姚怡莎,谷　旭,商方方，邱　靜，李軍國(guó),李　俊

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

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大豆和膨化大豆主要抗?fàn)I養(yǎng)因子分析

姚怡莎1,谷旭1,商方方1，邱靜2，李軍國(guó)1,李俊1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

摘要：【目的】大豆含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，除了作為食品原料外也是重要的飼料原料，但大豆所含抗?fàn)I養(yǎng)因子限制了其在食品及飼料行業(yè)中的應(yīng)用。擠壓膨化工藝能夠在基本保持大豆?fàn)I養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上，降低其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，從而減小對(duì)人和動(dòng)物健康的負(fù)面作用。調(diào)查分析市售大豆和膨化大豆中主要幾種抗?fàn)I養(yǎng)因子的差異，分析擠壓膨化加工工藝對(duì)大豆中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除降解作用，并對(duì)這幾種主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量及活性給出置信范圍，為膨化企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中選擇優(yōu)質(zhì)原料及優(yōu)化加工工藝提供參考，并對(duì)動(dòng)物飼料的配方設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)?！痉椒ā坎杉袌?chǎng)上不同地區(qū)及廠家的大豆20批次和膨化大豆19批次，檢測(cè)其中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白（包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）、低聚糖（包括水蘇糖和棉籽糖）等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量和脲酶活性，并與在膨化加工企業(yè)采集的2批次大豆原料和在不同加工條件下制備的8批次膨化大豆中相應(yīng)抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量進(jìn)行比較分析。其中胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定；低聚糖采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，示差檢測(cè)器檢測(cè)。同時(shí)通過(guò)提取方式、活性炭用量、提取液濃度、料液比單因素試驗(yàn)，對(duì)蘇糖和棉籽糖兩種低聚糖的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。綜合分析檢測(cè)結(jié)果，研究擠壓膨化工藝對(duì)大豆主要抗?fàn)I養(yǎng)因子含量或活性的影響?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化后的提取方法如下：稱取一定質(zhì)量的樣品以料液比 1∶25加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇水溶液，微波輔助提取，離心濃縮，定容至25 mL，渦旋混勻，取2 mL離心檢測(cè)。膨化大豆中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白的含量及脲酶活性均顯著低于大豆原料，而大豆和膨化大豆中的低聚糖含量沒(méi)有顯著差異。膨化大豆中脲酶活性基本為 0，比大豆的脲酶活性低 99％以上，胰蛋白酶抑制因子含量比大豆約降低66％，大豆球蛋白的含量約降低67％，β-伴大豆球蛋白含量降低 90％以上，水蘇糖和棉籽糖的總含量基本保持不變。推斷市場(chǎng)上大豆原料中的胰蛋白酶抑制因子的含量范圍為32.5—89.6 mg·g-1，大豆球蛋白含量范圍為91.0—143.1 mg·g-1，β-伴大豆球蛋白的含量范圍為161.1—268.7 mg·g-1，棉籽糖含量范圍為 3.3—8.78 mg·g-1，水蘇糖的含量范圍在 21.4—34.16 mg·g-1，脲酶活性范圍為3.6—9.42 U·g-1；膨化大豆樣品中胰蛋白酶抑制因子含量范圍為10.7—31.1 mg·g-1，大豆球蛋白含量范圍為17.7—64.5 mg·g-1，β-伴大豆球蛋白含量范圍為9.3—57.5 mg·g-1，棉籽糖含量范圍為4.25—10.21 mg·g-1，水蘇糖的含量范圍為17.68—34.15 mg·g-1，脲酶活性范圍為0.00—0.02 U·g-1?！窘Y(jié)論】擠壓膨化過(guò)程能顯著降低大豆中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，從而減少這些因子帶來(lái)的不良反應(yīng)，并能提高大豆?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的利用率。

