為81.25%與61.11%，差異有顯著性意義(P<0.05)，大鼠恢復動情周期天數無差異。兩組促排后大鼠移植部位卵巢組織回收率分別為：腎被膜下組81.3%，頸部皮下組55.6%，差異有顯著性意義(P<0.05)。但兩移植組回收卵巢組織卵泡存活數較對照組減少(均P<0.05)，兩移植組間差異無顯著性意義(P>0.05)。結論與頸部皮下移植相比，大鼠卵巢組織自體腎被膜移植可獲得更好的效果。

[關鍵詞]卵巢組織；自體異位移植；去勢；SD大鼠；動情周期

[引用本文]許珂,王興玲，劉艷麗.大鼠卵巢組織兩個自體移植部位移植效果的比較[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(1)：24-27.

近年來，青春期和育齡期婦女惡性腫瘤病人逐年增加，但隨著癌癥診斷和治療技術的進步，死亡率顯著下降，生存期限大大延長。然而女性的卵巢對放化療非常敏感，其生殖內分泌功能會受到輻射或藥物毒性損傷。許多病人在接受放化療以及婦科根治性手術后，出現卵巢功能衰竭。卵巢早衰(POF)會造成月經稀發(fā)、不孕、閉經，及因雌激素缺乏而造成心血管系統(tǒng)疾病和骨質疏松等[1]，嚴重影響女性患者的生活質量。病人愈后能否獲得生育能力，是關系其生活質量的重要問題。這就使得卵巢內分泌功能和生育能力的保存越來越受到重視。

目前，國內外大量實驗研究和初步臨床應用已經證實通過自體移植卵巢有可能恢復患者的生育能力和內分泌功能[2]。然而，卵巢組織移植過程許多基礎理論研究仍然處于初步階段，移植后缺血再灌注損傷仍然是阻礙移植卵巢功能恢復的關鍵因素。有研究發(fā)現將卵巢組織移植到傷口愈合過程中形成的肉芽組織內，能減少組織的缺血損傷時間[3]。本實驗將SD雌性大鼠新鮮卵巢組織分別自體移植到一側腎被膜下和頸部皮下預制的肌層創(chuàng)面肉芽組織內，探討大鼠兩種不同移植部位的移植效果，以期為人類卵巢組織移植的開展應用奠定實驗基礎。

1材料和方法

1.1實驗動物

SD雌性大鼠60只，6周齡，體重25～35 g，購于鄭州大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2010-002。飼養(yǎng)于鄭州大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心，人工控溫20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，給予營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，1周后進行實驗。40只先做去勢手術之后再進行移植(腎被膜下移植組和頸部皮下移植組各20只)，另20只作為對照組不作任何處理。

1.2大鼠去勢手術

采用背式卵巢去勢：按0.1 mL/10 g 劑量腹腔注射0.5%的水合氯醛麻醉大鼠。將大鼠固定，碘伏常規(guī)消毒。在肋脊角水平，沿正中腰部切開一小口(2 mm)。沿肌肉走向切開肌肉進入后腹膜，循子宮分支找出卵巢，從輸卵管處結扎卵巢動靜脈，并切除卵巢。同法切除對側卵巢。將切除的卵巢剪成碎片，置于0.9%生理鹽水中待用。

1.3兩種自體卵巢組織移植方法

1.3.1腎被膜下移植：沿子宮向腹腔深處找到腎臟，從腎上極用顯微鑷將切開的大鼠卵巢組織片塞入提起的一側腎被膜下并將其推至腎臟下極，由于腎臟被膜有一定張力，組織放入后不需縫合，把腎臟送入腹腔原位后，依次縫合手術切口。

1.3.2頸部皮下移植：移植前2天將大鼠麻醉后用碘伏常規(guī)消毒頸背部皮膚，手術剪剪開約2 mm小口，肌層內用小彎鉗鈍性分離一創(chuàng)面，然后縫合切口。移植日將大鼠卵巢組織片置于頸部皮下預制的肌層創(chuàng)面肉芽組織內，縫線固定，縫合。

