楊金光　陳江　李宏宇　郭曉鐘

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·論著·

胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞融合誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞能力的體外研究

楊金光陳江李宏宇郭曉鐘

067000河北承德，承德市第三醫(yī)院藥劑科(楊金光)；中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化科(楊金光、陳江、李宏宇、郭曉鐘)

【摘要】目的建立胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞(DC)融合的細(xì)胞，觀察其體外誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力。方法自胰腺癌患者外周血單核細(xì)胞中分離和培養(yǎng)DC，利用50% PEG-10% DMSO融合劑將MiaPaCa-2細(xì)胞融合到DC，以不加融合劑僅將DC與MiaPaCa-2共培養(yǎng)組及單純DC組作為對(duì)照。采用FITC-CD86及PE-MUC1進(jìn)行雙標(biāo)記，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞融合率；MTT法檢測(cè)各組DC存活率。按照DC與T淋巴細(xì)胞1∶10、1∶20、1∶40、1∶80的比例混合培養(yǎng)細(xì)胞，評(píng)價(jià)各組DC體外刺激自體T淋巴細(xì)胞的增殖能力；ELISA法檢測(cè)各組DC體外激發(fā)的CTL的IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ分泌量。結(jié)果DC與MiaPaCa-2融合細(xì)胞組的融合率為(42.30±7.30)%，明顯高于共培養(yǎng)組的(7.21±1.06)%。DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC的存活率分別為95.0%以上、85.0%、62.8%，融合細(xì)胞組DC存活率顯著低于DC組及共培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。DC∶T淋巴細(xì)胞為1∶10時(shí)，DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC刺激自體T細(xì)胞增殖指數(shù)分別為219±42、3 584±317、8 201±424，1∶20時(shí)分別為110±14、2 179±104、6 152±104，融合細(xì)胞組顯著高于DC組及共培養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；為1∶40、1∶80 時(shí)3組細(xì)胞的T細(xì)胞增殖指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。DC∶T淋巴細(xì)胞為1∶10時(shí)，DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC激發(fā)的CTL的IL-2分泌量分別為(27.30±5.21)、(897.44±93.05)、(2243.80±381.46)ng/L；IL-10分泌量分別為(19.55±2.05)、(424.60±108.25)、(706.53±161.29)ng/L；Granzyme B分泌量為(16.23±1.23)、(451.07±120.50)、(1327.77±205.15)ng/L；IFN-γ分泌量為(30.11±4.32)、(982.00±124.68)、(2421.04±488.50)ng/L。融合細(xì)胞組激發(fā)的CTL的細(xì)胞因子分泌量顯著高于DC組及共培養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論DC與MiaPaCa-2融合的細(xì)胞具備體外誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤抗原特異性CTL的能力。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；樹(shù)突細(xì)胞；細(xì)胞融合；T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81071982)

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，手術(shù)治療及放、化療作用有限，患者預(yù)后極差，臨床迫切需要探索新的有效治療手段[1-2]。樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell, DC)腫瘤疫苗可主動(dòng)免疫抗腫瘤，已成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一[3]。本研究將人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞與DC相融合，觀察其體外誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的能力，為今后DC-胰腺癌腫瘤細(xì)胞融合疫苗的構(gòu)建開(kāi)發(fā)奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料及試劑

篩選2013年4月至2015年3月期間沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，其中男性3例，女性3例，年齡39～70歲，平均55歲。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查(剖腹探查活檢5例，細(xì)針穿刺活檢1例)證實(shí)為胰腺癌。入選前未經(jīng)放、化療及免疫治療。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為201200165。

RPMI 1640、小牛血清購(gòu)自Hyclone公司，rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α購(gòu)自PeproTec公司，鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86單抗購(gòu)自Santa-Cruz公司，兔抗人MUC1多抗購(gòu)自DPC-Biermann公司，Trizol、 MTT、50% PEG-10% DMSO、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Sigma公司，3H標(biāo)記甲基胸腺嘧啶由中科院原子能所提供，IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司。

