聶瑞強(qiáng)，楊玉靜，謝建山,2，范瑞文，高文俊，董常生

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原030001）

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黑色素細(xì)胞中過量表達(dá)Pax610Neu基因?qū)ITF和TYR的影響

聶瑞強(qiáng)1，楊玉靜1，謝建山1,2，范瑞文1，高文俊1，董常生1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原030001）

摘要：【目的】 MITF和β-catenin是黑色素生成通路中重要的調(diào)節(jié)基因，而Pax6通過調(diào)控MITF和β-catenin來調(diào)控黑色素細(xì)胞的黑色素生成，通過對只含有正常Pax6 paird domain 的前102個氨基酸的Pax610Neu的研究，來探究Pax610Neu是否還有生物學(xué)功能，以及Pax6對其下游基因的作用機(jī)理。【方法】根據(jù)NCBI查找到的Pax610Neu基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，克隆Pax610Neu，收集所得基因片段送華大基因測序確認(rèn)。后通過對Pax610Neu和慢病毒表達(dá)載體的序列分析來篩選合適的酶切位點(diǎn)，通過分析選取Sal I和Xba I作為酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含有Sal I和Xba I酶切位點(diǎn)的PCR引物，大量克隆Pax610Neu基因，從而通過膠回收得到含有Sal I和Xba I酶切位點(diǎn)的Pax610Neu基因。將含有酶切位點(diǎn)的目的片段與T載體相連，并送華大基因測序。將與T載體連接成功的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞使其大量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，雙酶切后，膠回收，得到大量含有Sal I和Xba I酶切位點(diǎn)的Pax610Neu基因片段，將其與含有小鼠tyrp2特異性啟動子和綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒表達(dá)載體相連接，送華大基因測序確認(rèn)。將連接好的慢病毒表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞使其大量擴(kuò)增，通過質(zhì)粒中提試劑盒獲得大量去內(nèi)毒素的Pax610Neu慢病毒真核表達(dá)載體。將慢病毒真核表達(dá)載體通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染導(dǎo)入到培養(yǎng)的綿羊黑色素細(xì)胞中，使其過量表達(dá)。收集細(xì)胞，分別通過觀察綠色熒光蛋白和使用RT-PCR來檢測轉(zhuǎn)染效率，使用RT-PCR和Western blot來檢測MITF和TYR在mRNA和蛋白水平的變化，同時檢測黑色素細(xì)胞中黑色素生成量的變化?！窘Y(jié)果】與正常組相比，在mRNA水平，MITF顯著升高3.2倍（P＜0.05），TYR升高1.31倍，由此得出，Pax610Neu可以有效促進(jìn)MITF mRNA 的產(chǎn)生，對TYR mRNA產(chǎn)生的影響不是太顯著；在蛋白質(zhì)水平，MITF顯著升高8.24倍（P＜0.001），TYR顯著升高2.09倍（P＜0.001），由此得出，Pax610Neu可以顯著提高M(jìn)ITF 、TYR 蛋白的產(chǎn)生；同時黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的量顯著升高1.22倍（P＜0.05），由此得出Pax610Neu可以有效促進(jìn)黑色素細(xì)胞黑色素的生成。【結(jié)論】只含有正常Pax6 paird domain前102個氨基酸的Pax610Neu，仍然可以在黑色素細(xì)胞中與MITF相互作用，同時間接調(diào)控TYR的表達(dá)，從而使黑色素細(xì)胞黑色素的生成量發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞：Pax610Neu；Pax6；MITF；TYR；黑色素

