徐晨希，王夢(mèng)琦，朱小瑞，張玉鋒，夏海磊，劉賢慧，王小龍，張慧敏，楊章平，毛永江

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

?

中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP突變對(duì)乳中脂肪酸組成的影響

徐晨希，王夢(mèng)琦，朱小瑞，張玉鋒，夏海磊，劉賢慧，王小龍，張慧敏，楊章平，毛永江

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

摘要：【目的】FADS2是多不飽和脂肪酸合成中關(guān)鍵的限速酶之一，可催化食物中亞油酸（LNA, C18：2n6）合成γ-亞麻酸（GLA, C18：3n6）、二十碳五烯酸（EPA, C20：5n3）、二十二碳六烯酸（DHA, C22：6n3）等長(zhǎng)鏈脂肪酸。試驗(yàn)旨在探討中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變對(duì)乳中脂肪酸含量的影響?！痉椒ā侩S機(jī)選擇20頭無(wú)親緣關(guān)系的中國(guó)荷斯坦牛樣本，用直接測(cè)序列法檢測(cè)FADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變位點(diǎn)。再以江蘇某大型奶牛場(chǎng)551頭中國(guó)荷斯坦牛為材料，用飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)前期發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用最小二乘模型分析了SNP突變及其單倍型對(duì)乳中脂肪酸含量及其不飽和指數(shù)的影響?！窘Y(jié)果】 中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′端非編碼區(qū)存在3個(gè)SNP突變位點(diǎn)：c.1571 A＞G、c.2743 A＞G、c.2776 A＞G。c.1571 A＞G位點(diǎn)GG型為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.800，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為0.887。c.2776 A＞G位點(diǎn)AA為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為 0.673，A為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為 0.819。Χ2檢驗(yàn)表明：c.2776 A＞G位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05） ，而c.1571 A＞G位點(diǎn)基因型分布均偏離Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。FADS2基因c.1571 A＞G位點(diǎn)與c.2776 A＞G位點(diǎn)間連鎖不平衡系數(shù)r2為0.028，未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。c.1571 A＞G位點(diǎn)與c.2776 A＞G位點(diǎn)有3種單倍型，GA、GG和AA頻率分別為0.705、0.181和0.114。多因素方差分析表明：FADS2-1571對(duì)C14：1含量、C14和C18不飽和指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），對(duì)C18：0、SFA和MUFA含量的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。GG型個(gè)體乳中C14：1含量、C14和C18不飽和指數(shù)顯著高于AG型（P ＜0.05）。FADS2-2776位點(diǎn)對(duì)C16：1含量、 C16和C20不飽和指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），對(duì)C14：1含量的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），GG型個(gè)體乳中C16：1含量、C16和C20不飽和指數(shù)顯著高于AG型和AA型（P＜0.05）。同時(shí)，F(xiàn)DAS2-1571-2776單倍型對(duì)C16：1含量和C20不飽和指數(shù)的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），單倍型GG型個(gè)體乳中C16：1含量和C20不飽和指數(shù)顯著高于GA型和AA型（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】FADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變對(duì)中國(guó)荷斯坦牛乳中脂肪酸組成有重要影響。在進(jìn)一步驗(yàn)證其功能情況下，可作為影響中國(guó)荷斯坦奶牛乳脂肪酸組成的主效基因加以利用。

關(guān)鍵詞：中國(guó)荷斯坦牛；FADS2；SNPs；脂肪酸組成

聯(lián)系方式：徐晨希， E-mail：chouchouxcx@163.com。王夢(mèng)琦，E-mail：770406499@qq.com。徐晨希和王夢(mèng)琦為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者毛永江，E-mail：cattle@yzu.edu.cn

