李福霞, 胡維娜, 胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，廣東 廣州 510642)

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球孢白僵菌對亞洲玉米螟血細胞毒力和形態(tài)的影響

李福霞, 胡維娜, 胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】測定球孢白僵菌 Beauveria bassiana對亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis血細胞系SYSU-OfHe-C的影響，為促進球孢白僵菌在防治亞洲玉米螟中的應用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肕TT和CCK- 8法測定球孢白僵菌對亞洲玉米螟血細胞系SYSU-OfHe-C的毒力，通過光學顯微鏡與掃描電鏡觀察球孢白僵菌生長及其對SYSU-OfHe-C細胞的影響。【結(jié)果】球孢白僵菌分生孢子處理SYSU-OfHe-C細胞24 h后，MTT法的IC50值為2.8×105 mL-1，CCK- 8法的IC50值為1.4×105 mL-1。光學顯微鏡實時監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在SYSU-OfHe-C細胞對數(shù)期接種球孢白僵菌濃度為3.5×104 mL-1時，球孢白僵菌具有明顯競爭力，未發(fā)現(xiàn)囊胞化與吞噬等細胞免疫現(xiàn)象；處理10 h后，球孢白僵菌分生孢子開始萌發(fā)長出菌絲，而SYSU-OfHe-C細胞減少且開始變形；處理24 h，球孢白僵菌幾乎長滿整個視野；SYSU-OfHe-C細胞從近似圓形變長或者變?yōu)椴灰?guī)則形狀，出現(xiàn)聚集、破碎、胞內(nèi)空泡、瘤狀突起，以及被白僵菌菌絲穿透等現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】球孢白僵菌可改變亞洲玉米螟血細胞系SYSU-OfHe-C的細胞形態(tài)，但不能使其發(fā)生細胞免疫現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：球孢白僵菌； 亞洲玉米螟； 血細胞； SYSU-OfHe-C； MTT法； CCK- 8法

球孢白僵菌Beauveria bassiana是目前研究較深入、應用廣泛的一種昆蟲病原真菌，其致病性強、殺蟲范圍廣，在多種害蟲的防治中取得了顯著的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益[1]。我國曾大規(guī)模地應用球孢白僵菌防治馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus Walker，并取得了巨大的成功[2-3]。球孢白僵菌也廣泛應用于防治亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis，特別是我國東北地區(qū)利用白僵菌防治越冬代玉米螟成為玉米螟生物防治的重要方法[4-5]。

球孢白僵菌侵染寄主昆蟲一般要經(jīng)歷分生孢子的附著、萌發(fā)與穿透表皮，菌絲在血腔內(nèi)生長、產(chǎn)生毒素、致死寄主、入侵所有器官繼而穿出表皮，產(chǎn)生新一代分生孢子、繼續(xù)擴散流行等階段。球孢白僵菌的致病機理不像化學農(nóng)藥那樣依靠自身毒力殺死害蟲，而是通過吸收寄主體內(nèi)水分和養(yǎng)分滿足自身菌絲生長，導致寄主體內(nèi)生理代謝紊亂或代謝發(fā)生障礙而死亡。關(guān)于寄主昆蟲對球孢白僵菌的免疫作用已有一些研究，大臘螟Galleria mellonalla幼蟲感染球孢白僵菌后在最佳條件和熱激條件下產(chǎn)生不同的體液免疫能力[6]；接種球孢白僵菌分生孢子對桑天牛Apriona germari幼蟲血細胞數(shù)量有顯著的影響[7]。對亞洲玉米螟幼蟲注射不同劑量球孢白僵菌芽生孢子后，其血細胞總數(shù)發(fā)生變化，活體與離體血細胞均對芽生孢子產(chǎn)生包囊作用，但是在活體條件下血細胞粘附在芽生孢子表面形成包囊，而在離體條件下包囊形成的速度較慢，其致密程度不如活體狀態(tài)，表明亞洲玉米螟對球孢白僵菌芽生孢子具有細胞防御能力[8]。膜翅目寄生蜂腰帶長體繭蜂Macrocentrus cingulum是亞洲玉米螟的重要天敵，腰帶長體繭蜂的卵不會被亞洲玉米螟血細胞囊胞化，因而可以在其體內(nèi)完成發(fā)育，這一現(xiàn)象說明寄主昆蟲與寄生物具有復雜的免疫與抗免疫關(guān)系[9-10]。