聯(lián)系方式：聶瑞強(qiáng)，E-mail：ibernie@126.com。通信作者董常生，E-mail：cs_dong@sxau.edu.cn

0 引言

【研究意義】動物的毛色是動物經(jīng)濟(jì)價值的重要指標(biāo)之一。目前，毛紡織品的多彩主要是靠化學(xué)染料染色，對人體和環(huán)境都有危害，如果可以通過基因工程從動物自身來改變毛色，豐富動物的天然毛色，對提高毛用動物的經(jīng)濟(jì)價值，以及保護(hù)人體健康和環(huán)境都有很大的好處。動物的毛色主要是由位于皮膚內(nèi)的黑色素的種類和數(shù)量決定的。在黑色素生成通路中，MITF是其中的一個關(guān)鍵調(diào)控基因［1］。MITF點(diǎn)突變可以導(dǎo)致動物被毛白化［2-3］，miR-137調(diào)控MITF的表達(dá)量可以使小鼠毛色改變［4］。而Pax6可以通過調(diào)控MITF的表達(dá)來調(diào)控黑色素的生成［5-6］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BAUMER等2003年在突變小鼠中發(fā)現(xiàn)Pax6與Pax2的復(fù)合物對于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分化和發(fā)育是必須的［7］。朱芷葳等 2012年發(fā)現(xiàn)Pax3參與了黑色素細(xì)胞的增殖、分化和遷移，Pax3與色素的形成相關(guān)［8］。RAVIV 等2014年發(fā)現(xiàn)，Pax6在調(diào)控MITF的表達(dá)時，同時會通過另一快捷途徑向MITF發(fā)出前饋信號，使Pax6調(diào)控MITF的過程更加準(zhǔn)確［5］。FUJIMURA等2015年通過對小鼠基因的選擇性敲除發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)育過程中，Pax6會與β-catenin相互作用［9］，而β-catenin是已知色素生成通路中的關(guān)鍵基因［10-11］。Pax（paired box）家族屬于轉(zhuǎn)錄因子中高度保守的家族，在脊椎動物中共包含9個成員（Pax1— Pax9），其3個保守結(jié)構(gòu)域包括配對域（paireddomain，PD）、八肽域（octapeptide，OP）和同源域（homeodomain，HD）［12-13］。Pax家族廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)過程［14］，在胚胎和神經(jīng)嵴的發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用［15］。Pax基因在體內(nèi)表達(dá)紊亂時，會使多個器官組織發(fā)育畸形［16］。Pax6是由PD和HD組成，Pax 基因中，編碼PD的序列非常保守，是其作為轉(zhuǎn)錄因子與其調(diào)控基因相互作用的主要功能域，而PD是由氨基端（PAI）和羧基端（RED）兩個亞結(jié)構(gòu)域連接組成的（PAI+ RED=PAIRED），PAI直接和其調(diào)控基因相互作用，RED則輔助Pax因子與目標(biāo)基因的相互連接；在其家族進(jìn)化過程中，編碼PAI的序列比編碼RED的序列的保守性高，種間差異小［16-17］。FAVOR等在2001年對小鼠Pax6進(jìn)行以表型為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了9 個Pax6的突變體（Pax62Neu—Pax610Neu），其中7個在轉(zhuǎn)錄時提前終止且小鼠表型上沒有變化。Pax610Neu就是其中之一。Pax610Neu在堿基對發(fā)生替換時，在paired box的羧基端產(chǎn)生了一個終止密碼子，這個突變體產(chǎn)物包含正常 Pax6前 102個氨基酸，丟失了paired domain的最后43個氨基酸，以及連接區(qū)域、同源域和P/S/T region［18］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于編碼PD的序列十分保守，是Pax 蛋白與DNA 結(jié)合的主要功能域［16］。而Pax610Neu中只包含PD高度保守的區(qū)段，那么 Pax610Neu在分子水平上是否還具有一定的作用，其是否仍然可以在黑色素細(xì)胞中與其調(diào)控的下游基因相互作用？且從未有研究以Pax610Neu為切入點(diǎn)來研究Pax6作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的具體功能位點(diǎn)。這對研究Pax6的功能位點(diǎn)，以及對動物毛色形成機(jī)理的研究都有重要的意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)在細(xì)胞水平上通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過量表達(dá) Pax610Neu，以探究 Pax610Neu是否仍與MITF和TYR相互作用。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年1—10月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

試劑：DMEM培養(yǎng)基（Life，美國）、黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基（Sciencell，美國）、Trizol（Invitrogen，美國）、RT-PCR kit（康為，北京）、MITF多克隆抗體、TYR多克隆抗體、RIPA蛋白裂解液（碧云天，北京）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠 Pax610Neu基因序列的獲取 通過 NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）來查找獲得。