0 引言

【研究意義】乳脂是牛奶重要的組成部分，乳脂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要決定于乳中脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）的構(gòu)成。脂肪酸按其飽和程度可分為飽和脂肪酸（saturated fatty acid， SFA）、單不飽和脂肪酸（mono unsaturated fatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（poly unsaturated fatty acid，PUFA），按其鏈長(zhǎng)度可分為長(zhǎng)鏈脂肪酸（long chain fatty acids， LCFA， 13碳以上）、中鏈脂肪酸（middle chain fatty acids， MCFA，含6-12碳）和短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA， 5碳以下）［1］。研究發(fā)現(xiàn)普通牛奶中 SFA、MUFA和PUFA的比值通常在70：25：5［2］。牛奶中不飽和脂肪酸以十八碳系列為主，主要有油酸（C18：1），亞油酸（C18：2），亞麻酸（C18：3）。當(dāng)然，多不飽和脂肪酸中還含有對(duì)人體很有益的花生四烯酸（C20：4）和二十二碳六烯酸（C22：6，簡(jiǎn)稱DHA）［2］。隨著對(duì)乳脂的深入研究， 乳中PUFA的營(yíng)養(yǎng)保健作用及其對(duì)乳制品組織結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的影響作用開(kāi)始受到人們普遍關(guān)注?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】最近的研究表明：PUFA具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控編碼脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)及促進(jìn)免疫機(jī)能、提高動(dòng)物繁殖性能等功能［3］。牛奶中FA的組成不僅受到環(huán)境因素的影響，更多的受內(nèi)在因素影響，如物種、品種、基因、泌乳階段、胎次、擠奶頻率等［4-7］。脂肪酸脫氫酶（fatty acid desaturases，F(xiàn)ADS）是一類能催化脂肪酸生成PUFAs的關(guān)鍵酶。其中FADS2是FADS基因家族中最重要的成員之一，是多不飽和脂肪酸合成代謝途徑中關(guān)鍵的限速酶，可催化 2種必需脂肪酸亞油酸（（LA， C18：2）和α-亞麻酸（ALA， C18：3）轉(zhuǎn)化為γ-亞麻酸（GLA， C18：3）和十八碳四烯酸（18：4），并進(jìn)一步脫氫形成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（long chain- poly unsaturated fatty acids， LCPUFAS），包括花生四烯酸（ARA，20：4n-6）、二十碳五烯酸（EPA， 20：5n-3） 和二十二碳六烯酸（DHA， 22：6n-3）等［8-11］。NWANKWO等［12］、NAKAYAMA等［13］的研究表明：人 FADS2基因SNP突變影響人體脂肪組織及血漿中 PUFA的含量，從而影響人類健康。最近人類全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）也證實(shí)了FADS2基因?qū)χ惔x疾病的作用［14-16］。另外，F(xiàn)ADS2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化對(duì)人類肝臟FADS2基因的表達(dá)活性也有較大影響［17］。在家畜方面也有部分有關(guān) FADS2基因與生產(chǎn)性能，特別是脂肪產(chǎn)量和脂肪酸組成有關(guān)的報(bào)道。RENAVILLE 等［18］研究表明：FADS2基因多態(tài)性顯著影響意大利豬肉中花生四烯酸和亞油酸含量及 γ-亞麻酸與亞油酸的比值；BOSCHETTI 等［19］發(fā)現(xiàn)慢速和中等速度生長(zhǎng)的肉雞胸肌中 FADS2基因表達(dá)量較高，也具有較高含量的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA），同時(shí)FADS2基因SNP突變對(duì)胸肌中FADS2基因表達(dá)量和LCPUFA也有顯著影響；da COSTA等［20］發(fā)現(xiàn)肉牛FADS2基因表達(dá)量對(duì)其肝臟中脂肪酸組成有顯著影響。奶牛FADS2基因研究方面，IBEAGHA-AWEMU等［21］對(duì)加拿大荷斯坦牛FADS2基因SNP多態(tài)性及其與乳中FA含量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FADS2基因共24個(gè)SNP突變，位于內(nèi)含子、編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)（3′un-transcript region， 3′UTR）的 SNP數(shù)量分別為16、1和7個(gè)。其中FADS2基因3'UTR 1571 A/G和2776 A/G突變對(duì)乳中PUFA有顯著影響。生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)ADS2基因1571 A/G為miRNA-744結(jié)合位點(diǎn)。故推測(cè)miRNA-744可通過(guò)與FADS2基因結(jié)合，從而調(diào)控FADS2基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳中 PUFA含量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在國(guó)內(nèi)，梅秀麗［22］比較了不同飼養(yǎng)方式下優(yōu)質(zhì)雞 FADS2基因的表達(dá)及其對(duì)脂肪酸組成的影響，朱世康等［23-26］對(duì)雞FADS2基因5′端和3′端SNP多態(tài)及其與部分經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性進(jìn)行了研究，但未見(jiàn)其他畜種（包括奶牛）FADS2基因突變及其乳中FA組成方面的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】檢測(cè)中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′UTR SNP突變，同時(shí)分析SNP突變對(duì)乳中脂肪酸組成的影響，以期為中國(guó)荷斯坦牛乳中脂肪酸含量的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2011年3—4月于江蘇省揚(yáng)州市某大型奶牛場(chǎng)采集中國(guó)荷斯坦牛血樣共 551頭。采用尾靜脈采血 10 mL/頭，ACD抗凝劑，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩２蓸訒r(shí)，同時(shí)選擇體況相近（BCS=3.0±0.5）、無(wú)臨床乳房炎、胎次在2—3胎、處于泌乳中后期（產(chǎn)奶100—300 d）的中國(guó)荷斯坦牛共300頭，在進(jìn)行DHI測(cè)定時(shí)，取全天混合奶樣（早∶中∶晚=4∶3∶3）100 mL，其中50 mL送上海光明 DHI中心進(jìn)行乳中體細(xì)胞數(shù)測(cè)定，另外50 mL用于實(shí)驗(yàn)室脂肪酸測(cè)定。牧場(chǎng)基本情況如下：全場(chǎng)共有奶牛1 000余頭，其中成年泌乳奶牛近500頭，散欄飼養(yǎng)，魚(yú)骨式擠奶大廳進(jìn)行擠奶，日擠奶 3次，采用全混合日糧（total mixed ration， TMR）飼喂。