二、DC分離、培養(yǎng)和鑒定

參照文獻(xiàn)[4]方法，通過(guò)Ficoll密度梯度離心法分離來(lái)自胰腺癌患者100 ml外周血中的單核細(xì)胞，培養(yǎng)1 h后，取出未貼壁的細(xì)胞另行培養(yǎng)備用，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h，更換新鮮培養(yǎng)液后加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，加入TNF-α (10 ng/ml)培養(yǎng)至7 d，收集成熟DC。使用倒置顯微鏡和電鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5～10 d DC的形態(tài)學(xué)變化。用流式細(xì)胞儀分析DC的特征性標(biāo)志CD40、CD83、CD86以及MHC類分子HLA-DR等的表達(dá)水平。

三、胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞系與DC融合

因人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室保存)連續(xù)傳代培養(yǎng)20代后仍穩(wěn)定表達(dá)MUC1蛋白[5]，故選擇MiaPaCa-2細(xì)胞進(jìn)行融合。MiaPaCa-2細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用25 μg/ml絲裂霉素處理30 min去增殖后，與培養(yǎng)5 d的DC以3∶1混合，離心盡量吸盡上清，置37℃水浴，滴加預(yù)熱的50% PEG-10% DM融合劑0.8 ml，作用2 min后加入1 ml血清終止反應(yīng)。設(shè)不加融合劑的MiaPaCa-2與DC共培養(yǎng)組及單純DC組作為對(duì)照。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，采用FITC-CD86及PE-MUC1進(jìn)行雙標(biāo)記，按說(shuō)明書(shū)操作。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞融合率，融合率(%)=(融合組雙標(biāo)率-共培養(yǎng)組雙標(biāo)率)×100%。同時(shí)使用MTT法檢測(cè)各組DC的存活率。

四、MiaPaCa-2與DC融合細(xì)胞體外刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖

分別收集DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組的DC，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml作為刺激細(xì)胞，取上述患者自體外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)1 h的懸浮T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml作為反應(yīng)細(xì)胞，按照刺激與效應(yīng)細(xì)胞1∶10、1∶20、1∶40、1∶80比例加入到96孔板中，終體積200 μl，以RPMI-1640培養(yǎng)液替代效應(yīng)細(xì)胞作為對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，在收獲細(xì)胞前18 h加入3H-TdR，每孔1μCi。使用液閃爍儀檢測(cè)各孔每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。

五、MiaPaCa-2與DC融合細(xì)胞體外激發(fā)抗原特異性CTL釋放細(xì)胞因子

分別以3組中的DC為刺激細(xì)胞，以患者自體T淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，兩種細(xì)胞按1∶10比例混合反應(yīng)14 d，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-γ含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞培養(yǎng)上清用試劑盒中樣本稀釋液稀釋50倍，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔，取平均值。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

經(jīng)體外分離、培養(yǎng)，DC數(shù)量達(dá)初始數(shù)量的10～15倍。鏡下見(jiàn)胞體向四周伸出大量樹(shù)枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起，部分突起末端呈球狀膨大(圖1)。未成熟DC的表面標(biāo)志物CD40、HLA-DR、CD83、CD86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為總細(xì)胞數(shù)的9.12%、11.05%、29.84%、11.50%；成熟DC分別為35.20%、49.07%、74.02%、86.73%，成熟DC表面標(biāo)志物的表達(dá)均顯著高于未成熟DC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.50、2.94、2.09、4.51，P值均<0.05)。

圖1　胰腺癌患者外周血培養(yǎng)5 d(1A)及7 d(1B)的DC形態(tài)改變(1A.吉姆薩染色　×200；1B.透射電鏡　4 μm)

二、DC與MiaPaCa-2融合細(xì)胞的鑒定及融合率

經(jīng)50%PEG-10% DMSO融合劑誘導(dǎo)融合后，部分DC與MiaPaCa-2細(xì)胞先發(fā)生細(xì)胞膜融合，形成雙核的巨大細(xì)胞，而后細(xì)胞核逐漸發(fā)生融合，形成DC與MiaPaCa-2的融合細(xì)胞(DC-MiaPaCa-2)。