1.2.2 小鼠Pax610Neu基因片段的克隆 使用Trizol法提取小鼠皮膚總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成相應(yīng)的cDNA。設(shè)計(jì)Pax610Neu基因引物（表1），送華大基因公司合成。使用普通PCR擴(kuò)增目的基因，膠回收后送華大基因公司雙向測序確認(rèn)。

1.2.3 Pax610Neu基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 首先使用連有SalⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)的Pax610Neu基因與T載體相連，測序成功后，將Pax610Neu基因用SalⅠ、XbaⅠ酶切下，膠回收后，再連接啟動子為黑色素細(xì)胞特異性啟動子小鼠 tyrp2的慢病毒載體（載體為實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 試驗(yàn)所用細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存的第6代綿羊黑色素細(xì)胞。將細(xì)胞從液氮中取出，置于37℃水浴鍋中，使其快速溶解。復(fù)蘇后的細(xì)胞接種于加有黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基的6孔板上，在37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 設(shè)置正常組、空載組和試驗(yàn)組，在6孔板的每孔加入大約1.8 mL含血清的正常培養(yǎng)基，接種1×106個細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞至鋪滿底部75％；正常組為正常培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞，空載組和試驗(yàn)組中的細(xì)胞，在傳代1 d后，加入轉(zhuǎn)染試劑與表達(dá)載體形成的脂質(zhì)體，混勻，37℃培養(yǎng)24 h，吸去含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，每孔加入1.8 mL 含血清的正常培養(yǎng)基。在37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞48 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)染結(jié)果檢測。

表1　試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 黑色素含量測定 用胰酶將黑色素細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)板上消化下來，用PBS清洗3 次后細(xì)胞計(jì)數(shù)。用0.2 mol·L-1NaOH（1×106cells/mL）溶解細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀在475 nm 波長進(jìn)行測值［19］。用黑色素標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組重復(fù)3次。

1.2.7 Real-time PCR檢測 使用Trizol法提取細(xì)胞RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。由于Pax610Neu基因序列長度只有309 bp，故直接使用普通PCR引物作為熒光定量PCR引物（表1），且通過試驗(yàn)其效果良好。根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果的CT 值計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果，目的基因的相對表達(dá)水平=2-△△CT，所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means ± SEM）表示，其中各基因的表達(dá)量均經(jīng)β-actin校正，兩組之間的數(shù)據(jù)比較全部采用GraphPad Prism5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，3組之間的比較全部采用單因素方差分析。

1.2.8 蛋白免疫印跡試驗(yàn) 用RIPA蛋白裂解液提取黑色素細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，后轉(zhuǎn)至NC膜。MITF和TYR抗體所用濃度為1000倍稀釋。孵育二抗后，用ECL顯色后暗室曝光，獲得有條帶的膠片，分析。用Image-ProPlus 6.0 軟件對綿羊MITF、TYR和β-actin 結(jié)果進(jìn)行條帶面積和灰度值半定量分析，數(shù)據(jù)均用Means ± SEM 表示，兩組之間的數(shù)據(jù)比較全部采用GraphPad Prism5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，3組之間的比較全部采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Pax610Neu基因序列的獲得

小鼠Pax610Neu基因mRNA在GeneBank中的編號為AJ307468.1。

2.2 小鼠 Pax610Neu氨基酸序列與綿羊 Pax6氨基酸序列比對

經(jīng)過小鼠與綿羊Pax6蛋白質(zhì)（XP_011951552.1）前102個氨基酸序列的比對，發(fā)現(xiàn)小鼠Pax610Neu氨基酸序列與綿羊Pax6前102個氨基酸序列的相似性為99.02％（圖 1）。故通過綿羊黑色素細(xì)胞來驗(yàn)證小鼠Pax610Neu是否還有其生物學(xué)功能是可行的。