1.2 DNA提取及FADS2基因3′端SNP突變檢測(cè)

奶牛血液基因組DNA采用常規(guī)酚氯仿提取法，TE溶解，取部分DNA樣品稀釋至100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank公布的牛的FADS2基因DNA序列（BC123735.1）， 參考IBEAGHA-AWEMU等［21］對(duì)加拿大荷斯坦牛FADS2基因3′檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)信息（c.1571 A＞G、c.2743 A＞G和c.2776 A＞G），用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，用于擴(kuò)增3′端包括上述3個(gè)突變位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段。PCR引物信息及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

表1　FADS2基因3'端PCR引物序列及擴(kuò)增條件Table 1 The primers and PCR condition for amplification of 3' UTR of FADS2 gene

從所采551個(gè)樣本中隨機(jī)選擇20個(gè)DNA樣品，經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，所得序列用DNAMAN（Ver 5.2）與GenBank中FADS2參考序列（BC123735.1）進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP突變位點(diǎn)。經(jīng)對(duì) 20個(gè)樣本的初步分析，c.2743 A＞G和c.2776 A＞G由于距離較近，連鎖程度較高，連鎖不平衡系數(shù)r2達(dá)0.7以上。故在接下來(lái)的SNP分型過(guò)程中，只對(duì)c.1571 A＞G和c.2776 A＞G進(jìn)行分析。對(duì)大樣本 FADS2 SNP突變檢測(cè)采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MassARRAY? MALDI-TOF System，Sequenom，Inc.，USA）。同時(shí)，為保證SNP分析結(jié)果可靠性，其中40個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定2次（測(cè)試員并不知道這個(gè)40個(gè)是重復(fù)樣本）。結(jié)果表明該方法SNP分型結(jié)果準(zhǔn)確性為100％。

1.3 脂肪酸測(cè)定

脂肪酸測(cè)定在采樣后3個(gè)月內(nèi)完成。根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定（GB 5413.27-2010）并加以改進(jìn)（食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）［27］，用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定（美國(guó)Agilent7890A，色譜柱為DB-23， 30 m×0.25 mm×0.25 μm），氣相色譜儀使用程序升溫進(jìn)行檢測(cè)［28］。使用Sigma公司的37種脂肪酸甲酯的混標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用氣相色譜儀對(duì)樣品中所有脂肪酸進(jìn)行測(cè)定。詳細(xì)方法介紹見(jiàn)文獻(xiàn)［29］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 遺傳學(xué)分析 用遺傳學(xué)軟件 Shesis進(jìn)行常規(guī)群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析（包括基因頻率、基因型頻率、Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)等），同時(shí)進(jìn)行連鎖不平衡和單倍型分析［30］。

1.4.2 關(guān)聯(lián)分析 利用多因素方差分析法分析FADS2基因多態(tài)性及其單倍型對(duì)乳中脂肪酸組成的影響，模型如下：

式中：Yijk為原料乳脂肪酸的測(cè)定值；μ為總體均值；Mi為泌乳階段的固定效應(yīng)（i =1，2），泌乳階段按100 d間隔劃為一個(gè)階段，即泌乳后101—200 d為泌乳中期，201—300 d為泌乳后期；Pj為胎次固定效應(yīng)（j=1，2）；Gk為FADS2基因SNP位點(diǎn)基因型或單倍型的固定效應(yīng)，eijk為隨機(jī)殘差。不同基因型或單倍型間的多重比較用Duncan法。分析單倍型對(duì)乳中FA組成的影響時(shí)，只選擇在2個(gè)位點(diǎn)均是純合子的個(gè)體進(jìn)行分析。另外，由于部分牛只乳中體細(xì)胞數(shù)大于5.0×105·mL-1，初步認(rèn)定患有隱性乳房炎，在最后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)刪除了這部分樣品的數(shù)據(jù)。最后用于FADS2基因 SNP多態(tài)與脂肪酸含量分析的樣品量為275頭。

以上統(tǒng)計(jì)分析由 SPSS軟件（Ver 16.0）GLM （General Linear Model）過(guò)程完成。

2 結(jié)果

2.1 FADS2基因多態(tài)性檢測(cè)

對(duì)FADS2基因3′端2對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP存在3個(gè)SNP突變位點(diǎn)：c.1571 A＞G、c.2743 A＞G、c.2776 A＞G。結(jié)果與IBEAGHA-AWEMU等［21］對(duì)加拿大荷斯坦牛FADS2基因3′檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)信息完全一致，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。另外，由于c.2743 A＞G和c.2776 A＞G由于距離較近，連鎖程度較高，連鎖不平衡系數(shù)r2達(dá)0.7以上， 因此在隨后的飛行時(shí)間質(zhì)譜法中，只選擇c.2776 A＞G進(jìn)行檢測(cè)。

