鮑建軍,蘇　銳,王慶增,呂曉陽,高　雯,于嘉瑞,王利宏,陳　玲,吳文忠,盛水興,周　洪,孫　偉,戴國俊

（1揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009；2蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州215200；3徐州市睢寧縣林牧漁業(yè)局，江蘇睢寧221200）

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Smads與Hippo通道中YAP1基因在湖羊肌肉組織中時空表達研究及關聯(lián)分析

鮑建軍1,蘇銳1,王慶增1,呂曉陽1,高雯1,于嘉瑞1,王利宏1,陳玲2,吳文忠2,盛水興2,周洪3,孫偉1,戴國俊1

（1揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009；2蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州215200；3徐州市睢寧縣林牧漁業(yè)局，江蘇睢寧221200）

摘要：【目的】通過在mRNA表達水平檢測TGF-β/smad信號通路基因在湖羊肌肉組織中時空表達，來探究各基因的表達規(guī)律及內(nèi)在聯(lián)系。【方法】利用熒光定量PCR技術對湖羊Smads基因在出生后不同生長階段（2日齡，2月齡和6月齡）不同性別的兩種不同骨骼肌（腓腸肌、趾長伸?。┑南鄬Ρ磉_進行分析，以及對湖羊 Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）基因、YAP1基因的表達相關性分析?！窘Y果】湖羊肌肉TGF-β/smad信號通路中Smads基因時空表達規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)：Smads在不同肌肉組織的表達分析中，Smads在腓腸肌中的表達高于趾長伸肌，可能與這兩種骨骼肌分屬不同部位有關；Smads在不同月齡的表達分析中，Smad2、Smad3、Smad4在2日齡的表達量均高于其它月齡，而Smad7在2日齡的表達量低于6月齡，2月齡時表達量最低；在不同性別的表達分析中，Smads在 2日齡公羊中的表達量高于母羊，Smad2、Smad4、Smad7 在2月齡和6月齡則低于母羊；Smad3在不同生長階段中公羊表達量高于母羊。湖羊肌肉TGF-β/smad信號通路中Smads、YAP1基因表達相關性研究發(fā)現(xiàn)：在2日齡腓腸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）；在2月齡腓腸肌中，Smad2的表達與YAP1存在顯著正相關（P＜0.05），Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）；在6月齡腓腸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）；在腓腸肌的不同生長階段中，Smad3的表達YAP1存在極顯著負相關（P ＜0.01），Smad2、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。在2日齡趾長伸肌中，Smad3的表達與YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01），Smad2、Smad4、Smad7的表達與YAP1存在顯著正相關（P＜0.05）；在2月齡趾長伸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）；在6月齡趾長伸肌中， Smad7與YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4的表達與YAP1相關不顯著（P ＞0.05）；在趾長伸肌的不同生長階段中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1存在極顯著正相關（P ＜0.01）。【結論】由此推斷不同組織、生長階段以及性別等因素均可影響Smads在肌肉中的表達；在湖羊這兩種不同肌肉組織中，Hippo通道中YAP1基因可通過參與調(diào)控TGF-β/smad信號通路而參與肌肉的增殖和分化過程。

關鍵詞：湖羊；Smads；YAP1；Hippo通路；TGF-β通路

聯(lián)系方式：鮑建軍，E-mail：imaple14@163.com。蘇銳，E-mail：99114074@qq.com。鮑建軍和蘇銳為同等貢獻作者。通信作者孫偉，E-mail：dkxmsunwei@163.com