2.3 Pax家族氨基酸序列比對

Pax家族的 9個成員的氨基酸序列同源性為32.56％。Pax6的保守區(qū)域主要集中于前130個氨基酸處，而Pax610Neu的氨基酸序列為其保守區(qū)的前102個氨基酸（圖2），故Pax610Neu很可能還保留有Pax6的生物學(xué)功能。

圖1　Pax610Neu氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of amino acid sequence of Pax610Neu

圖2　小鼠PAX家族氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of PAX family of mouse

2.4 Pax610Neu真核表達(dá)載體構(gòu)建

PCR純化的Pax610Neu基因被連接到含有可在黑色素細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)的小鼠 tyrp2啟動子的慢病毒質(zhì)粒載體中，同時該載體連接有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（圖3）。

連接后的表達(dá)載體送華大基因公司進(jìn)行了測序，結(jié)果完全符合預(yù)期大小，并且通過比對在NCBI中找到了與Pax610Neu序列完全一致的區(qū)域。

2.5 黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞接種12 h后，即可見細(xì)胞貼壁伸展，24 h后細(xì)胞呈典型的樹突狀（圖4-A， B）。

2.6 質(zhì)粒真核表達(dá)載體在黑色素細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染

2.6.1 黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測 在黑色素細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且通過綠色熒光的觀察（圖4-C，D，E，F(xiàn)）和RT-PCR來檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果可以表明試驗(yàn)構(gòu)建的真核表達(dá)載體可以在黑色素細(xì)胞中正常表達(dá)且通過熒光定量 PCR發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組中 Pax610Neu被極顯著的提高（P＜0.001）（圖5）。

圖3　Pax610Neu真核表達(dá)載體Fig. 3 Structure of over-expressing Pax610Neu

圖4　黑色素細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染熒光圖Fig. 4 The pictures of cell culture and green fluorescence

2.6.2 Western blot 檢測MITF、TYR蛋白在轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞中的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞的蛋白質(zhì)，使用Western blot檢測后，通過統(tǒng)計(jì)分析獲得結(jié)果顯示（圖6），與正常組相比，試驗(yàn)組MITF蛋白顯著升高8.24倍，TYR蛋白顯著升高2.09倍。由此得出，Pax610Neu可以顯著提高M(jìn)ITF、TYR蛋白的產(chǎn)生（P＜0.001）。

2.6.3 轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞MITF和TYR mRNA表達(dá)量檢測 提取轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞的 RNA后，通過熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示（圖7）：與正常組相比，試驗(yàn)組MITF mRNA顯著升高3.2倍（P＜0.05），TYR mRNA升高1.31倍。由此得出，Pax610Neu可以顯著促進(jìn)MITF mRNA的產(chǎn)生，對TYR mRNA的影響不顯著。

2.6.4 轉(zhuǎn)染后黑色素含量測定 收集黑色素細(xì)胞，用酶標(biāo)儀對黑色素含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的黑色素細(xì)胞中，試驗(yàn)組黑色素含量是空白組的1.22倍（P＜0.05）（圖8）。

圖5　Pax610Neu轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞的效率Fig. 5 Pax610NeumRNA levels in melanocytes transfected with the Pax610Neustructure

圖6　Pax610Neu轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞MITF、TYR蛋白的表達(dá)量Fig. 6 Western blot analysis of MITF， TYR expression in melanocytes transfected with the Pax610Neustructure and vector control

圖7　轉(zhuǎn)染Pax610Neu后黑色素細(xì)胞的MITF和TYR mRNA檢測Fig. 7 Real-time PCR analysis of MITF，TYR expression in melanocytes transfected with the Pax610Neustructure

圖8　過表達(dá)Pax610Neu對黑色素細(xì)胞黑色素生成的影響Fig. 8 Melanin production in melanocytes over-expressing Pax610Neustructure

3 討論

本試驗(yàn)在分子水平上，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建Pax610Neu真核表達(dá)載體，研究Pax6調(diào)控黑色素生成的調(diào)節(jié)機(jī)制。試驗(yàn)通過Western bolt以及RT-PCR對黑色素細(xì)胞中的MITF和TYR進(jìn)行檢測，同時對黑色素細(xì)胞中黑色素含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示Pax610Neu的高表達(dá)可以促進(jìn)MITF的表達(dá)，并通過MITF調(diào)控促進(jìn)了 TYR的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素細(xì)胞生成黑色素的量。這個結(jié)果為進(jìn)一步研究 Pax6的功能域以及與MITF作用的功能區(qū)域提供了基礎(chǔ)。