兩移植組術后均給予青霉素4 IU/只腹腔注射，1次/d，共3 d。

1.4促排卵

移植2周后肌注人絨毛膜促性腺激素(HMG)10 IU/只，注射1次。對照組大鼠正常飼養(yǎng)，2周后肌注HMG 10 IU/只。

1.5觀察指標

記錄手術時間及手術結束后大鼠生存情況。術后1周，所有大鼠每日8：00行陰道脫落細胞涂片，室溫干燥，于95%酒精中固定10～15 min，經巴氏染色后顯微鏡下觀察動情周期。促排卵48 h將大鼠脫臼處死回收卵巢移植體，計算卵巢組織移植塊回收率。將移植的卵巢組織進行HE染色，觀察其組織學變化，卵泡存活數/HPF。

1.6統(tǒng)計學方法

利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計，實驗數據計量資料采用t檢驗及單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩移植組大鼠手術時間及術后情況比較

腎被膜下組手術所用時間為(18.8±2.5)min， 頸部皮下組手術所用時間為(20.7±2.8)min，兩組差異有顯著性意義(P=0.026)。移植術后，腎被膜下組有4只大鼠死亡，頸部皮下組有2只大鼠死亡，對照組無大鼠死亡。

2.2各組大鼠動情周期情況比較

未去勢對照組大鼠全部有規(guī)律的動情周期；腎被膜下移植組16只大鼠中13只出現動情周期，頸部皮下移植組18只中11只出現動情周期，動情周期出現率分別為81.25%與61.11%，差異有顯著性意義(P<0.05)，但兩組動情周期天數無差異。

2.3各組卵巢組織回收情況比較

術后存活大鼠移植部位卵巢組織回收，腎被膜下移植組回收率81.3%，頸部皮下移植組回收率55.6%，兩組比較差異有顯著性意義，P<0.05。

2.4各組移植后卵巢組織學檢查及卵泡存活情況比較

回收卵巢移植體，可見移植體均生長增大，呈圓形或腎形凸起(圖1)，表面見大量血管形成。移植組卵巢組織切片中卵泡形態(tài)與新鮮卵巢相近，結構正常，卵母細胞保持圓形，透明帶完整，周圍顆粒細胞形態(tài)正常(圖2)。每高倍視野卵泡數比較，對照組較腎被膜下移植組和頸部皮下移植組卵泡數目更多(P=0.001)。而腎被膜下移植組和頸部皮下移植組間相比差異無顯著性意義(P=0.092)，見表1。

腎被膜移植組，恢復動情周期的13只大鼠中有24只卵巢出現不同發(fā)育階段的卵泡和排卵后出現的黃體；頸部皮下移植組，恢復動情周期的11只大鼠中有18只卵巢出現不同發(fā)育階段的卵泡和排卵后出現的黃體；其余的卵巢和未恢復動情周期的大鼠均未見卵泡的發(fā)育，可見卵巢組織有壞死后增生或炎癥浸潤。

表1　3組大鼠存活卵泡計數

1)與對照組相比，P<0.05

圖1　腎被膜下的卵巢移植體Fig 1 Ovary graft under the kidney capsulea:圓形；b:腎形

圖2　新鮮卵巢與移植卵巢組織切片形態(tài)Fig 2 Sections tissue morphology of fresh ovarian and transplanted folliclesa:新鮮卵巢組織切片；b:移植卵巢組織切片。所示卵母細胞圓形；所示透明帶完整；周圍顆粒細胞形態(tài)正常

3討論

隨著卵巢移植技術和輔助生殖技術的發(fā)展，卵巢及其生殖細胞作為極珍貴的生殖資源備受人們的關注，卵巢組織冷凍及移植是目前最寄予期望的一項技術[4]。為了能夠更好的利用和保存卵巢生殖細胞，卵巢移植技術不斷得到完善，將成為延續(xù)和保存雌性生殖能力的一種有效方法[56]。1896年Knauer首次將自體卵巢移植在動物身上并獲得成功[7]，1906年Carrel應用血管吻合方法進行卵巢移植，使移植的卵巢存活并成功創(chuàng)立了器官移植血管吻合技術[8]。隨后相繼成功在大鼠、兔、羊、豬、獼猴和人等都進行了卵巢移植。近年來卵巢移植技術更是在生物醫(yī)學領域得到深入廣泛的研究，并顯示出良好的應用前景。