0 引言

【研究意義】湖羊是世界著名的綿羊品種之一，不僅具有高繁殖率等特點，而且肉質(zhì)細嫩、多汁。通過檢測影響湖羊骨骼肌生長發(fā)育相關基因的表達情況是分析湖羊肌肉生長分子機制的基礎，從而可以發(fā)現(xiàn)與肌肉質(zhì)量性狀相關的候選基因?！厩叭搜芯窟M展】YAP1（Yes-associated protein 1）也被稱為YAP65、YAP等，已被定位于人類染色體11q22［1］，廣泛表達于哺乳動物機體各組織中，參與細胞內(nèi)多條信號通路的傳導。研究發(fā)現(xiàn)，YAP1作為Hippo信號通路的中樞調(diào)控劑之一，在細胞增殖和凋亡動態(tài)平衡的維持、細胞接觸性抑制的調(diào)控、器官大小的控制，以及腫瘤的形成等過程中具有重要作用［2-7］。Smad基因家族分為3類：第一類是受體活化型Smad （R-Smad），包括Smad1-3， Smad5， Smad8；第二類是共同調(diào)節(jié)型Smad（Co-Smad），主要為Smad4；第三類是抑制型Smad（I-Smad），由Smad6、Smad7組成［8］。轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一個由33種結構相似多肽組成的超級家族，包括 TGF-β、活化素、抑制素和骨形成蛋白（BMPs）等［9-10］，其家族細胞因子可廣泛調(diào)節(jié)細胞活動，如細胞增殖分化、凋亡、運動、細胞外基質(zhì)重排以及血管生成等［11-13］，可通過胞內(nèi)信號分子Smads 蛋白轉導信號，具有抑制生長、促進細胞分化等多種功能［14］。FERRIGNO［15］在研究TGF-β通道與 YAP1過程中，運用酵母雙雜交技術對人類胎盤cDNA表達文庫進行篩選，發(fā)現(xiàn)用鼠全長 Smad7作探針時，YAP1基因可以被其識別。在COS-7細胞中YAP1與 Smad7的相互結合被證明使用了共同表達的標記蛋白，而移除PY基序［16］后，這種關聯(lián)依然存在，由此可以看出，YAP1與Smad7相互作用的結構域不僅僅只有PY基序。【本研究切入點】課題組前期利用芯片研究綿羊雙肌臀性狀的遺傳機理，篩選出美臀綿羊和正常表型羊肌肉組織差異表達基因YAP1［17］，目前關于Hippo通道中YAP1影響肌肉生長發(fā)育的研究較少，TGF-β通道在肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，而Smads家族基因是TGF-β通道中重要的成員，因此推斷YAP1可能通過與Smad蛋白家族結合，促進或抑制 TGF-β等通道的活性，進而對肌肉的生長發(fā)育發(fā)揮著重要的作用?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過分析湖羊YAP1基因以及與肌肉形成發(fā)育相關的Smad家族基因（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）在湖羊不同性別、不同月齡、不同肌肉組織的時空表達趨勢，以及 YAP1基因與此 4個基因表達的關聯(lián)性，探討YAP1是否通過Smad蛋白家族來影響湖羊的肌肉生長發(fā)育。

1 材料與方法

2015年2—11月在揚州大學動物科學與技術學院江蘇省重點實驗室——動物遺傳繁育與分子設計實驗室進行如下試驗。

1.1 試驗動物

試驗用羊于2015年2月購自蘇州市種羊場。湖羊選擇2日齡（初生）、2月齡（斷奶）、6月齡三個階段，每階段3公3母總共18只。選擇生長發(fā)育良好、日齡體重相近的羊進行屠宰，采集腓腸肌、趾長伸肌后于液氮罐保存。

1.2 主要試劑

PrimerScript RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）、Trizol、rTaq酶等試劑購自TaKaRa公司。

1.3 總RNA的提取

用Trizol法提取總RNA。

1.4 實時熒光定量PCR引物的設計與合成

綿羊Smads和18S rRNA基因實時熒光定量PCR引物信息見表1。

表1　綿羊Smads和18S rRNA基因q-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of Smads and 18S rRNA genes of sheep for RT-PCR

1.5 cDNA第一鏈的合成

參照PrimeSYBR? RT Reagent Kit Perfect Real Time試劑盒說明書對總RNA進行反轉錄，反應體系為 10 μL，包括：總 RNA 0.5 μL（100 ng·μL-1），PrimerScript Buffer 2 μL，Oligo dT 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RNase free H2O 補至10 μL。37℃反應15 min后，85℃變性5 s。

1.6 Q-PCR檢測

將合成的cDNA產(chǎn)物做10倍濃度梯度稀釋，使用ABI7500型熒光定量PCR儀進行定量分析。用18S（真核）作為內(nèi)參基因。按照 SYBR GreenI 試劑盒（TaKaRa公司）推薦的體系，在其他條件相同的情況下，對退火溫度（53—63℃）和引物濃度進行優(yōu)化，然后以優(yōu)化的退火溫度、引物濃度進行試驗。20 μL反應體系包括：上、下游引物各0.8 μL（10 mmol·L-1），ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，H2O 7 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，模板1 μL，混勻。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。每個樣品做3管平行試驗。根據(jù)電腦自動分析熒光信號將其轉換為Smad2、 Smad3、Smad4、Smad7、YAP1基因的起始拷貝數(shù)Ct值，根據(jù)各樣品的Ct值，計算其起始模板拷貝數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