關(guān)鍵詞：大豆；膨化大豆；擠壓膨化；抗?fàn)I養(yǎng)因子；營(yíng)養(yǎng)成分

聯(lián)系方式：姚怡莎，E-mail：yaoyisha521@163.com。通信作者李俊，E-mail：Lijun08@caas.cn

0 引言

【研究意義】大豆是人類重要的食品來(lái)源，蛋白質(zhì)和脂肪的含量很高，分別為 36％—40％和 18％—22％，含有人體需要的多種必需氨基酸和必需脂肪酸，用做飼料也是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)成分和能量的重要來(lái)源［1］，但大豆中含有的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子（Antinutritional factors，ANFs）限制了大豆在飼料中的應(yīng)用。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子主要包括胰蛋白酶抑制因子（Trypsin inhibitor，TI）、抗原蛋白（Antigen protein）、低聚糖（Oligosaccharide，OS）、脲酶（Urease）、大豆凝集素（Soybean agglutinin）、植酸（Phytic acid）和單寧（Tannin）。胰蛋白酶抑制因子能夠抑制機(jī)體內(nèi)胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率和利用率降低，動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率降低，胰腺肥大和增生，消化吸收功能紊亂，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)腹瀉，甚至導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［2］。大豆中的抗原蛋白對(duì)動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物（如仔豬、犢牛等）的消化道具有很強(qiáng)的致敏作用，可引起犢牛等產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，使?fàn)倥Ｄc道結(jié)構(gòu)損傷，消化吸收障礙，繼發(fā)產(chǎn)生過(guò)敏性腹瀉等不良反應(yīng)。其中大豆球蛋白（Glycinin）和β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）的免疫原性最強(qiáng)，這兩種蛋白占大豆總蛋白的65％—80％，降低這兩種蛋白的含量對(duì)提高大豆蛋白質(zhì)利用率有很重要［3-4］。低聚糖被稱為“脹氣因子”，主要包括棉籽糖（Raffinose）和水蘇糖（Stachyose），不能被胃和腸上段的消化酶消化，而是被結(jié)腸中的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生氣體從而引起動(dòng)物脹氣、腹瀉等不良反應(yīng)，對(duì)不同種屬及不同年齡的動(dòng)物有差異［5］。大豆凝集素的熱敏性很高，在高溫下活性迅速降為零。植酸和單寧的含量很低，一般不作為主要抗?fàn)I養(yǎng)因子研究［6-7］。降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量或活性對(duì)于提高大豆?fàn)I養(yǎng)成分的利用率有很大作用，擠壓膨化技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外飼料主要的加工新技術(shù)之一，其加工過(guò)程產(chǎn)生的高溫高壓和高剪切力等作用，不但能使飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子失活，而且有利于提高營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用率，同時(shí)還能改善其風(fēng)味。近年來(lái)對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的研究日趨增多，膨化大豆產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、寵物食品、畜禽水產(chǎn)飼料中，研究大豆膨化過(guò)程中抗?fàn)I養(yǎng)成分的變化規(guī)律，對(duì)膨化大豆的實(shí)際應(yīng)用有重要意義［8］。【前人研究進(jìn)展】相關(guān)研究表明大豆膨化后主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的失活能提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分的利用率，并能減少動(dòng)物的不良反應(yīng)［9］。目前對(duì)大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子膨化前后變化研究較多的是熱敏性的脲酶和胰蛋白酶抑制因子。張翔等［10］研究報(bào)道大豆原料中的脲酶活性為5.36 U·g-1，膨化溫度達(dá)到120℃以上時(shí)，脲酶活性降至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的上限值0.3 U·g-1以下，合適的膨化壓力和水分含量也能使脲酶活性降低。李素芬等［11］研究發(fā)現(xiàn)膨化溫度在110—130℃條件下，膨化處理大豆中脲酶活性為0.38—0.06 U·g-1，胰蛋白酶抑制因子含量為14.85—5.59 mg·g-1，胰蛋白酶抑制因子失活率為68.7％—88.2％，且脲酶和胰蛋白酶抑制因子含量均隨溫度的升高而降低，且存在顯著的相關(guān)性，但對(duì)熱敏感程度存在差異。抗原蛋白和低聚糖屬于熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子，低聚糖的熱穩(wěn)定性比抗原蛋白更高，高溫下一般也不發(fā)生分解。目前生產(chǎn)企業(yè)對(duì)膨化大豆產(chǎn)品基本不檢測(cè)抗原蛋白的含量，對(duì)抗原蛋白的相關(guān)研究也較少。譙仕彥［12］、席鵬彬［13］、王紅云［14］等研究發(fā)現(xiàn)膨化加工能夠降低大豆中的抗原性物質(zhì)，以膨化全脂大豆作為斷奶仔豬日糧能夠顯著降低仔豬腹瀉率和腹瀉時(shí)間?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)部分膨化大豆生產(chǎn)企業(yè)的考察發(fā)現(xiàn)，目前各企業(yè)的膨化工藝、設(shè)備及參數(shù)并不完全相同，市場(chǎng)上的膨化大豆產(chǎn)品必然出現(xiàn)品質(zhì)不一的狀況，且企業(yè)一般只檢測(cè)脲酶活性，很少檢測(cè)胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白和低聚糖的含量，但僅通過(guò)脲酶活性的變化很難全面評(píng)價(jià)膨化大豆中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除狀況?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采集市售大豆和膨化大豆樣品，檢測(cè)分析其中的胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、低聚糖的含量和脲酶活性，并與在膨化大豆生產(chǎn)企業(yè)按一定工藝參數(shù)制備的不同批次的膨化大豆進(jìn)行對(duì)比，綜合評(píng)價(jià)膨化大豆的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除程度，分析造成大豆和膨化大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子含量差異的可能原因，并對(duì)主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量或活性給出參考值，為飼料配方中膨化大豆的添加提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年3—8月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所進(jìn)行。