表2　FADS2基因 3′UTR等位基因、基因型頻率、單倍型頻率及H-W平衡檢驗(yàn)Table 2 The frequencies of genotypic， allelic and haplotypes， value of X2test significance for 3′UTR of FADS2 gene

2.2 等位基因、基因型頻率分布及連鎖不平衡分析

如表2表示，c.1571 A＞G位點(diǎn)GG型為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.800，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為0.887。c.2776 A＞G位點(diǎn)AA為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.673，A為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為0.819。經(jīng)X2檢驗(yàn)，c.2776 A＞G位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，而c.1571 A＞G位點(diǎn)基因型分布偏離Hardy-Weinberg平衡。

連鎖不平衡分析表明：c.1571 A＞G位點(diǎn)與c.2776 A＞G位點(diǎn)間連鎖不平衡系數(shù)r2為0.028。經(jīng)檢驗(yàn)，該連鎖不平衡系數(shù)未達(dá)到顯著水平（P＞0.05），說(shuō)明兩位點(diǎn)間不連鎖。單倍型分析表明：c.1571 A＞G位點(diǎn)與c.2776 A＞G位點(diǎn)有3種單倍型，GA、GG和AA頻率分別為0.705、0.181和0.114，AG型在群體中未出現(xiàn)。

2.3 脂肪酸測(cè)定

在本研究中，用氣相色譜儀在原料乳中共檢出23種脂肪酸（表3）。其中棕櫚酸（C16：0）所占比例最大（29.56％），油酸（C18：1）次之（24.32％），豆蔻酸（C14：0）、硬脂酸（C18：0）和亞油酸（C18：2）都占有較高比例，而長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（C20：3、C20：4和C22：6等）含量相對(duì)較少。就不飽和指數(shù)而言，C20的不飽和指數(shù)最高（88.18±1.06），其次為C18（70.13±0.41），最低為C16（4.66±0.21）；SFA、MUFA和PUFA的比例分別為66.68∶27.43∶5.89，SCFA∶MCFA∶LCFA的比例分別為3.30∶17.12∶79.58。

表3　原料乳脂肪酸所占比例Table 3 The proportion of each milk fatty acids in raw milk （M±SD）

2.4 FADS2基因?qū)θ橹兄舅犷愋图爸舅犸柡椭笖?shù)的影響

FADS2基因1571位點(diǎn)不同基因型乳中不同類型脂肪酸含量及方差分析見(jiàn)表4。由表4可知：FADS2 1571位點(diǎn)對(duì)C14：1含量、C14和C18不飽和指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），對(duì) C18：0、SFA和MUFA含量的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），對(duì)C4：0含量和短鏈FA的影響接近顯著水平（0.1＞P＞0.05），對(duì)其它不同類型脂肪酸含量及FA不飽和指數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。多重比較表明：GG型個(gè)體乳中C14：1含量、C14和C18不飽和指數(shù)顯著高于AG型（P＜0.05），C18：0和SFA含量顯著低于AG型（P＜0.05）；AA型個(gè)體乳中 MUFA含量顯著高于 AG型（P＜0.05）。

FADS2基因2776位點(diǎn)不同基因型乳中不同類型脂肪酸含量及方差分析見(jiàn)表5。由表5可知：FADS2 2776位點(diǎn)對(duì)C16：1含量、 C16和C20不飽和指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），對(duì)C14：1含量的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），對(duì)C14：0 和C20：0含量的影響接近顯著水平（0.1＞P＞0.05），對(duì)其他不同類型脂肪酸含量及 FA不飽和指數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。多重比較表明：GG型個(gè)體乳中C16：1含量、C16和C20不飽和指數(shù)顯著高于AG型和AA型（P ＜0.05），AG型個(gè)體乳中C14：1含量顯著高于AA型和GG型（P＜0.05）。

FDAS2-1571-2776不同單倍型對(duì)乳中不同類型脂肪酸含量及方差分析見(jiàn)表 6。由表 6可知：FDAS2-1571-2776單倍型對(duì)C16：1含量和C20不飽和指數(shù)的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），對(duì)C4：0 含量和C16不飽和指數(shù)的影響接近顯著水平（0.1＞P＞0.05），對(duì)其他不同類型脂肪酸含量及FA不飽和指數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。多重比較表明：?jiǎn)伪缎虶G型個(gè)體乳中C16：1含量和C20不飽和指數(shù)顯著高于GA型和AA型（P＜0.05）。

表4　 FADS2基因1571位點(diǎn)對(duì)不同類型脂肪酸含量的影響Table 4 The effect of FADS2-1571 on the relative content of different kinds of milk fatty acids （％， M±SE）

表5　 FADS2基因2776位點(diǎn)對(duì)不同類型脂肪酸含量的影響Table 5 The effect of FADS2-2776 on the relative content of different kinds of milk fatty acids （％， M±SE）