國內外卵巢移植的臨床效果不盡令人滿意，許多基本理論問題沒有得到有效的闡明[9]，很多基礎研究有待于進一步開展。本研究采用大鼠作為實驗動物，是因其繁殖周期短、價格便宜且動情周期較短等，可進行大樣本的重復實驗。對于移植部位的選擇上，為了提高移植后卵巢組織的存活率，人們常選擇血供豐富的部位，如肝被膜下、腎被膜下和頸部皮下等，但是不同移植部位的結果并未顯示卵巢組織存活率、卵泡發(fā)育和血清激素水平有明顯的差別[10]。研究中人們發(fā)現宿主去勢后可以提高卵巢組織的移植效果，這可能是由于卵泡生長與卵泡刺激素(FSH)關系非常密切所致[11]。有研究也證明促性腺激素是可以促進卵巢組織移植后血管生成與卵泡存活的[12]。把大鼠先去勢再移植，其目的主要是取消大鼠性腺功能對其中樞的負反饋作用，使FSH分泌增加，進而改善移植效果。2012 年 Hayashi 等[13]研究發(fā)現雌性去勢大鼠通過結合高壓氧治療可以明顯改善自體卵巢組織異位移植的效果。

本研究發(fā)現，大鼠去勢后自體移植腎被膜下較頸部皮下優(yōu)點多。(1)腎被膜下移植的最重要優(yōu)點是血供豐富，移植物易于成活。(2)腎被膜下移植比頸部皮下移植手術時間短，因進行頸部皮下移植時除了背部去勢手術切口外，還需要在頸部另外剪開一個切口，移植后另行縫合增加了手術時間。(3)腎被膜下移植卵巢回收率明顯高于頸部皮下移植組?？赡苡捎谝浦灿谀I被膜下有包膜包裹，卵巢組織不容易游走；而移植于頸部皮下，雖然縫合于預制的肉芽組織中，還是容易游走，很難回收。(4)頸部皮下移植較腎被膜下移植多了手術切口，增加了術后感染風險。因此本研究認為腎被膜下較頸部皮下更適合作為動物模型中卵巢移植的部位。早在2000年就有研究認為腎被膜移植優(yōu)于頸部皮下移植[14]，本研究也印證了此結論。

同時本研究也發(fā)現腎被膜下移植出血較多，操作難度較大，這就要求術者掌握熟練的手術技能，以提高移植成功率。

本研究顯示大鼠卵巢組織自體移植到腎被膜下和頸部皮下后，都可見到竇卵泡形成并且可以獲得GV期卵子；兩組間卵泡存活率差異無顯著性意義。這提示，新鮮大鼠卵巢組織進行腎被膜下及頸部皮下這兩個部位移植效果可能相差不大。但是由于時間限制本研究只進行到觀察卵泡及GV期卵子階段，并沒有進行授精及優(yōu)胚率的計算。

綜上所述，大鼠去勢后進行卵巢組織自體移植，腎被膜下比頸部皮下手術更加快捷有效，兩種部位移植后獲得相似的卵泡生存率。移植后如何獲得成熟卵子及移植是否影響胚胎的發(fā)育有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Shelling AN. Premature ovarian failure[J]. Reproduetion, 2010, 140(5): 633-641.

[2] Ernst E, Bergholdt S, J rgensen JS, et al. The first woman to give birth to two children following transplantation of frozen/thawed ovarian tissue[J]. Hum Reprod, 2010, 25(5): 1280-1281.

[3] Rebar RW. Premature ovarian failure[J]. Obstet Gynecol, 2009, 113(6): 1355-1363.

[4] Li YB, Zhou CQ, Yang GF, et al. Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues[J]. Chin Med J(Engl), 2007, 120(2): 110-114.

[5] Torrents E, Boiso I, Barri RN, et al. Applications of ovarian tissue transplantation in experimental bioIogy and medicine[J]. Hum Reprod Update, 2003, 9(5): 471-481.