FAVOR等發(fā)現(xiàn)Pax6的突變體Pax610Neu，并通過小鼠的表現(xiàn)型驗(yàn)證其為無效等位基因，從而得出Pax6功能的發(fā)揮需要全部的功能域都完整［18］，但是，通過本次試驗(yàn)結(jié)果得出，只含有正常Pax6 paird domain 的前102個氨基酸的Pax610Neu也可以與MITF相互作用，從而促進(jìn)MITF和TYR的表達(dá)。序列比對結(jié)果顯示，Pax610Neu含有多個paired domain的保守序列，所以可以推斷 Pax6與 MITF的作用位點(diǎn)很可能是在 paired domain高度保守的區(qū)域。

MAZUR在2013年發(fā)現(xiàn)Pax6通過與MITF相互作用來調(diào)節(jié)色素細(xì)胞的分化［20］。MITF具有堿性的螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)［21］，調(diào)控皮膚和視網(wǎng)膜色素細(xì)胞特異性基因的表達(dá)［22-23］。同時，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的發(fā)育中，Pax6也調(diào)控黑色素生成通路中Wnt/β-catenin通路的β-catenin［24-25］。

在生命進(jìn)化過程中，生物大分子之間的相互作用和調(diào)控有多種多樣的方式，包括實(shí)驗(yàn)證實(shí)的和未證實(shí)的，Pax6在黑色素細(xì)胞中的作用機(jī)理，及其結(jié)構(gòu)的不完整性對其作用的影響還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

只含有正常Pax6 paird domain前102個氨基酸的Pax610Neu仍然可以在黑色素細(xì)胞中與MITF相互作用，從而間接調(diào)控TYR的表達(dá)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞黑色素的生成。

References

［1］ PAN L， MA X， WEN B， SU Z， ZHENG X， LIU Y， LI H， CHEN Y，WANG J， LU F， QU J， HOU L. Microphthalmia-associated transcription factor/T-box factor-2 axis acts through Cyclin D1 to regulate melanocyte proliferation. Cell Proliferation， 2015， 48：631-642.

［2］ KURITA K， NISHITO M， SHIMOGAKI H， TAKADA K，YAMAZAKI H， KUNISADA T. Suppression of progressive loss of coat color in microphthalmia-vitiligo mutant mice. The Journal of Investigative Dermatology， 2005， 125（3）：538-544.

［3］ YUSNIZAR Y， WILBE M， HERLINO A O， SUMANTRI C， NOOR R R， BOEDIONO A， ANDERSSON L， ANDERSSON G. Microphthalmiaassociated transcription factor mutations are associated with whitespotted coat color in swamp buffalo. Animal Genetics， 2015， 46：676-682.

［4］ DONG C， WANG H， XUE L， DONG Y， YANG L， FAN R， YU X，TIAN X， MA S， SMITH G W. Coat color determination by miR-137 mediated down-regulation of microphthalmia-associated transcription factor in a mouse model. RNA， 2012， 18（9）：1679-1686.

［5］ RAVIV S， BHARTI K， RENCUS-LAZAR S， COHEN-TAYAR Y，SCHYR R， EVANTAL N， MESHORER E， ZILBERBERG A，IDELSON M， REUBINOFF B. PAX6 regulates melanogenesis in the retinal pigmented epithelium through feed-forward regulatory interactions with MITF. PLoS Genetics， 2014， 10（5）：e1004360.

［6］ BHARTI K， GASPER M， OU J， BRUCATO M， CLOREGRONENBORN K， PICKEL J， ARNHEITER H. A regulatory loop involving PAX6， MITF， and WNT signaling controls retinal pigment epithelium development. PLoS Genetics， 2012， 8（7）：e1002757.