MiaPaCa-2為MUC1陽(yáng)性細(xì)胞，不表達(dá)CD86抗原；而DC為CD86陽(yáng)性細(xì)胞，不表達(dá)或低表達(dá)MUC1抗原。經(jīng)FITC-CD86及PE-MUC1雙標(biāo)記，融合細(xì)胞組CD86及MUC1雙陽(yáng)性的DC為(42.30±7.30)%，共培養(yǎng)組為(7.21±1.06)%，DC-MiaPaCa-2融合率為(35.09±6.24)%(圖2)。

三、DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組的DC存活率

DC組中DC的存活率在95.0%以上；共培養(yǎng)組中DC存活率穩(wěn)定在85.0%左右；融合細(xì)胞組中DC存活率呈時(shí)間依賴性顯著下降，最低至62.8%(圖3)。融合細(xì)胞組DC存活率顯著低于共培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.78，P<0.05)。

四、DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC體外刺激自體T淋巴細(xì)胞的增殖

DC∶T淋巴細(xì)胞為1∶10時(shí)，DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC刺激自體T細(xì)胞增殖指數(shù)分別為219±42、3 584±317、8 201±424；為1∶20時(shí)，3組的T細(xì)胞增殖指數(shù)分別為110±14、2 179±104、6 152±104。融合細(xì)胞組的T細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于共培養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為12.55、10.39，P值均<0.05)。而DC∶T淋巴細(xì)胞為1∶40、1∶80 時(shí)，3組細(xì)胞的T細(xì)胞增殖指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

五、DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC體外激發(fā)抗原特異性CTL的細(xì)胞因子分泌量

DC∶T淋巴細(xì)胞為1∶10時(shí)，DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC激發(fā)的CTL的IL-2分泌量分別為(27.30±5.21)、(897.44±93.05)、(2243.80±381.46)ng/L；IL-10分泌量分別為(19.55±2.05)、(424.60±108.25)、(706.53±161.29)ng/L；Granzyme B分泌量為(16.23±1.23)、(451.07±120.50)、(1327.77±205.15)ng/L；IFN-γ分泌量為(30.11±4.32)、(982.00±124.68)、(2421.04±488.50)ng/L。融合細(xì)胞組DC激發(fā)的CTL的細(xì)胞因子分泌量顯著高于共培養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為15.20、8.78、10.67、20.31，P值均<0.05)。

圖2　MiaPaCa-2細(xì)胞(2A)、DC(2B)、DC-MiaPaCa-2(2C)的CD86、MUC1表達(dá)

圖3　DC組、共培養(yǎng)組、融合細(xì)胞組DC存活率

討論

DC腫瘤疫苗的實(shí)質(zhì)是以特異性T細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫，有關(guān)胰腺癌DC疫苗構(gòu)建在于選取適合的腫瘤相關(guān)抗原和采用適當(dāng)?shù)目乖?fù)載方法。

盡管已有大量研究報(bào)道惡性細(xì)胞高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，但其中少有易受T細(xì)胞影響的靶點(diǎn)[6]。MUC1是一種高糖基化I型糖蛋白，其蛋白分子較易被免疫細(xì)胞所呈遞和識(shí)別[7]。同時(shí)，MUC1的表達(dá)具有高度的腫瘤特異性，在胰腺癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)90%以上，是胰腺癌免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[8]。

DC-腫瘤細(xì)胞融合疫苗與其他形式的腫瘤抗原負(fù)載DC相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：(1)DC-腫瘤融合細(xì)胞能表達(dá)整個(gè)腫瘤細(xì)胞抗原決定簇，因而能誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆的CTL反應(yīng)；(2)DC-腫瘤融合細(xì)胞既表達(dá)腫瘤抗原，又表達(dá)包括MHC、共刺激信號(hào)分子在內(nèi)的DC表面抗原，使細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答大大增強(qiáng)[9]；(3)DC-腫瘤融合疫苗能夠?qū)⒁阎臀粗哪[瘤相關(guān)抗原加工后呈遞給T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮最佳的抗腫瘤免疫作用；(4)DC-腫瘤細(xì)胞融合后其抗原呈遞作用持久[10]，可誘導(dǎo)出更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本研究采用胰腺癌患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC作為載體，利用50%PEG-10% DMSO 誘導(dǎo)DC融合技術(shù)[3]將MiaPaCa-2細(xì)胞融合到DC，融合效率達(dá)到40%以上，遠(yuǎn)高于單純DC組、MiaPaCa-2細(xì)胞與DC共培養(yǎng)組，顯示此方法是有效的。但DC與胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞融合后細(xì)胞存活率較DC組、共培養(yǎng)組顯著下降，這與融合劑對(duì)DC的毒性蓄積和細(xì)胞膜的破壞作用有關(guān)。