表6　FADS2基因1571-2776不同單倍型對(duì)脂肪酸含量的影響Table 6 The effects of haplotypes of FADS2-1571-2776 on the relative content of different kinds of milk fatty acids （％， M±SE）

3 討論

3.1 FADS2基因遺傳多態(tài)性分析

本研究首次對(duì)中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′UTR區(qū)部分序列進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn) 3個(gè) SNP位點(diǎn)，與IBEAGHA-AWEMU等［21］對(duì)加拿大荷斯坦牛FADS2基因3′UTR區(qū)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)信息進(jìn)行對(duì)比，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的SNP，隨后對(duì)其中2個(gè)SNP在大群體中進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)比較表明：c.1571 A＞G 位點(diǎn)A基因頻率低于加拿大荷斯坦牛相應(yīng)基因頻率， c.-2776 A＞G位點(diǎn)A基因頻率與加拿大荷斯坦牛相應(yīng)基因頻率基本一致，這種差異可能是由于所用種公牛不一致造成，同時(shí)也說(shuō)明FADS2基因3′UTR區(qū)c.1571 A＞G與c.-2776 A＞G間連鎖程度很低。另外，由于其他牛種或品種 FADS2基因序列沒(méi)有被報(bào)道，今后有必要加強(qiáng)這一領(lǐng)域的研究，特別是乳脂率含量較高的品種（如娟姍牛、更賽牛、牦牛、水牛等）。

3.2 FADS2基因多態(tài)與乳脂肪酸組成及不飽和指數(shù)的關(guān)系

FADS2是PUFA合成代謝途徑中關(guān)鍵的限速酶，其基因序列SNP突變對(duì)基因表達(dá)活性及血液和乳汁等體液中PUFA含量有較大影響，這已得到大量有關(guān)人類相關(guān)研究的證實(shí)［12-13，31-32］。本研究結(jié)果表明：FADS2基因 3′ UTR c.1571 A＞G對(duì) C14：1含量、MUFA含量、C14和C18不飽和指數(shù)的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），GG型個(gè)體乳中C14：1含量、C14 和 C18不飽和指數(shù)顯著高于 AG型（P＜0.05）。IBEAGHA-AWEMU等［21］對(duì)加拿大荷斯坦牛 FADS2基因與乳中FA含量的研究也得出類似結(jié)論。這說(shuō)明FADS2基因3′UTR區(qū)c.1571 A＞G對(duì)乳中UFA的含量有顯著影響。生物信息學(xué)分析表明（Target Scan 7.0，http：//www.targetscan.org/）：該位點(diǎn)是bta-miR-744結(jié)合位點(diǎn)，可能是該位點(diǎn)的突變改變了microRNA與基因的結(jié)合，從而改變相關(guān)基因表達(dá)量的變化，最終導(dǎo)致乳中UFA含量的改變，但這一假設(shè)需要進(jìn)一步用試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

在本研究中，F(xiàn)ADS2 2776位點(diǎn)對(duì)C16：1含量、C16和C20不飽和指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），對(duì)C14：1含量的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），GG型個(gè)體乳中C16：1含量、C16和C20不飽和指數(shù)顯著高于AG型和AA型（P＜0.05）。而IBEAGHAAWEMU等［21］的研究表明：FADS2-2776 G基因顯著增加在乳中 omega-6 FAs（C20：3n6 和 C20：4n6）含量，而A基因顯著降低乳中omega-6 FAs含量。本研究中雖未發(fā)現(xiàn)FADS2 2776位點(diǎn)對(duì)C20：3n6和C20：4n6含量的影響，但對(duì)C20不飽和指數(shù)有顯著影響，且G基因?qū)υ黾尤橹蠧20：3n6和C20：4n6含量也是有利的。

最后，雖然本研究初步發(fā)現(xiàn)FADS2基因3′UTR區(qū)部分 SNP突變及其單倍型對(duì)乳中脂肪酸（特別是PUFA含量）和部分不飽和指數(shù)有顯著影響。也應(yīng)看到，由于各方面原因，本研究原料乳中FA測(cè)定的樣本量相對(duì)較少，有必要對(duì)大樣本奶牛群體進(jìn)行每月一次的跟蹤測(cè)定。如能改進(jìn)乳中測(cè)定方法，在進(jìn)行奶牛群生產(chǎn)性能測(cè)定（dairy herd improvement， DHI）時(shí)同時(shí)分析乳中FA含量，這對(duì)準(zhǔn)確估計(jì)原料乳中FA含量的遺傳參數(shù)和把乳中FA含量納入奶牛的育種目標(biāo)將大有幫助。

4 結(jié)論

在中國(guó)荷斯坦牛FADS2基因3′UTR區(qū)檢測(cè)到3 個(gè)SNP突變，該突變對(duì)中國(guó)荷斯坦牛乳中脂肪酸組成有重要影響。在進(jìn)一步驗(yàn)證其功能情況下，可作為影響中國(guó)荷斯坦奶牛乳脂肪酸組成的主效基因加以利用。

References

［1］ HARVATINE K J， BOISCLAIR Y R， BAUMAN D E. Recent advances in the regulation of milk fat synthesis. Animal， 2009（3）：40-54.