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（LC-15C，配備RID-10A示差檢測(cè)器，日本島津公司），ZORBAX NH2色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000，上海亞榮生化儀器廠），高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-400KDE，昆山市超聲儀器有限公司），微波爐（G70F23NIP-M8，格蘭仕微波爐電器有限公司），雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（SPH-2012C，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），高速離心機(jī)（CR22G，日本日立公司），恒溫水浴箱（SB-9，日本EYELA公司）；pH計(jì)（Orion Star A211，美國(guó)Thermo公司）。

胰蛋白酶抑制因子試劑盒、大豆球蛋白試劑盒、β-伴大豆球蛋白試劑盒，購(gòu)自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司；水蘇糖和棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.5％），購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇為HPLC純，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；試驗(yàn)用水為Millipore純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制得的超純水；氫氧化鈉、尿素、鹽酸、乙醇為分析純。

1.2 樣品來(lái)源

市售樣品：大豆樣品來(lái)源于中國(guó)黑龍江省、安徽省、陜西省和美國(guó)、巴西等國(guó)家，共20個(gè)批次；膨化大豆樣品來(lái)源于黑龍江、上海、河南、廣西不同生產(chǎn)企業(yè)以進(jìn)口大豆或國(guó)產(chǎn)大豆為原料生產(chǎn)的膨化大豆產(chǎn)品，共19批次。

自制樣品：生產(chǎn)企業(yè)為河南省神農(nóng)膨化飼料有限公司；原料為進(jìn)口美國(guó)大豆，2批次；膨化大豆樣品為不同日期采集的不同批次的產(chǎn)品，其中喂料速度15—30 Hz，調(diào)質(zhì)壓力 0.35—0.50 MPa，膨化溫度100—120℃，共8批次。

1.3 樣品檢測(cè)方法

1.3.1 胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白的測(cè)定 樣品中的TI和抗原蛋白，采用ELISA法進(jìn)行定量檢測(cè)，該試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)法。由于試劑盒受室溫影響較大，每次試驗(yàn)均需回溫至室溫25℃，試驗(yàn)反應(yīng)過(guò)程在生化培養(yǎng)箱中恒溫（37℃）進(jìn)行。稱取一定量的樣品（TI為0.1 g，抗原蛋白為0.3 g，精確至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入30 mL提取液，于25℃振蕩提取16 h，靜置2 min，4 000 r/min離心5 min取上層液體，取上清液用1倍樣品稀釋工作液稀釋70倍。取出酶標(biāo)板條，將樣品盒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，經(jīng)過(guò)加樣、洗板、加酶標(biāo)試劑、顯色，加終止液后于 450/630 nm雙波下讀取OD值。按照公式：百分吸光率（％）=B/B0×100％，計(jì)算吸光率，其中B是標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的平均吸光度值，B0是標(biāo)準(zhǔn)品（空白對(duì)照）的平均吸光度值。