DC與MiaPaCa-2細(xì)胞融合后對(duì)自體T細(xì)胞的增殖刺激能力顯著高于DC組、共培養(yǎng)組，體外激發(fā)抗原特異性CTL的IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-γ等細(xì)胞因子分泌量也較DC組、共培養(yǎng)組顯著增加，提示隨著負(fù)載抗原效率的增加，DC可增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的殺傷效應(yīng)，與Van Tendeloo等[11]的研究結(jié)果類似，為今后胰腺癌腫瘤細(xì)胞與DC融合疫苗的構(gòu)建開(kāi)發(fā)奠定了部分前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯：屠振興)

In vitro study on the induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes by fusion of dendritic cells with pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells

YangJinguang,ChenJiang,LiHongyu,GuoXiaozhong.

DepartmentofPharmacy,ThirdHospitalofChengdeCity,Chengde067000,China

【Abstract】Objective To investigate the ability of inducing antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) stimulated by dendritic cell (DC) fused with MiaPaCa-2 cells in vitro. MethodsDC were isolated and cultured from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). 50% PEG and 10% DMSO were used to fuse MiaPaCa-2 cells and DC, and DC co-cultured with MiaPaCa-2 cells and DC alone served as control. The fusion efficiency was assessed by flow cytometry (FCM) and DC-MiaPaCa-2 hybrids were identified as PE-MUC1/FITC-CD86double positive cells. The survival rate of DC was determined by MTT method. The lymphocyte proliferation stimulated by DC in vitro was evaluated by mixed cell culture with DC in different ratios of 1∶10, 1∶20 and 1∶80. IL-2, IL-10, granzyme B and IFN-γ released by antigen-specific CTLs were measured by ELISA assay. ResultsThe fusion rate in DC fused with MiaPaCa-2 cells (fused cells) was (42.30±7.30)%, which was higher than (7.21±1.06)% in DC co-cultured with MiaPaCa-2 cells(co-cultured cells). The cell viability of DC, co-cultured cells and fused cells was >95.0%, 85.0% and 62.8%, and fused cells had greatly lower cell viability than DC and co-cultured cells (P<0.05). When DC and T cells were co-cultured at the ratio of 1∶10, T cell proliferation index in DC, co-cultured and fused cells was 219±42, 3 584±317, 8 201±424, respectively. At the ratio of 1∶20, T cell proliferation index was 110±14, 2 179±104, 6 152±104. T cell proliferation index was higher in fused cells than that in DC and co-cultured cells (both P<0.05) at the ratio of 1∶10 and 1∶20, while the difference was not statistically significant at the ratio of 1∶40 and 1∶80 (P>0.05). At the co-culture ratio of 1∶10, IL-2 secreted by CTL in DC, co-cultured and fused cells was(27.30±5.21 ),(897.44±93.05),(2 243.80±381.46)ng/L; IL-10 was (19.55±2.05),(424.60±108.25),(706.53±161.29)ng/L; Granzyme B was(16.23±1.23),(451.07±120.50),(1327.77±205.15)ng/L; IFN-γ was (30.11±4.32 )、(982.00±124.68)、(2421.04±488.50)ng/L. Cytokines from the antigen-specific CTL induced by DC fused with MiaPaCa-2 cells were significantly higher than those by DC and DC co-cultured with MiaPaCa-2 cells ( all P<0.05). ConclusionsThe fusion of DC and pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells could stimulate tumor antigen-specific CTL in vitro.

【Key words】Pancreatic neoplasms;Dendritic cells；Cell fusion;T-lymphocytes, cytotoxic

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.003

通信作者：陳江，Email:matrix44@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81071982)

Corresponding author:Chen Jiang, Email: matrix44@163.com

(收稿日期：2015-10-15)