［2］ WOODS V B， FEARON A M. Dietary sources of unsaturated fatty acids for animals and their transfer into meat， milk and eggs： a review. Livestock Science， 2009， 126： 1-20.

［3］ LEE H， PARK W J. Unsaturated fatty acids， desaturases， and human health. Journal of Medicinal Food， 2014， 17（2）： 189-197.

［4］ TALPUR F N， BHANGER M I， KHOOHARO A A， MENON G Z. Seasonal variation in fatty acid composition of milk from ruminants reared under the traditional feeding system of Sindh， Pakistan. Livestock Science， 2008， 118： 166-172.

［5］ TALPUR F N， BHANGER M I， KHUHAWAR M Y. Comparison of fatty acid and cholesterol content in the milk of Pakistani cow breeds. Journal of Food Composition and Analysis， 2006， 19： 698-703.

［6］ HADDAD I， MOZZON M， STRABIOLI R， FREGA N C. Stereospecific analysis of triacylglycerols in camel （Camelus dromedarius） milk fat. International Dairy Journal， 2010， 20：863-867.

［7］ WIKING L， NIELSEN J H， B?VIUS A K， EDVARDSSON A，SVENNERSTEN-SJAUNJA K. Impact of milking frequencies on the level of free fatty acids in milk， fat globule size， and fatty acid composition. Journal of Dairy Science， 2006， 89： 1004-1009.

［8］ GUILLOU H， RIOUX V， CATHELINE D， THIBAULT J N，BOURIEL M， JAN S， D'ANDREA S， LEGRAND P. Conversion of hexadecanoicacid to hexadecenoic acid by rat Delta 6-desaturase. The Journal of Lipid Research， 2003， 44（3）： 450-454.

［9］ DANDREA S， GUILLOU H， JAN S， CATHELINE D， THIBAULT J N， BOURIEL M， RIOUX V， LEGRAND P. The same rat Delta6-desaturase not only acts on 18- but also on 24-carbon fatty acids invery-long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis. Biochemical Journal， 2002， 361（1）： 49-55

［10］ MARTINELLI N， GIRELLI D， MALERBA C， GUARINI P， ILLIG T，TRABETTI E， SANDRI M， FRISO S， PIZZOLO F， SCHAEFFER L，HEINRICH J， PIGNATTI P F， CORROCHER R， OLIVIERI O. FADS genotypes and desaturase activity estimated by the ratio of arachidonic acid to linoleic acid are associated with inflammation and coronary artery disease. The American Journal of Clinical Nutrition， 2008， 88：941-949.

［11］ KOHAMA T， OLIVERA A， EDSALL L， NAGIEC M M， DICKSON R， SPIEGEL S. Molecular cloning and functional characterization of marine sphingosine kinase. The Journal of Biological Chemistry， 1998，273（37）： 23722-23728.

［12］ NWANKWO J O， SPECTOR A A， DOMANN F E. A nucleotide insertion in the transcriptional regulatory region of FADS2 gives rise to human fatty acid delta-6-desaturase deficiency. The Journal of Lipid Research， 2003， 44（12）： 2311-2319.

［13］ NAKAYAMA K， BAYASGALAN T， TAZOE F， YANAGISAWA Y，GOTOH T， YAMANAKA K， OGAWA A， MUNKHTULGA L，CHIMEDREGZE U， KAGAWA Y， ISHIBASHI S， IWAMOTO S. A single nucleotide polymorphism in the FADS1/FADS2 gene is associated with plasma lipid profiles in two genetically similar Asian ethnic groups with distinctive differences in lifestyle. Human Genetics，2010， 127： 685-690.

［14］ ILLIG T， GIEGER C， ZHAI G， ROMISCH-MARGL W，WANG-SATTLER R， PREHN C， ALTMAIER E， KASTENMULLER G， KATO B S， MEWES H W， MEITINGER T， DE ANGELIS M H，KRONENBERG F， SORANZO N， WICHMANN H E， SPECTOR T D， ADAMSKI J， SUHRE K. A genome-wide perspective of genetic variation in human metabolism. Nature Genetics， 2010， 42（2）：137-141.

［15］ KATHIRESAN S， MELANDER O， GUIDUCCI C， SURTI A，BURTT N P， RIEDER M J， COOPER G M， ROOS C， VOIGHT B F，HAVULINNA A S， WAHLSTRAND B， HEDNER T， CORELLA D，TAI E S， ORDOVAS J M， BERGLUND G， VARTIAINEN E，JOUSILAHTI P， HEDBLAD B， TASKINEN M R， CHEH C N，SALOMAA V， PELTONEN L， GROOP L， ALTSHULER D M，ORHO-MELANDER M. Six new loci associated with blood lowdensity lipoprotein cholesterol， high-density lipoprotein cholesterol or triglycerides in humans. Nature Genetics， 2008， 40（2）： 189-197.