［7］ BAUMER N， MARQUARDT T， STOYKOVA A， SPIELER D，TREICHEL D， ASHERY-PADAN R， GRUSS P. Retinal pigmented epithelium determination requires the redundant activities of Pax2 and Pax6. Development （Cambridge， England）， 2003， 130（13）： 2903-2915.

［8］ 朱芷葳， 賀俊平， 于秀菊， 李鵬飛， 程志學(xué)， 董常生. PAX3轉(zhuǎn)錄因子在羊駝皮膚組織中的表達(dá)和定位分析. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2012（5）：729-734.ZHU Z W， HE J P， YU X J， LEI P F， CHENG Z X， DONG C S. Expression and location analysis of pax3 transcription factor in Alpaca skin. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2012， 43（5）： 729-734. （in Chinese）

［9］ FUJIMURA N， KLIMOVA L， ANTOSOVA B， SMOLIKOVA J，MACHON O， KOZMIK Z. Genetic interaction between Pax6 and β-catenin in the developing retinal pigment epithelium. Development Genes and Evolution， 2015， 225（2）：121-128.

［10］ ZHU P Y， YIN W H， WANG M R， DANG Y Y， YE X Y. Andrographolide suppresses melanin synthesis through Akt/GSK3β/βcatenin signal pathway. Journal of Dermatological Science， 2015，79（1）：74-83.

［11］ PARK H J. CARI ONE induces anagen phase of telogenic hair follicles through regulation of β-catenin， stimulation of dermal papilla cell proliferation， and melanogenesis. Journal of Dietary Supplements，2014， 11（4）：320-333.

［12］ LANG D， POWELL S K， PLUMMER R S， YOUNG K P， RUGGERI B A. PAX genes： roles in development， pathophysiology， and cancer. Biochemical Pharmacology， 2007， 73（1）：1-14.

［13］ PAIXAO-CORTES V R， SALZANO F M， BORTOLINI M C. Origins and evolvability of the PAX family. Seminars in Cell & Developmental Biology， 2015， 44： 64-74.

［14］ BLAKE J A， ZIMAN M R. Pax genes： regulators of lineage specification and progenitor cell maintenance. Development （Cambridge， England）， 2014， 141（4）： 737-751.

［15］ MONSORO-BURQ A H. PAX transcription factors in neural crest development. Seminars in Cell & Developmental Biology， 2015，44：87-96.

［16］ 王秀， 王蔚， 王義權(quán). Pax基因功能及其選擇性剪接的研究進(jìn)展.生命科學(xué)， 2008， 20（1）：125-130. WANG X， WANG W， WANG Y Q. Progress in the study of Pax gene family and its alternative splicing. Chinese Bulletin of Life Sciences，2008， 20（1）：125-130. （in Chinese）

［17］ EBERHARD D， JIMENEZ G， HEAVEY B， BUSSLINGER M. Transcriptional repression by Pax5 （BSAP） through interaction with corepressors of the Groucho family. The EMBO Journal， 2000，19（10）：2292-2303.

［18］ FAVOR J， PETERS H， HERMANN T， SCHMAHL W， CHATTERJEE B， NEUHAUSER-KLAUS A， SANDULACHE R. Molecular characterization of Pax6（2Neu） through Pax6（10Neu）： an extension of the Pax6 allelic series and the identification of two possible hypomorph alleles in the mouse Mus musculus. Genetics， 2001， 159（4）： 1689-1700.

［19］ DONG Y， WANG H， CAO J， REN J， FAN R， HE X， SMITH GW，DONG C. Nitric oxide enhances melanogenesis of alpaca skin melanocytes in vitro by activating the MITF phosphorylation. Molecular and Cellular Biochemistry， 2011， 352（1/2）：255-260.

［20］ MAZUR M A， WINKLER M， GANIC E， COLBERG J K，JOHANSSON J K， BENNET H， FEX M， NUBER U A， ARTNER I. Microphthalmia transcription factor regulates pancreatic β-cell function. Diabetes， 2013， 62（8）：2834-2842.