湖羊同月齡同組織不同性別、同性別同月齡不同組織以及同組織同性別不同月齡間的比較，均采用單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性分析。數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt方法處理計算相對表達量，分析基因相對表達差異量。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；湖羊同月齡同組織不同性別比較中ΔΔCt=ΔCt（公）-ΔCt（母）；湖羊同性別同組織不同月齡比較中ΔΔCt=ΔCt（其他月齡）-ΔCt（2日齡）；同月齡同性別不同組織比較中 ΔΔCt=ΔCt（趾長伸?。?ΔCt（腓腸肌）；2-ΔΔCt表示實驗組目的基因的表達量相對于對照組的倍數(shù)。

2 結果

2.1 總RNA質(zhì)量分析

提取總RNA通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示清晰的28S和18S條帶，核酸蛋白分析儀檢測，A260/ A280≥1.8，提示RNA完整性和質(zhì)量較好（圖1）。

圖1　總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis figure of total RNA

2.2 Smads基因在綿羊肌肉中的時空表達分析

2.2.1 Smads基因在湖羊同月齡、同性別、不同肌肉組織中的時空表達分析 由圖2可以看出，Smads在湖羊趾長伸肌中的表達量低于腓腸肌。由圖2-Ⅰ可以看出，各月齡公、母羊中Smad2在肌肉組織中的表達量之間差異不顯著（P＞0.05）；由圖2-Ⅱ可以看出，2日齡、2月齡公母羊中Smad3的表達量無顯著差異（P＞0.05）。6月齡的母羊中，Smad3在腓腸肌和趾長伸肌中表達量存在顯著差異（P＜0.05）；由圖 2-Ⅲ可以看出，各月齡公、母羊中Smad4在肌肉組織中的表達量之間無顯著性差異（P＞0.05）；由圖2-Ⅳ可以看出，2月齡公母羊中Smad7的表達量無顯著性差異（P＞0.05）。2日齡的母羊和6月齡的公羊中，Smad7在腓腸肌和趾長伸肌中表達量存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.2.2 Smads基因在湖羊同組織、同性別、不同生長階段的時空表達分析 由圖3可以看出，隨著月齡的增加，Smad2的表達總體上呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。由圖 3-Ⅰ可以看出，Smad2表達量除在公羊腓腸肌中不同生長階段間的差異極顯著外（P＜0.01），在公、母羊其他肌肉組織中均無顯著差異（P＞0.05）；由圖3-Ⅱ可以看出，公、母羊肌肉組織Smad3的表達量在 2日齡與 2月齡間均存在顯著或極顯著差異（P＜0.05）；由圖3-Ⅲ可以看出，公、母羊肌肉組織中Smad4的表達量在2月齡與6月齡間差異均不顯著（P＞0.05）；由圖3-Ⅳ可以看出，Smad7在 6月齡的表達量高于其他生長階段。公、母羊肌肉組織中Smad7的表達量在2日齡和2月齡的差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 Smads基因在湖羊同組織、同月齡、不同性別的時空表達分析 由圖4-Ⅰ可以看出，各生長階段肌肉組織中 Smad2表達量在公、母羊間的差異不顯著（P＞0.05）；由圖4-Ⅱ可以看出，Smad3表達量除在2月齡趾長伸肌中存在顯著差異外（P＜0.05），在其他生長階段肌肉組織中的差異不顯著（P＞0.05）；由圖4-Ⅲ可以看出，6月齡腓腸肌中Smad4在公、母羊間存在極顯著差異（P＜0.01）；其他生長階段肌肉組織中，Smad4表達量在公、母羊間無顯著差異（P＞0.05）；由圖 4-Ⅳ可以看出，各生長階段肌肉組織中 Smad7的表達量在公、母羊間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 Smads與YAP1基因表達的關聯(lián)分析

由表2可以看出，在2日齡腓腸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad4、Smad7存在極顯著正相關（P ＜0.01）；Smad3的表達與Smad4、Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad4的表達與Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4 、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。