［16］ TANAKA T， SHEN J， ABECASIS G R， KISIALIOU A， ORDOVAS J M， GURALNIK J M， SINGLETON A， BANDINELLI S， CHERUBINI A， ARNETT D， TSAI M Y， FERRUCCI L. Genome-wide association study of plasma polyunsaturated fatty acids in the InCHIANTI study. PLoS Genetics， 2009， 5（1）： e1000338.

［17］ HOWARD T D， MATHIAS R A， SEEDS M C， HERRINGTON D M，HIXSON J E， SHIMMIN L C， HAWKINS G A， SELLERS M，AINSWORTH H C， SERGEANT S， MILLER L R， CHILTON F H. DNA methylation in an enhancer region of the FADS cluster is associated with FADS activity in human liver. PLoS ONE， 2014， 9（5）：e97510.

［18］ RENAVILLE B， PRANDI A， FANB B， SEPULCRI A， ROTHSCHILD M F ， PIASENTIER E. Candidate gene marker associations with fatty acid profiles in heavy pigs. Meat Science ， 2013， 93： 495-500.

［19］ BOSCHETTI E， BORDON A， MELUZZI A， CASTELLINI C， DAL BOSCO A， SIRRI F. Fatty acid composition of chicken breast meat is dependent on genotype-related variation of FADS1 and FADS2 gene expression and desaturating activity. Animal， 2015， 16： 1-9.

［20］ DA COSTA A S H， BESSA R J B， PIRES V M R， ROLO E A，PINTO R M A， FONTES C M G A， PRATES J A M. Is hepatic lipid metabolism of beef cattle influenced by breed and dietary silage level？. BMC Veterinary Research， 2014， 10： 65-78.

［21］ IBEAGHA-AWEMU E M， AKWANJI K A， BEAUDOIN F， ZHAO X. Associations between variants of FADS genes and omega-3 and omega-6 milk fatty acids of Canadian Holstein cows. BMC Genetics，2014， 15： 25

［22］ 梅秀麗. 優(yōu)質(zhì)雞不同飼養(yǎng)方式下 FADS1-FADS2基因的表達(dá)及其對(duì)脂肪酸組成的影響［D］. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012. MEI X L. Fatty acid desaturase （FADS1） and fatty acid desaturase 2（FADS2） gene expression and the effects on fatty acids content of high-quality chicken in different housing systems［D］. Ya'an： Sichuan Agricultural University， 2012. （in Chinese）

［23］ 朱世康. 雞FADS2基因5'_端SNP鑒定及啟動(dòng)子功能分析［D］. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013. ZHU S K. Polymorphisms in the 5' region of chicken FADS2 gene and the promoter function analysis［D］. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2013. （in Chinese）

［24］ 洪雪瑩. 雞FADS2基因3_UTR區(qū)多態(tài)性檢測(cè)及其與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析［D］. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012. HONG X Y. Polymorphisns in the 3'UTR region of chicken FADS2 Gene and their association with economic traits［D］. Zhengzhou：Henan Agricultural University， 2012. （in Chinese）

［25］ 盧冉. 雞Δ6脂肪酸脫氫酶基因啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性及基因時(shí)空表達(dá)的研究［D］. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011. LU R. Study of chickenΔ6 fatty acid desaturase gene's promotor region polymorphism and gene expression［D］. Zhengzhou： HenanAgricultural University， 2011. （in Chinese）

［26］ ZHU S K， TIAN Y D， ZHANG S， CHEN Q X， WANG Q Y， HAN R L，KANG X T. Adjacent SNPs in the transcriptional regulatory region of the FADS2 gene associated with fatty acid and growth traits in chickens. Genetics Molecular Research， 2014， 13（2）： 3329-3336.

［27］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定： GB 5413.27—2010［S/OL］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. National Food Safety Standard-Determination of Fatty Acids in Foods for Infants and Young Children， Milk and Milk Products： GB 5413.27—2010［S/OL］. Beijing： Standards Press of China， 2010. （in Chinese）

［28］ 林秋萍， 李瑾， 馮書(shū)惠. 氣相色譜法快速測(cè)定牛奶中脂肪酸. 食品科學(xué)， 2005， 26（8）： 346-348. LIN L P， LI J， FENG S H. Fast quantitative determination of fatty acid in milk. Food Science. 2005， 26（8）： 346-348. （in Chinese）

［29］ 毛永江， 常玲玲， 楊章平， 吳海濤， 陳瑩， 施雪奎， 李云龍， 梁祥煥，尹召華. 中國(guó)荷斯坦牛乳中體細(xì)胞評(píng)分與脂肪酸含量和組成的相關(guān)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011， 44（24）： 5073-5082. MAO Y J， CHANG L L， YANG Z P， WU H T， CHEN Y， SHI Y K， LI Y L， LIANG X H， YIN Z H. Correlation between the SCS and the amount and composition of fatty acids in milk of Chinese Holstein. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（24）： 5073-5082. （in Chinese）

［30］ SHI Y Y， HE L. SHEsis， a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium， haplotype construction， and genetic association at polymorphism loci. Cell Research， 2005， 15（2）： 97-98.