［21］ HODGKINSON C A， MOORE K J， NAKAYAMA A， STEINGRIMSSON E， COPELAND N G， JENKINS N A， ARNHEITER H. Mutations at the mouse microphthalmia locus are associated with defects in a gene encoding a novel basic-helix-loop-helix-zipper protein. Cell， 1993，74（2）：395-404.

［22］ SHIBAHARA S， YASUMOTO K， AMAE S， UDONO T，WATANABE K， SAITO H， TAKEDA K. Regulation of pigment cell-specific gene expression by MITF//Pigment Cell Research Sponsored by the European Society for Pigment Cell Research and the International Pigment Cell Society， 2000， 13（8）：98-102.

［23］ SPENCE J R， MADHAVAN M， AYCINENA J C， DEL RIO-TSONIS K. Retina regeneration in the chick embryo is not induced by spontaneous Mitf downregulation but requires FGF/FGFR/MEK/Erk dependent upregulation of Pax6. Molecular Vision， 2007， 13：57-65.

［24］ ZHAO Y， WANG P， MENG J， JI Y， XU D， CHEN T， FAN R， YU X，YAO J， DONG C. MicroRNA-27a-3p Inhibits Melanogenesis in Mouse Skin Melanocytes by Targeting Wnt3a. International Journal of Molecular Sciences， 2015， 16（5）：10921-10933.

［25］ YUN C Y， YOU S T， KIM J H， CHUNG J H， HAN S B， SHIN E Y，KIM E G. p21-activated kinase 4 critically regulates melanogenesis via activation of the CREB/MITF and β-catenin/MITF pathways. The Journal of Investigative Dermatology， 2015， 135（5）：1385-1394.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

The Influences of Over-Expressing Pax610Neuon MITF and TYR in Melanocytes

NIE Rui-qiang1， YANG Yu-jing1， XIE Jian-shan1，2， FAN Rui-wen1， GAO Wen-jun1， DONG Chang-sheng1
（1College of Animal Science and Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi；2School of Basic Medical Sciences， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001）

Abstract：【Objective】 MITF and β-catenin are important regulatory genes of the melanin system. Pax6 regulates the production of melanin indirectly， through regulates MITF and TYR. In order to explore the function of Pax610Neuand the mechanism of Pax6 with its target genes， we explored the function of Pax610Neu， which only included 102 N-terminalanimo acids of the paird domain. 【Method】 According to the sequence of Pax610Neuin NCBI， the primers of Pax610Neuwere designed and synthesized byBGI. The coding sequences of Pax610Neuwere PCR amplified and then confirmed by sequencing. Sal I and Xba I restriction sites were selected by analyzing the sequences of Pax610Neuand the mammalian expression vector. The Pax610Neuwas cloned into the T-Vector， meanwhile， confirmed by sequencing. The fragment was then subcloned into a mammalian expression vector， resulting in a construction that contained a specific mouse tyrp2 promoter driving the expression of the green fluorescent protein （GFP） and the target fragment with Sal I and Xba I restriction sites. The plasmid vector was confirmed by sequencing. The expression vector was amplified by competent cells and obtained without endotoxin by the plasmid midiprep system. Then， the sheep melanocytes were transfected with the vector using Liposome 2000. There were three methods used in the results test which were quantitatively real-time PCR， western blot， and melanin content measurement. 【Result】 The results showed that the MITF mRNA， MITF and TYR protein， melanin content were significantly increased. MITF mRNA was significantly increased to 3.2 times （P＜0.05） and TYR mRNA was increased to 1.31 times， compared with control group， MITF protein was significantly increased to 8.24 times （P＜0.001） and TYR protein was significantly increased to 2.09 times （P＜0.001）. Meanwhile， the melanin content was significantly increased to 1.22 times （P＜0.05）. 【Conclusion】 We demonstrated that the Pax610Neustill interacts with MITF， and then regulated TYR indirectly， meanwhile changing the production of melanin of melanocytes.

Key words：Pax610Neu； Pax6； MITF； TYR； melanin

收稿日期：2015-10-28；接受日期：2015-12-25

基金項(xiàng)目：國家高科技研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2013AA102506）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303119）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)