Ⅰ-Smad2；Ⅱ- Smad3；Ⅲ-Smad4；Ⅳ-Smad7。A、B、C、a、b、c系列的字母表示多重比較結果；相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。下同Ⅰ-Smad2； Ⅱ- Smad3； Ⅲ-Smad4； Ⅳ-Smad7. A， B， C， a， b， c show the results of multiple comparison. The same letters are no significant different （P＞0.05），the values with different letters are significant different （0.01＜P＜0.05）， the values with different capitals are extremely significant different （P＜0.01）. The same as below圖2　湖羊Smads基因在不同肌肉組織中表達的差異比較Fig. 2 The comparison of sheep Smads different expressions in different muscles

由表3可以看出，在2月齡腓腸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad7、YAP1存在顯著正相關（P＜0.05）；Smad3的表達與Smad7存在極顯著正相關（P ＜0.01）；Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。

由表4可以看出，在6月齡腓腸肌中，Smad2的表達與Smad3存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad3的表達與Smad4存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。

圖3　湖羊Smads基因在不同生長階段表達的差異比較Fig. 3 The comparison of sheep Smads different expressions at different growth stages

表2　Smads與YAP1基因在2日齡腓腸肌中表達的相關分析Table 2 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius muscle of 2-day-old

圖4　湖羊Smads基因在不同性別表達的差異比較Fig. 4 The comparison of sheep Smads different expression in different sex

表3　Smads與YAP1基因在2月齡腓腸肌中表達的相關分析Table 3 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius muscles of 2-month-old

表4　Smads與YAP1基因在6月齡腓腸肌中表達的相關分析Table 4 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius dorsi muscles of 6-month-old

由表5可以看出，在腓腸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad4、Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad3的表達與Smad4、Smad7存在極顯著正相關（P ＜0.01），與 YAP1存在極顯著負相關（P＜0.01）；Smad4與Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01），Smad2、 Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。

由表6可以看出，在2日齡趾長伸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad4、Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad3的表達與Smad4、Smad7、YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad4與Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad2、Smad4、Smad7的表達與YAP1存在顯著正相關（P＜0.05）。

表5　Smads與YAP1基因在腓腸肌中表達的相關分析Table 5 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius muscle

表6　Smads與YAP1基因在2日齡趾長伸肌中表達的相關分析Table 6 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus of 2-day-old

由表7可以看出，在2月齡趾長伸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad4 、Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad3的表達與Smad7存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。

由表8可以看出，在6月齡趾長伸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad4存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad3的表達與Smad4存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad7與YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4的表達與YAP1相關不顯著（P＞0.05）。

由表9可以看出，在趾長伸肌中，Smad2的表達與Smad3、Smad4 、Smad7、YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad3的表達與Smad4、Smad7、YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad4與 Smad7、YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）；Smad7與YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01）。

表7　Smads與YAP1基因在2月齡趾長伸肌中表達的相關分析Table 7 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus of 2-month-old

表8　Smads與YAP1基因在6月齡趾長伸肌中表達的相關分析Table 8 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus of 6-month-old

表9　Smads與YAP1基因在趾長伸肌中表達的相關分析Table 9 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus

3 討論

轉化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）通過胞內(nèi)信號分子Smads 蛋白轉導信號，調(diào)節(jié)著骨骼肌的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn) TGF-β/myostatin信號通路調(diào)節(jié)著羊、牛等所有哺乳動物體骨骼肌的生長發(fā)育、損傷再生以及運動生理等［18-19］。Hippo-YAP1信號通路中 YAP1作為轉錄共激活因子，可以與Smad7結合，參與SMADs蛋白的轉錄，從而對TGF-β參與的信號通路產(chǎn)生影響［20-22］。

TGF-β受體及受體底物 SMADs蛋白家族構成了 TGF-β/Smad通路。TGF-β與受體TGF-β-RⅡ結合后激活TGF-β-RⅠ受體，使Smad2、Smad3蛋白發(fā)生磷酸化；磷酸化Smad2和Smad3蛋白與Smad4形成異源復合物進入細胞核，通過與轉錄因子、共同抑制或激活因子相互作用調(diào)節(jié)靶基因的轉錄；Smad7是Ⅰ型受體的拮抗蛋白，可以與TGF-β-RⅠ牢固結合，阻止Smad2、Smad3磷酸化的發(fā)生，使TGF-β對目標基因的轉錄起到負反饋調(diào)節(jié)的作用［21，23］，該通路通過調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、黏附、遷移及凋亡而在生物整體及各種器官的發(fā)育過程中起重要的作用［24］。