校準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的百分吸光率帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對(duì)應(yīng)的濃度，乘以稀釋系數(shù)，即為樣品中TI和抗原蛋白的實(shí)際濃度。

1.3.2 脲酶活性 參照《飼料用大豆制品中尿素酶活性的測(cè)定》（GB/T 8622—2006）?？紤]到全脂大豆脲酶活性較高，將稱樣量調(diào)整為0.05 g（精確至0.1 mg）；考慮到膨化大豆中脲酶活性較低，將稱樣量調(diào)整為0.50 g（精確至0.1 mg）。

1.3.3 低聚糖的測(cè)定1.3.3.1 HPLC 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX NH2色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：A為乙腈，B為超純水，A∶B= 70∶30（V/V）；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL·min-1；柱溫：35℃。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以去離子水為溶劑配制濃度為 0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·mL-1棉籽糖和水蘇糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下分析，以濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 樣品提取參照周泉城［15］、劉立洋［16］等的研究，并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行單因素優(yōu)化。

對(duì)低聚糖的浸提方式、活性炭用量、提取液（乙醇）濃度、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，每個(gè)處理做3個(gè)平行。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到提取液濃度，分析后確定最終的前處理方法。其中單因素試驗(yàn)優(yōu)化方案及提取液濃度見(jiàn)表1。

表1　低聚糖前處理?xiàng)l件優(yōu)化方案及結(jié)果Table 1 The optimizations and results of pretreatment of oligosaccharides

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果不同處理組進(jìn)行單因素方差分析，提取方式中微波輔助提取組的提取率顯著高于另外兩種；使用活性炭組，雖然 1.5％使用量的提取率最高，但與不使用活性炭組沒(méi)有顯著性差異。為簡(jiǎn)化操作過(guò)程，提高操作效率選擇不使用活性炭；體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液組的提取率顯著高于其他組；料液比各組的提取率差異不顯著，料液比為1∶25時(shí)提取率最高。最終確定的前處理方法如下：稱取2.0 g（精確至0.1 mg）粉碎后的豆粕樣品（由于豆粕是大豆脫脂后的產(chǎn)品，低聚糖相對(duì)含量提高），按照1∶25 g·mL-1的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇水溶液，置于微波爐中加熱至沸騰，取出冷卻至室溫，在轉(zhuǎn)速5 000 r/min下離心10 min，倒出上清液，重復(fù)以上步驟，合并兩次上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 5—10 mL，用去離子水定容至25 mL，渦旋混勻，取1 mL置于2 mL離心管中，轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心10 min。過(guò)0.22 μm濾膜，供上機(jī)使用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 主要抗?fàn)I養(yǎng)因子檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、低聚糖和脲酶這幾種主要抗?fàn)I養(yǎng)因子中，除脲酶活性的檢測(cè)不需要經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合檢測(cè)結(jié)果外，其他幾種抗?fàn)I養(yǎng)因子都需要擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，各因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 抗?fàn)I養(yǎng)因子檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 胰蛋白酶抑制因子 大豆和膨化大豆中TI的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。市場(chǎng)采集的大豆品種來(lái)源復(fù)雜，含量差異較大，中位數(shù)和平均值基本保持一致，表明TI在大豆中的含量呈均勻分布，選擇P5（5％的含量小于該值，下同）—P95（95％的含量小于該值，下同）為置信區(qū)間，制備樣品大豆原料的TI含量在此區(qū)間內(nèi)，且接近平均值，表明原料具有代表性。對(duì)比市場(chǎng)采集膨化大豆和制備的膨化大豆中TI的含量，并選擇上述相同的置信區(qū)間，制備的膨化大豆的含量區(qū)間在市場(chǎng)采集膨化大豆的含量區(qū)間內(nèi)，且兩者的中位數(shù)和平均值基本一致，表明制備樣品具有代表性。由于不同生產(chǎn)企業(yè)加工工藝、設(shè)備和加工參數(shù)的不同使TI的含量呈現(xiàn)差異。綜上分析，可認(rèn)為市場(chǎng)上大豆中TI的含量范圍在32.5—89.6 mg·g-1，膨化大豆中TI含量范圍在10.7—31.1 mg·g-1。