亞洲玉米螟血細胞系SYSU-OfHe-C由中山大學胡建博士創(chuàng)建，可連續(xù)繼代培養(yǎng)[11]。本研究將考察球孢白僵菌對亞洲玉米螟血細胞SYSU-OfHe-C的毒性及其形態(tài)的影響，進一步研究亞洲玉米螟幼蟲與球孢白僵菌的免疫互作關(guān)系，促進利用球孢白僵菌防治亞洲玉米螟生物防治技術(shù)的發(fā)展。

1材料與方法

1.1材料

亞洲玉米螟幼蟲血細胞系SYSU-OfHe-C由中山大學生命科學學院胡建博士饋贈。球孢白僵菌BbTS01菌株是華南農(nóng)業(yè)大學天然農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室從西藏日喀則市白朗縣土壤中分離獲得。

EX-CELL420培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司)； MTT(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；CCK- 8(日本同仁公司)；二甲基亞砜DMSO(美國Sigma公司)；吐溫80(天津市富宇精細化工有限公司)。

酶標儀(iMark，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)；倒置顯微鏡(MF52型，廣州市明美光電技術(shù)有限公司)； 96孔板(美國Corning Incorporated 公司)，血球計數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

1.2方法

亞洲玉米螟幼蟲血細胞系SYSU-OfHe-C采用EX-CELL420培養(yǎng)基添加φ為10%的胎牛血清，27 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔3～4 d傳代1次，取對數(shù)期細胞用于試驗。球孢白僵菌BbTS01菌株取斜面菌種接種于PDA平板上培養(yǎng)約2周，收集分生孢子。取分生孢子100 mg，用2 g·L-1的吐溫水1 mL配成懸浮液，采用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整濃度為107mL-1備用。

1.2.1球孢白僵菌對血細胞系SYSU-OfHe-C細胞的毒力測定1) MTT法：96孔板每孔加入90 μL受試細胞懸浮液，靜置培養(yǎng)24 h，待細胞濃度為1×105mL-1時，分別滴加10 μL球孢白僵菌分生孢子懸浮液，使球孢白僵菌分生孢子終濃度分別達到3.5×106、3.5×105、3.5×104、3.5×103mL-1，以2 g·L-1吐溫水為對照，以不加細胞的完全培養(yǎng)基為本底，每個處理重復4次。在27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入50 μL的1×MTT，27 ℃培養(yǎng)4 h，吸出上清液(懸浮細胞用此法時經(jīng)1 000 r·min-1離心后去除上清液)，每孔加入150 mL DMSO使甲臜溶解，搖勻；酶標儀測定波長處檢測每孔的D490 nm。2) CCK- 8法：細胞培養(yǎng)與處理方法同上述MTT法，接種球孢白僵菌分生孢子并培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL CCK- 8溶液，注意不形成氣泡，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，酶標儀測定D450 nm。

1.2.2球孢白僵菌對血細胞系SYSU-OfHe-C細胞形態(tài)的影響96孔板每孔加入90 μL受試細胞懸浮液，靜置24 h，接種球孢白僵菌分生孢子懸浮液使其終濃度為3.5×104mL-1，倒置顯微鏡下監(jiān)測球孢白僵菌與血細胞的生長情況，每隔30 min拍照記錄。取上述接種球孢白僵菌后培養(yǎng)24 h的亞洲玉米螟血細胞，在光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS軟件分析細胞死亡率，改良寇氏法[12]計算IC50值。

細胞死亡率=[1-(D處理-D本底)/(D對照- D本底)]×100%，

IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]，式中，Xm為處理最大濃度的對數(shù)值；i為各濃度倍比濃度的對數(shù)值；ΣP為各組死亡率之和；0.5為經(jīng)驗常數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1球孢白僵菌對血細胞系SYSU-OfHe-C細胞的毒力測定

球孢白僵菌對SYSU-OfHe-C細胞的毒力測定結(jié)