［31］ SOLAKIVI T， KUNNAS T， JAAKKOLA O， RENKO J， LEHTIM?KI T，NIKKARI S T. Delta-6-desaturase gene polymorphism is associated with lipoprotein oxidation in vitro. Lipids in Health and Disease， 2013，12： 80.

［32］ SONG Z K， CAO H Y， QIN L， JIANG Y F. A case-control study between gene polymorphisms of polyunsaturated fatty acid metabolic rate-limiting enzymes and acute coronary syndrome in Chinese Han Population. BioMed Research International， 2013， ID： 928178. http：ldx.doi.org/10.1155/2013/928178.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Effects of SNPs in the 3' Untranslated Regions of FADS2 on the Composition of Fatty Acids in Milk of Chinese Holstein

XU Chen-xi， WANG Meng-qi， ZHU Xiao-rui， ZHANG Yu-feng， XIA Hai-lei， LIU Xian-hui， WANG Xiao-long，ZHANG Hui-min， YANG Zhang-ping， MAO Yong-jiang
（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， Jiangsu）

Abstract：【Objective】D-6-fatty acid desaturase 2 （FADS2） is one of the key limiting enzymes in the conversion of dietaryessential 18 carbon PUFAs （18C-PUFAs） such as linoleic acid （LNA，C18：2n-6） to γ-linolenic acid （GLA， 18：3n6）， eicosapentaenoic acid （EPA， C20：5n3） and docosahexaenoic acid （DHA， C22：6n3）. The objective of this study was to investigate the effects of SNPs in the 3' untranslated regions of FADS2 gene on the compositions of fatty acids in milk of Chinese Holstein.【Method】In this study，20 Chinese Holstein cows were selected randomly for PCR amplification and sequencing of the 3' untranslated regions of FADS2 gene used for SNP discovery. Then the Chinese Holstein cows （n =551） were genotyped using Sequenom MassARRAY （Sequenom Inc.， San Diego， CA） based on the previous SNP information in this study， and the associations between SNPs or haplotypes and compositions of fatty acids， unsaturated indexes of fatty acids in milk were analyzed by the least squares method in the GLM procedure of SPSS.【Result】Three SNPs （c.1571 A＞G， c.2743 A＞G and c.2776 A＞G） were identified in the 3' untranslated regions of FADS2 gene. The genotype GG was the dominant genotype， which the frequencies were 0.800 for c.1571 A＞G， allele G was dominant allele with the frequency of 0.887. The genotype AA was the dominant genotype， which the frequencies were 0.673 for c. 2776 A＞G. The allele A was dominant allele with the frequency of 0.819. The coefficient of disequilibrium was 0.028 between c.1571 A＞G and c.2776 A＞G， which was not significant at P＜0.05. There were 3 haplotypes for FADS2 c.1571 A＞G and c.2776 A＞G， which the frequencies were 0.705， 0.181 and 0.114 for GA， GG and AA， respectively. Χ2test indicated that the c.2776 A＞G fitted with Hardy-Weinberg equilibrium in the population （P＞0.05）， and the c.1571 A＞G deviated from Hardy-Weinberg equilibrium （P＜0.05）. The SNP c.1571 A＞G showed a very significant association with C14：1， unsaturated indexes of C14 and C18 （P＜0.01）， and significant association with C18：0， SFA and MUFA （P＜0.05）. The individuals with genotype GG had higher C14：1， unsaturated indexes of C14 and C18 than genotypes AG （P＜0.05）. The SNP c.2776 A＞G showed a very significant association with C16：1， unsaturated indexes of C16 and C20 （P＜0.01）， and significant association with C14：1 （P＜0.05）. The individuals with genotype GG had higher C16：1， unsaturated indexes of C16 and C20 than genotypes AG and AA （P＜0.05）. In the meantime， the haplotype of FADS2 1571-2776 showed a significant association with C16：1， unsaturated indexes of C20 （P＜0.05）. The individuals with genotype GG had higher C16：1， unsaturated indexes of C20 than genotypes GA and AA （P＜0.05）. 【Conclusion】The SNPs in the 3' untranslated regions of FADS2 gene have significant genetic effects on composition of fatty acids in milk， but further investigation will be required to elucidate the biological and practical relevance of these SNPs.

Key words：Chinese Holstein； FADS2； SNPs； composition of fatty acids

收稿日期：2015-10-28；接受日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31272407， 31372286，31472067）、江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科（PAPD）、國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（201411117031）、江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（201411117031Z）