表2　抗?fàn)I養(yǎng)因子標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 The standard curves of antinutritional factors

表 3 大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量分析Table 3 Analysis of the content of antinutritional factors in soybean

表4　膨化大豆樣品中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量分析Table 4 Analysis of the content of antinutritional factors in extruded soybean

2.2.2 抗原蛋白 大豆和膨化大豆中抗原蛋白的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。對(duì)比市場(chǎng)大豆原料和制備樣品的原料中兩種抗原蛋白的含量，差異均較大，可能與大豆的來(lái)源及品種相關(guān)。市場(chǎng)大豆原料的兩種抗原蛋白含量中位數(shù)和平均值基本保持一致，表明抗原蛋白在不同大豆中的含量呈均勻分布，并選擇 P5—P95為置信區(qū)間，制備樣品大豆原料的抗原蛋白含量也在此區(qū)間內(nèi)，其中大豆球蛋白的含量接近市場(chǎng)大豆原料平均值，而β-伴大豆球蛋白含量高于市場(chǎng)大豆原料的平均值，但在置信區(qū)間內(nèi)，這可能與制備樣品大豆原料品種單一有關(guān)。對(duì)比市場(chǎng)采集膨化大豆和制備膨化大豆中抗原蛋白的含量，并選擇相同的置信區(qū)間，后者的含量區(qū)間在前者含量區(qū)間內(nèi)，其中大豆球蛋白的中位數(shù)和平均值基本一致，除了與大豆原料本身含量較高外，也與膨化加工過(guò)程中不同的加工工藝相關(guān)。綜上分析，可認(rèn)為市場(chǎng)上大豆中大豆球蛋白的含量范圍在91.0—143.1 mg·g-1，β-伴大豆球蛋白的含量范圍在161.1—268.7 mg·g-1，膨化大豆中大豆球蛋白含量范圍在 17.7—64.5 mg·g-1，β-伴大豆球蛋白量范圍在9.3—57.5 mg·g-1。

2.2.3 低聚糖 大豆和膨化大豆中低聚糖的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。市場(chǎng)采集大豆的兩種低聚糖含量范圍較寬，這可能與大豆的品種有關(guān)。與大豆相比，膨化大豆中低聚糖含量未見(jiàn)降低，可見(jiàn)膨化大豆的低聚糖含量差異是由于大豆原料本身的差異引起的。大豆和膨化大豆低聚糖含量的平均值與中位數(shù)基本保持一致，說(shuō)明大豆中的低聚糖含量呈均勻分布。制備樣品原料和膨化大豆中低聚糖的含量均在市場(chǎng)采集大豆和樣品的含量區(qū)間內(nèi)，取P5至P95為置信區(qū)間，可認(rèn)為市場(chǎng)上大豆中的棉籽糖含量范圍在3.3—8.78 mg·g-1，水蘇糖的含量范圍在21.4—34.16 mg·g-1，膨化大豆中的棉籽糖含量范圍在4.25—10.21 mg·g-1，水蘇糖的含量范圍在17.68—34.15 mg·g-1。

2.2.4 脲酶活性 大豆和膨化大豆中脲酶活性的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。對(duì)比市場(chǎng)采集大豆和制備樣品大豆原料，市場(chǎng)采集大豆的脲酶活性范圍較大，制備樣品大豆原料在市場(chǎng)大豆的脲酶活性范圍內(nèi)，可能與大豆的品種有關(guān)。膨化大豆中脲酶活性基本降為 0，取P5—P95為置信區(qū)間，可認(rèn)為市場(chǎng)上大豆中的脲酶活性在3.6—9.32 U·g-1，膨化大豆的脲酶活性在0—0.02 U·g-1。