[6] Moffa F, Biacchiardi CP, Fagioli F. Ovarian tissue cryostorage and grafting: an option to preserve fertility in pediatric patients with malignancies[J]. Pediatr Hematol Oncol, 2007, 24(1): 29-44.

[7] Gamzatova Z, Komlichenko E, Kostareva A, et al. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue-effective method of fertility preservation in cancer patients[J]. Gynecol Endocrinol, 2014, 30(Suppl 1): 43-47.

[8] Lee J, Lee JR, Youm HW, et al. Effect of preoperative simvastatin treatment on transplantation of cryopreserved-warmed mouse ovarian tissue quality[J]. Theriogenology, 2015, 83(2): 285-293.

[9] Labied S, Delforge Y, Munaut C, et al. Isoform 111 of ascular endothelial growth factor(VEGF111)improves angiogenesis of ovarian tissuexenotransplantation[J]. Transplantation, 2013, 95(3): 426-433.

[10] Gamzatoval ZK, Komlichenko EV, Kostareva AA, et al. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue after treatment for malignant disease-the first Norwegian results[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2015, 94(9): 937-941.

[11] Maltaris T, Koelbl H, Fischl F, et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue pieces in gonadotropin-stimulated SCID mice: the effect of ovariectomy[J]. Anticancer Res, 2006, 26(6B): 4171-4176.

[12] Wang Y, Chang Q, Sun J, et al. Effects of HMG on revascularization and follicular survival in heterotopic autotransplants of mouse ovarian tissue[J]. Reprod Biomed Online, 2012, 24(6): 646-653.

[13] Hayashi S, Asano T, Kakizaki R, et al. Beneficial effect of hyperbaric oxygen therapy on the follicular survival in the mouse ovary after transplantation[J]. J Reprod Dev, 2012, 58(2): 260-263.

[14] 曹金燕, 史小林, 諸定壽. 大鼠胚胎卵巢異體異位移植的探討[J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2000, 21(1): 9-11.

Effect of two methods of transplantation research on auto-transplantation of ovarian tissue in rats

XU Ke1,2，WANG Xing-ling1，LIU Yan-li1

(1.ReproductiveMedicalCancer,theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China；2.TheThirdAffiliatedHospitalofTCM,Zhengzhou450008,China)

[Abstract]Objective To investigate the influence of two transplantation methods on auto-transplantation of mouse ovarian tissue in SD mice. Methods According to the operation methods，the mice were divided into three groups： kindey capsule transplantation group， neck subcutaneous transplantation group and control group(n=20). The operation time were recorded after operation.Vaginal smears to observe estrus cycle in mice，two weeks later giving HMG to stimulate ovarian oviposit， after 48 h recycling ovarian tissue and HE dyeing to observe histological changes and the follicle survival rate was recorded.Results Significantly lengthened operation time was observed in neck subcutaneous transplantation group than kindey capsule transplantation group[(20.7±2.8)min vs. (18.8±2.5)min，P<0.05]. Kindey capsule transplantation group and neck subcutaneous transplantation group mice appeared estrus rate were 81.25% and 61.11% respectively(P<0.05)，there was no difference between the two transplantation groups back estrus days. The recovery rate of kindey capsule group was 81.3% after giving HMG， and the recovery rate of the neck subcutaneous group was 55.6%(P>0.05).The follicle survival rates in the two transplantation groups were significantly less than control group (P<0.05)，while there was no significant difference between the two transplantation groups (P>0.05).Conclusion Kindey capsule is more suitable for auto-transplantation of mouse ovarian tissue than neck subcutaneous， auto-transplantation of mouse ovarian tissue kindey capsule can get better results.

[Key words]ovarian tissue；subcutaneous auto-transplantation；castration；mice；estrus cycle

作者簡介:許 珂(1980-), 女,河南南陽人，主治醫(yī)師。 E-mail: 2545016081@qq.com 通信作者:王興玲,教授。 E-mail: wangxl208@126.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.01.06

[中圖分類號]R711.75

[文獻標志碼]A

文章編號：1671-7295(2016)01-0024-04

(收稿日期:2015-07-03；修回日期：2016-01-07)