果見圖1，不同濃度的球孢白僵菌分生孢子懸浮液處理24 h后，SYSU-OfHe-C細胞的死亡率不同，隨著球孢白僵菌分生孢子懸浮液濃度的增大，SYSU-OfHe-C細胞的死亡率增加，總體上看，CCK- 8法與MTT法的結(jié)果相差不大，但前者測得的SYSU-OfHe-C細胞死亡率更高一點，當球孢白僵菌分生孢子懸浮液濃度為3.5×106mL-1，CCK- 8法測得的SYSU-OfHe-C細胞死亡率達77.3%，MTT法為66.4%；球孢白僵菌分生孢子懸浮液濃度為3.5×103mL-1，CCK- 8法與MTT法的死亡率分別為15.2%和15.6%。CCK- 8法與MTT法測得球孢白僵菌對SYSU-OfHe-C細胞的毒力回歸方程見表1，從表1可知MTT法測得球孢白僵菌分生孢子對SYSU-OfHe-C細胞的IC50(2.8×105mL-1)稍高于CCK- 8法的IC50(1.4×105mL-1)。

圖1球孢白僵菌處理24 h后SYSU-OfHe-C細胞的死亡率

Fig.1The mortality rate in SYSU-Of He-C cells at 24 hours after treatment of Beauveria bassiana

表1球孢白僵菌對SYSU-OfHe-C細胞的毒力回歸方程和IC50值

Tab.1The toxicity regression equation and IC50value of Beauveria bassiana against SYSU-OfHe-C cells

方法毒性回歸方程1)2PIC50/(105mL-1)95%置信區(qū)間/(105mL-1)MTTy=0.01x+32.65411.0290.0402.80.682～1.111CCK-8y=0.01x+35.9994.8860.0871.40.835～1.228

1)x為濃度的對數(shù)值，y為死亡率。

2.2球孢白僵菌對血細胞系SYSU-OfHe-C細胞形態(tài)的影響

在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在接種球孢白僵菌分生孢子后，大約10 h分生孢子萌發(fā)長出菌絲，此后

菌絲不斷伸長，亞洲玉米螟血細胞開始移動、數(shù)量變少且形態(tài)改變，至24 h左右，球孢白僵菌菌絲長滿整個視野，未見囊胞化與吞噬作用(圖2)。

a：SYSU-OfHe-C細胞；b：球孢白僵菌菌絲；標尺為100 μm。

接種球孢白僵菌分生孢子24 h后，SYSU-OfHe-C細胞部分從近似圓形變長或者變?yōu)椴灰?guī)則形狀，似乎還原成漿血細胞和類絳色細胞的原始形狀，但未見吞噬與囊胞化等細胞免疫現(xiàn)象發(fā)生。另外，也發(fā)現(xiàn)少數(shù)SYSU-OfHe-C細胞聚集、破碎、細胞減少，以及出現(xiàn)空泡和瘤狀突起等現(xiàn)象(圖3)。在掃描電鏡下還觀察到球孢白僵菌菌絲穿透SYSU-OfHe-C細胞的現(xiàn)象(圖4)。

CK：對照； A1～A4表示球孢白僵菌處理濃度分別為3.5×103、3.5×104、3.5×105、3.5×106mL-1; ag：細胞聚集，ex：細胞膨脹，va：空泡，db：細胞破碎，str：瘤狀突起; 標尺為100 μm。

圖3球孢白僵菌對SYSU-OfHe-C細胞形態(tài)的影響

Fig 3Effects of Beauveria bassiana on the morphology of SYSU-OfHe-C cells

A：對照； B：處理； a、b分別表示對照組和處理組SYSU-OfHe-C細胞；c：球孢白僵菌菌絲。

圖4掃描電鏡下的球孢白僵菌菌絲與SYSU-OfHe-C細胞的相互作用

Fig 4The interaction between Beauveria bassiana mycelia and SYSU-OfHe-C cells under scanning electron microscopy

3討論與結(jié)論

本研究運用MTT和CCK- 8法測定了球孢白僵菌對SYSU-OfHe-C細胞的毒力，結(jié)果有一定差異，可能原因是：使用MTT法檢測時，需要使用裂解液溶解甲臜晶體沉淀，可能遇到顆粒不完全溶解、吸取上清的操作中帶走部分細胞等問題，導致MTT法的結(jié)果容易出現(xiàn)細胞死亡率比實際情況偏低的情況；而CCK- 8是一種綜合指標較好的細胞毒性檢測試劑，對細胞的毒性相當?shù)停錂z測原理和檢測條件與MTT法略有差異。CCK- 8法產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟，減少一定的誤差，使試驗結(jié)果更加穩(wěn)定，盡管當有還原物質(zhì)存在時會影響CCK- 8的測定，但CCK- 8法一般比MTT法更加靈敏、穩(wěn)定，而且重復性較好。