3 討論

3.1 抗?fàn)I養(yǎng)因子結(jié)果分析

由檢測(cè)結(jié)果可知，膨化大豆中TI的含量比大豆中TI的含量明顯降低，平均失活率約為66％，說(shuō)明擠壓膨化加工過(guò)程中的高溫、高壓及高剪切力能夠有效降低大豆中胰蛋白酶抑制因子的含量。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)二硫鍵在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面有很大作用。大豆中胰蛋白酶抑制因子主要包括兩種：Kunitz型胰蛋白酶抑制因子（KTI）和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制因子（BBTI），它們?cè)诖蠖怪械暮糠謩e為1.6％和0.4％。其中，KTI分子結(jié)構(gòu)是中含有兩個(gè)二硫鍵和一個(gè)活性中心，1∶1作用于胰蛋白酶；BBTI分子中含有較多的半胱氨酸，共形成七個(gè)二硫鍵，有兩個(gè)活性中心，可與胰蛋白酶和糜蛋白酶作用［17］。二硫鍵的數(shù)目差異是這兩種胰蛋白酶抑制因子的穩(wěn)定性差異的主要因素，BBTI分子對(duì)熱、酸、堿的穩(wěn)定性比KTI強(qiáng)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)BBTI在105℃干燥狀態(tài)下或其0.02％水溶液在100℃下加熱10 min仍能保持活性，而KTI在90℃短時(shí)加熱即發(fā)生不可逆失活［18］。通過(guò)本研究的市場(chǎng)樣品及自制樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，TI平均失活率約為66％，與Kunitz型胰蛋白酶抑制因子占總TI的比率（約80％）接近，推斷失活的胰蛋白酶抑制因子主要為熱不穩(wěn)定性的 Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。

與大豆原料相比，膨化大豆中大豆球蛋白的含量比大豆平均低67％，β-伴大豆球蛋白的含量比大豆中的含量平均低 90％以上，自制樣品中兩者含量分別降低約65％和90％，基本與市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果一致。膨化大豆中兩種抗原蛋白的含量最低可降到10 mg·g-1以下，說(shuō)明膨化加工技術(shù)能夠有效地使抗原蛋白含量大幅度降低，且β-伴大豆球蛋白的對(duì)于膨化加工過(guò)程穩(wěn)定性比大豆球蛋白的穩(wěn)定性低，更易受加工溫度及其他條件影響而失活，這與兩者分子結(jié)構(gòu)相關(guān)。大豆球蛋白中有6個(gè)堿性亞基和6個(gè)酸性亞基之間通過(guò)二硫鍵連接，酸性亞基和堿性亞基交互作用形成比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中有25％的α-螺旋、25％的β-折疊、42％ 的 β-轉(zhuǎn)角和 8％的無(wú)規(guī)則卷曲；β-伴大豆球蛋白的 3個(gè)亞基為 α、α、β，穩(wěn)定性依次增大，分子結(jié)構(gòu)中很少有二硫鍵，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、不規(guī)則卷曲分別占5％、35％、60％。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的差別使大豆球蛋白在高溫和各種作用力下的穩(wěn)定性比β-伴大豆球蛋白的穩(wěn)定性高［19］。本檢測(cè)結(jié)果大豆球蛋白的失活率比β-伴大豆球蛋白的失活率低23％以上，根據(jù)兩者之間結(jié)構(gòu)的差異，推測(cè)主要與大豆球蛋白中二硫鍵的存在和二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的數(shù)量較多有關(guān)。

與TI、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白不同，大豆膨化后棉籽糖和水蘇糖的含量沒(méi)有降低，反而小幅度升高，計(jì)算分析兩種糖的總量，棉籽糖和水蘇糖總量在大豆中平均為 35.22 mg·g-1，膨化大豆平均含量為36.91 mg·g-1，總量基本接近，可能原因是膨化過(guò)程中大豆水分的損失使低聚糖占膨化大豆干物質(zhì)相對(duì)比例略增高。棉籽糖和水蘇糖的結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，單糖之間通過(guò)糖苷鍵結(jié)合，在 100℃高溫下也不易分解，對(duì)熱很穩(wěn)定，僅在酸性條件下穩(wěn)定性稍降低，擠壓膨化過(guò)程中的高溫高壓以及剪切力的作用不足以破壞棉籽糖和水蘇糖的結(jié)構(gòu)，故含量基本不變。

膨化大豆的脲酶活性都低于0.02 U·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.3 U·g-1，由此可見(jiàn)擠壓膨化加工過(guò)程能夠使大豆中脲酶接近 100％失活，原因是由于酶類對(duì)熱敏感，擠壓膨化加工的膨化溫度一般在 100℃以上，脲酶隨溫度上升迅速發(fā)生不可逆失活，這與相關(guān)研究的結(jié)果一致［10， 20］。