本研究通過對Smads家族部分基因在湖羊不同骨骼肌組織中的表達趨勢及其與肌肉生長候選基因YAP1的表達關聯(lián)分析，探索YAP1在調(diào)節(jié)湖羊肌肉發(fā)育中所起的作用。

3.1 湖羊肌肉TGF-β/smad信號通路中Smads基因時空表達規(guī)律

Nakao等研究發(fā)現(xiàn)Smad2、Smad3、Smad4能夠有效參與TGF-β通道的信號轉導，同時還發(fā)現(xiàn)Smad7 在 TGF-β通路中起一定的拮抗作用［21，25］。徐業(yè)芬［26］研究發(fā)現(xiàn)Smad2、Smad4、Smad7除在湖羊母羊卵巢、子宮、輸卵管等生殖器官有表達外，在肌肉組織中也有表達，這與本文的研究結果一致。GOLDSTEIN［27］在以小鼠為對象研究TGF-β通路中Smad信號對肌肉萎縮的作用時，發(fā)現(xiàn)降低Smad4信號后，小鼠在12周齡時的體重和脛骨長度顯著增加（P＜0.05），股四頭肌肌纖維平均直徑更大（P＜0.001）。COHEN等［28］研究發(fā)現(xiàn)在 TGF-β通道缺乏 Smad7時上調(diào)Smad2、Smad3信號會抑制肌肉生長，并認為Smad7是引起肌肉紊亂的原因。本研究中 Smads在腓腸肌（Ⅱ型纖維為主）中的表達高于趾長伸?。á蛐屠w維為主），可能與這兩種肌肉分屬不同部位有關；Smad2、Smad3、Smad4均在2日齡的表達量高于其他月齡，而Smad7在2日齡的表達量低于6月。從這些研究結果中可以看出TGF-β信號通路中 Smads基因可在肌肉組織有效地進行表達。

3.2 湖羊肌肉TGF-β/smad信號通路中Smads、YAP1基因表達相關性

DROGURTT［23］研究發(fā)現(xiàn)雖然肌肉通常在 TGF-β通道的環(huán)境中形成，但是骨骼肌分化也受到TGF-β信號通路的強烈抑制，Smad2、Smad3、Smad4與抑制型Smad7在表達水平上沒有差異，相反 TGF-β-RⅠ和TGF-β-RⅡ在骨骼肌分化過程中增加了，同時指出下調(diào)Smad蛋白及其TGF-β受體信號對于骨骼肌分化是及其重要的。FERRIGNO［15］在研究中發(fā)現(xiàn)，YAP1增強了Smad7與其關聯(lián)性，促進Smad7對TGF-β-RⅠ的活化，Smad7對TGF-β信號轉導通道的抑制活性也可被YAP1所加強。而GUO［29］用免疫組化法研究胰腺導管腺癌發(fā)現(xiàn)YAP65與Smad7或Smad4變異之間不存在相關。SUN［30］研究發(fā)現(xiàn)YAP1基因的表達與磷酸化Smad3的表達呈負相關，可促進腫瘤干細胞的增殖分化；在敲除小鼠YAP1基因后，乳腺腫瘤干細胞生長頻率下降 200倍以上（P＜0.01），并得出結論YAP1基因通過抑制Smad3信號促進乳腺腫瘤干細胞的增殖分化。本研究發(fā)現(xiàn)在湖羊腓腸肌Hippo通道中YAP1可能通過調(diào)控TGF-β/smad通路中Smad3的表達進行負反饋調(diào)節(jié)；在趾長伸肌中，Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）的表達與YAP1存在極顯著正相關（P＜0.01），進一步說明在這兩種不同肌肉組織中，YAP1可通過參與調(diào)控TGF-β/smad通路中Smads的表達來參與肌肉的增殖和分化過程。

4 結論

不同組織、生長階段以及性別因素均可影響Smads在肌肉中的表達。在湖羊這兩種不同肌肉組織中，Hippo通道中YAP1基因可通過參與調(diào)控TGF-β/smad通路而參與肌肉的增殖和分化過程。