昆蟲細胞免疫反應是由血細胞介導的，主要依賴血細胞對外來異物的吞噬、集結(jié)和包囊[13]。包囊反應在昆蟲細胞免疫反應中占有很重要的位置，對昆蟲細胞免疫反應的研究必定要進行囊胞化分析。本試驗未發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟細胞系SYSU-OfHe-C對球孢白僵菌的囊胞化與吞噬作用等細胞免疫現(xiàn)象，可能原因之一是SYSU-OfHe-C本身特性決定的，其缺乏血漿的某些成份，影響了其囊胞化效率[11]；也與球孢白僵菌本身的特性有關(guān)，球孢白僵菌是一種通過營養(yǎng)競爭策略使寄主昆蟲生病的蟲生真菌，通過增加入侵量和快速分裂或生長來逃避寄主昆蟲的免疫防御[14]；也可能與血細胞的密度有關(guān)[15]，自然情況下，亞洲玉米螟體內(nèi)血細胞密度約為1.0×107～4.0×107mL-1[9]，本研究采用細胞密度為1.0×105mL-1，低于亞洲玉米螟體內(nèi)血細胞密度，有可能造成SYSU-OfHe-C細胞囊胞化作用降低。

球孢白僵菌等微生物制劑的廣泛應用是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向，亞洲玉米螟是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲，生物因子在控制亞洲玉米螟種群數(shù)量方面起著十分重要的作用[16]。通過研究球孢白僵菌對亞洲玉米螟血細胞系SYSU-OfHe-C的毒力作用和對其細胞形態(tài)及生長的影響，為進一步深入研究亞洲玉米螟幼蟲與球孢白僵菌的免疫互作奠定基礎，有利于促進球孢白僵菌對亞洲玉米螟的生物防治。

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【責任編輯霍歡】

Effects of Beauveria bassiana on virulence and cellular morphology of hemocytes of Ostrinia furnacalis

LI Fuxia, HU Weina, HU Qiongbo

(College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To test the effect of Beauveria bassiana on SYSU-OfHe-C, a cell line from hemocytes of Ostrinia furnacalis. To provide a theory basis for application of B.bassiana in the prevention and treatment of O. furnacalis.【Method】 MTT and CCK- 8 were employed to test the virulence of B. bassiana on SYSU-OfHe-C. Optical microscope and scanning electron microscope were used to observe the growth of B. bassiana and its influence on the morphology of SYSU-OfHe-C cells. 【Result】The IC50values of B.bassiana against SYSU-OfHe-C cells at 24 hours after treatment were recorded as 2.8×105and 1.4×105 mL-1respectively by MTT and CCK- 8. Furthermore, under real-time monitoring with optical microscope, encapsulization and phagocytosis were not found and B. bassiana was highly competitive when the conidia of B. bassiana were inoculated in the culture of SYSU-OfHe-C cells at logarithmic stage reaching a final concentration of 3.5×104 mL-1for B. bassiana. B. bassiana started to germinate at 10 hours after treatment, and meanwhile, SYSU-OfHe-C cells started to reduce in number and change in morphology. At 24 hours after treatment, B. bassiana grew the entire visual field. The nearly round SYSU-OfHe-C cells had elongated or turned into irregular shape. Aggregation, fragmentation, cavitation, protuberance and penetration of SYSU-OfHe-C cells caused by B.bassiana mycelia were observed.【Conclusion】B.bassiana can change cellular morphology of hemocytes of O. furnacalis, but cannot induce its immune responses.

Key words：Beauveria bassiana; Ostrinia furnacalis; hemocyte; SYSU-OfHe-C; MTT method; CCK- 8 method

收稿日期：2015- 11- 10優(yōu)先出版時間：2016- 06- 01

作者簡介：李福霞(1991─)，女，碩士研究生，E-mail：953239652@qq.com；通信作者：胡瓊波(1963─)，男，副教授，博士，E-mail：qbscau@scau.edu.cn

基金項目：公益性行業(yè)(林業(yè))科研專項(201304408)

中圖分類號：S476.12

文獻標志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)04- 0032- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160601.1630.034.html

李福霞, 胡維娜, 胡瓊波.球孢白僵菌對亞洲玉米螟血細胞毒力和形態(tài)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2016,37(4):32- 37.