3.2 膨化加工過(guò)程中抗?fàn)I養(yǎng)因子鈍化情況

膨化加工過(guò)程是高溫、高壓、高剪切力及物料與螺桿和膨化腔之間的摩擦對(duì)物料本身產(chǎn)生作用，擠壓溫度起決定性因素，溫度的高低決定了產(chǎn)品的質(zhì)量［21］。自制樣品的加工參數(shù)是在一定范圍內(nèi)浮動(dòng)，是由于不同客戶對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求的不同產(chǎn)生的，即使原料相同也必然造成熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量或活性在一定范圍內(nèi)浮動(dòng)。而不同生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)備條件和工藝參數(shù)以及客戶要求均不盡相同，使市售樣品各抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量呈現(xiàn)差異。同時(shí)，由于分子結(jié)構(gòu)不同，各抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)擠壓膨化過(guò)程中的高溫高壓作用的穩(wěn)定性也存在差異。本研究表明，膨化后低聚糖含量不會(huì)降低，TI平均失活率為66％，大豆球蛋白平均失活率為67％，β-伴大豆球蛋白平均失活率達(dá)到90％以上，脲酶失活率接近 100％，膨化過(guò)程中穩(wěn)定性從高到低依次為：低聚糖＞胰蛋白酶抑制因子＞大豆球蛋白＞β-伴大豆球蛋白＞脲酶。

3.3 擠壓膨化對(duì)提升大豆利用價(jià)值的作用

大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子中胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白及脲酶是大豆在應(yīng)用中導(dǎo)致幼齡動(dòng)物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、腸道健康及消化吸收率的主要影響因素。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，大豆膨化后這幾種抗?fàn)I養(yǎng)因子的大幅度失活，能夠使大豆?fàn)I養(yǎng)成分利用率提高，并降低這些抗?fàn)I養(yǎng)因子帶來(lái)的危害［22-24］。另外，擠壓膨化過(guò)程使大豆蛋白質(zhì)變性，游離氨基酸含量上升，蛋白質(zhì)的消化率提高，溶解度下降，油細(xì)胞破裂使膨化大豆的香味和適口性增加，能夠提高動(dòng)物食欲。雖然低聚糖的含量沒(méi)有降低，由于低聚糖含量較少，且對(duì)不同動(dòng)物的作用有差異，只要添加比例合理就能使不良影響降到最低。綜上所述，擠壓膨化加工能使大豆的利用價(jià)值顯著提高。

3.4 脲酶活性對(duì)評(píng)價(jià)膨化大豆品質(zhì)的合理性

由于脲酶活性有快速檢測(cè)方法，即半固體法［25］，生產(chǎn)企業(yè)常用脲酶活性來(lái)評(píng)價(jià)大豆加工程度是否合適。前人研究認(rèn)為，脲酶活性失活的程度和胰蛋白酶抑制因子及蛋白質(zhì)溶解度的變化有一定的線性關(guān)系，以上結(jié)果大部分是基于試驗(yàn)型設(shè)備得到的，而實(shí)際生產(chǎn)中脲酶活性基本降為0時(shí)，胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白依然有較強(qiáng)的活性，因此，僅依靠脲酶的失活來(lái)間接評(píng)價(jià)其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的失活程度是不合理的。

4 結(jié)論

擠壓膨化技術(shù)能顯著降低引起動(dòng)物不良反應(yīng)的大豆胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白的含量，并使脲酶基本失活。由于大豆原料差異，膨化加工工藝、設(shè)備和參數(shù)的不同，使膨化大豆產(chǎn)品中的各主要抗?fàn)I養(yǎng)因子降低的程度也不同。脲酶并不能替代其他抗?fàn)I養(yǎng)因子作為評(píng)價(jià)大豆品質(zhì)的主要指標(biāo)，建議評(píng)價(jià)大豆品質(zhì)時(shí)要檢測(cè)脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白4個(gè)指標(biāo)。推斷市場(chǎng)上大豆原料中的胰蛋白酶抑制因子的含量范圍為 32.5—89.6 mg·g-1，大豆球蛋白含量范圍為91.0—143.1 mg·g-1，β-伴大豆球蛋白的含量范圍為 161.1—268.7 mg·g-1，脲酶活性范圍為3.60—9.42 U·g-1；膨化大豆樣品中胰蛋白酶抑制因子含量范圍為 10.7—31.1 mg·g-1，大豆球蛋白含量范圍為17.7—64.5 mg·g-1，β-伴大豆球蛋白含量范圍為9.3—57.5 mg·g-1，脲酶活性范圍為0.00—0.02 U·g-1，研究結(jié)果對(duì)生產(chǎn)企業(yè)有一定的參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Investigation and Analysis of Main Antinutritional Factors in Soybean and Extruded Soybean