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（責任編輯 林鑒非）

The Temporal and Spatial Expression and Correlation Analysis of Smads and YAP1 Gene in the Hippo Pathway in Sheep Muscle Tissue

BAO Jian-jun1， SU Rui1， WANG Qing-zeng1， Lü Xiao-yang1， GAO Wen1， YU Jia-rui1， WANG Li-hong1，CHEN Ling2， WU Wen-zhong2， SHENG Shui-xing2， ZHOU Hong3， SUN Wei1， DAI Guo-jun1

（1Animal Science and Technology College， Yangzhou University， Yangzhou 225009， Jiangsu；2Animal Science and Veterinary Medicine Bureau of Suzhou， Suzhou 215200， Jiangsu；3Forestation， Herding， Fishing Bureau of Suining Country of Xuzhou， Suining 221200， Jiangsu）

Abstract：【Objective】 In order to explore the expression pattern and inner connection between the different genes， the mRNA expression level was used to detect the spatial and temporal expression of genes in TGF-β/Smad signaling pathway of sheep muscle tissue. 【Method】 In this study， q-PCR was used to detect relative expression of Smads genes and Yes-associated protein 1（YAP1） in 2 different skeletal muscles （i.e.， gastrocnemius muscle， extensor digitorum longus） and 3 different growth stages （i.e.， 2-day-old， 2 and 6-month-old） of Hu Sheep， and analyze the relative expression between Smads（Smad2， Smad3， Smad4 and Smad7） and YAP1. 【Result】The results of the spatial and temporal expression of Smads in TGF-β/Smad signaling pathway showed that the expression of Smads in extensor digitorum longus were lower than in gastrocnemius muscle， which may be related to two different parts of the skeletal muscle. The expression of Smad2， Smad3 and Smad4 genes in the 2-day-old were higher than other growth stages， and Smad7 gene expression in the 2-day-old was lower than 6-month-old， and the expression in 2-month-old was the lowest. The expressions of Smads gene of ram in the 2-day-old was higher than ewe， and the expressions of Smad2， Smad4，and Smad7 genes of ram in 2-month-old and 6-month-old were lower than the ewe in 2-day-old， the expression of Smad3 gene of ram in 3 growth stages were higher than ewe. The correlation expression of Smads gene and YAP1 gene in TGF-β/smad signaling of sheep muscle was found that there was no significant correlation in 2-day-old of gastrocnemius muscle between YAP1 and smads （P＞0.05） . The expression between YAP1 and Smad2 had a significant positive correlation （P＜0.05） and the correlation of the expression between YAP1 and other Smads was not significant in 2-month-old of gastrocnemius muscle （P＞0.05）. There was a significant negative correlation between YAP1 and Smad3 in different growth stages of gastrocnemius muscle（P＜0.01）. YAP1 expression exhibited a high positive correlation with Smad3 and the expression of YAP1 with the others was significantiy correlated in extensor digitorum longus of 2-month-old （P＜0.05）. There was no significant correlation between YAP1 and Smads in 2-month-old of extensor digitorum longus （P＞0.05）. The expression between YAP1 and Smad7 had a high significant positive correlation （P＜0.01） and the correlation of expression between YAP1 and other Smads was not significant in 6-month-old of extensor digitorum longus （P＞0.05）. There were highly significant negative correlations between YAP1 and Smads in different growth stages of extensor digitorum longus （P＜0.01）. 【Conclusion】 It was suggested that different tissues， growth stages and gender could affect the expression of Smads in muscle. YAP1 of Hippo pathway may participate in regulating the TGF-β/smad pathway and the process of muscle proliferation and differentiation in gastrocnemius muscle and extensor digitorum longus of Hu sheep.

Key words：Hu sheep； Smads； YAP1； Hippo pathway； TGF-β pathway

收稿日期：2015-12-03；接受日期：2016-03-18

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃（BE2012331）、江蘇省工程技術研究中心項目（BM2012308）、科技部家養(yǎng)動物平臺項目、江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目、國家星火計劃重點項目（2012GA690003）、江蘇省蘇北科技計劃（BN2014003，BN2015013，BN2015014）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目（CX（14）2073）、江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃（KYLX15_1375）