YAO Yi-sha1， GU Xu1， SHANG Fang-fang1， QIU Jing2， LI Jun-guo1， LI Jun1
（1Feed Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081；2Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）

Abstract：【Objective】Soybean is an important food material as well as feed material for its abundant nutriments， but someantinutritional factors （ANFs） in soybean limit its application in the food and feed industries. As a widely used processing technique， the extrusion process can reduce the side-effect of ANFs in soybean to human and animals causing the content of ANFs to decrease while the content of nutrilite remains about the same. This research is aimed at investigating and analyzing the difference of main antinutritional factors in soybean and extruded soybean and discussing the effect of the extrusion process to these ANFs in soybean， so as to provide a reference for expanded enterprises to choose high quality raw materials and optimize the processing technique in the actual production， and provide some guidance to the design of animal feed formula. 【Method】In this research， 20 batches of soybean and 19 batches of extruded soybean from different areas of the manufacturer were collected，and the content or activity of the main anti-nutritional factors， including trypsin inhibitor， antigenic protein （glycinin and β-conglycinin）， oligosaccharide （raffinose and stachyose） and urease， were detected. And these results were compared with 2 batches of soybean and 8 batches of extruded soybean that were produced in one manufacturer. The concentrations of trypsin inhibitor and antigenic protein were analyzed using ELISA. The concentrations of oligosaccharide were determined by HPLC with a differential detector. At the same time the extraction methods of oligosaccharides were optimized. Single factor optimize experiments were the way of extraction， the dosage of activated carbon， volume percentage of ethanol， and solid-liquid ratio. The solution was detected by HPLC after through filter membrane. Through comprehensive analysis of the data， the effect of extrusion technology on the content or activity of main antinutritional factors in soybean was studied.【Result】 The extraction method is as follows： adding 70％ ethanol solution to the samples （solid-liquid ratio： 1∶25）， and then centrifuging and concentrating the extracting solution after using microwave assisted extraction， diluting the concentrated solution with water to 25 mL， centrifuging the solution （2 mL） after blending. In comparison the content of the main antinutritional factors in soybean （22 batches） with the content in extruded soybean （27 batches）， the content of trypsin inhibitor and antigenic protein and urease activity in soybean is significantly lower than those in extruded soybean while the content of oligosaccharides has no significant difference between them. The urease activity of most of extruded soybeans is near zero and lower by 99％ than the activity of soybeans. The content of trypsin inhibitor， glycinin and β-conglycinin decreased respectively in 66％， 67％ and 90％， while the content of raffinose and stachyose remained largely unchanged. From this research the content or activity of trypsin inhibitor， glycinin， β-conglycinin， raffinose， stachyose and urease in the soybean is respectively 32.5-89.6 mg·g-1， 91.0-143.1 mg·g-1， 161.1-268.7 mg·g-1， 3.3-8.78 mg·g-1， 21.4-34.16 mg·g-1and 3.6-9.42 U·g-1， in the extruded soybean is respectively 10.7-31.1 mg·g-1， 17.7-64.5 mg·g-1， 9.3-57.5 mg·g-1， 4.25-10.21 mg·g-1， 17.68-34.15 mg·g-1and 0.00-0.02 U·g-1. 【Conclusion】 The extrusion process can significantly reduce the content of the main antinutritional factors in soybean and side effects caused by these factors and can improve the utilization rate of nutrition. This study presents the reference range of the main ANFs in content or activity in soybean and extruded soybean.

Key words：soybean； extruded soybean； extrusion； antinutritional factors； nutrient composition

收稿日期：2015-10-30；接受日期：2016-02-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203015）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CZ1108）