霍如雪++劉振寧++楊青

摘要：果膠甲酯酶屬于碳水化合物酯酶家族CE-8，是調(diào)節(jié)果膠甲酯化程度的一種普遍存在的酶，是植物細(xì)胞壁的主要成分。為深入研究桃PME基因家族的功能，利用生物信息學(xué)方法對(duì)桃基因組中PME基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其基因組信息、蛋白生理生化特征、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在桃基因組中共鑒定出69個(gè)PME基因，可以分為Group Ⅰ、Group Ⅱ兩大類，Group Ⅱ又可以進(jìn)一步分成3個(gè)分支；PME基因在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，并存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含47個(gè)基因，串聯(lián)重復(fù)是桃PME基因擴(kuò)增的主要方式。對(duì)桃PME基因結(jié)構(gòu)的分析表明，PME基因在進(jìn)化上存在著一定的保守性；對(duì)桃PME蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)了PME蛋白5個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域；通過(guò)MEME軟件對(duì)桃PME蛋白保守基序的分析發(fā)現(xiàn)了12個(gè)比較保守的基序。

關(guān)鍵詞：桃；果膠甲酯酶；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S662.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0024-07

E-mail：wgq@lcu.edu.cn。果膠是植物細(xì)胞初生壁和胞間層的主要成分[1]，果膠的去酯化能夠引起植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能特性的改變，在果實(shí)成熟軟化、器官脫落和衰老、花粉發(fā)育、花粉管生長(zhǎng)和抗逆性等方面具有重要作用[2-9]。果膠的去酯化是由果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME，EC 3.1.1.11）催化完成的，果膠甲酯酶廣泛存在于所有高等植物以及一些細(xì)胞壁降解的微生物如細(xì)菌、真菌中[10]。在高等植物中，果膠甲酯酶通常以多種異構(gòu)體的形式存在，表現(xiàn)出對(duì)特定細(xì)胞類型的特異性[11]。

果膠甲酯酶基因（PMEs）屬于一類比較大的基因家族，在高等植物中，根據(jù)其基因和蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為2類：Type Ⅰ、Type Ⅱ。Type Ⅱ類PME蛋白具有1個(gè)比較長(zhǎng)的N-端PRO區(qū)域，而Type Ⅰ類PME蛋白的PRO區(qū)域很短甚至缺失。對(duì)PRO區(qū)域功能的研究表明，該區(qū)域具有將PME蛋白定位到細(xì)胞壁上、蛋白的正確折疊及對(duì)PME活性的抑制等作用[12]。對(duì)PME基因功能的研究表明，PME基因參與了形成層細(xì)胞的分化[13]、下胚軸的伸長(zhǎng)[14]、花粉發(fā)育[7，15]、花粉管生長(zhǎng)[5-6]和果實(shí)成熟[2，16]等一系列生理生化過(guò)程。另外，在食品加工和造紙等生產(chǎn)工藝中已廣泛利用果膠甲酯酶活性來(lái)改善產(chǎn)品品質(zhì)[17]。目前已經(jīng)對(duì)擬南芥[6]、水稻[18]、楊樹(shù)[19]、小立碗蘚[20]等物種中的PME基因進(jìn)行了全基因組鑒定和分析，而對(duì)桃PME基因的研究?jī)H限于對(duì)桃果實(shí)成熟過(guò)程中PME蛋白活性變化[21-22]和PME基因表達(dá)量變化[23]的分析，缺乏從全基因組水平上對(duì)桃PME基因家族的相關(guān)研究。

桃（Prunus persica）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，是世界上廣泛栽培的落葉果樹(shù)之一。與薔薇科木本植物如李、酸櫻桃等多倍體果樹(shù)相比，桃是二倍體（n=8 ），具有相對(duì)較小的基因組（230 Mbp），而且具有相對(duì)短的童期（ 2～3年），這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使得桃成為李屬及其他薔薇科植物的模式基因組物種[24]。桃基因組測(cè)序的完成和序列釋放[25-26]使得在全基因組水平上對(duì)桃重要功能基因的發(fā)掘比較和功能研究成為可能。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)桃PME基因家族成員進(jìn)行鑒定和基因組注釋，并分析了其基因結(jié)構(gòu)和保守域，以期為進(jìn)一步對(duì)桃PME家族基因的功能研究提供基礎(chǔ)信息并最終在分子水平上對(duì)桃品種的改良提供明確候選基因。

1材料與方法

1.1桃PME基因家族的鑒定

首先，利用擬南芥PME蛋白的氨基酸序列作為種子序列在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_ version 2.0）[26]中進(jìn)行BLASTp比對(duì)搜索。其次，為保證候選基因沒(méi)有被遺漏，我們又利用搜索到的PME蛋白的氨基酸序列對(duì)桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行2次BLASTp比對(duì)搜索。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.janelia.org/）[27]、SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[28]、NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） [29]分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)候選蛋白的氨基酸序列是否具有PME的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行候選PME基因的篩選和鑒定。

1.2桃PME基因的基因組信息和染色體定位

桃PME基因的序列和基因組信息通過(guò)桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，并根據(jù)每個(gè)PME基因在染色體上的精確位置和染色體長(zhǎng)度使用Photoshop軟件將其人工定位到對(duì)應(yīng)染色體上。

1.3桃PME蛋白的生理生化分析

PME蛋白的分子量和等電點(diǎn)通過(guò)Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html） [30]來(lái)預(yù)測(cè)。信號(hào)肽序列通過(guò)SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[31]進(jìn)行分析。糖基化位點(diǎn)通過(guò)NetNGly （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）[32]進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4桃PME基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進(jìn)化樹(shù)分析

利用GSDS網(wǎng)站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[33]來(lái)分析PME基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。用在線的MEME軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html） [34]鑒定PME蛋白氨基酸序列中的基序。用Clustal X軟件[35]對(duì)PME蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。在進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建方面，首先利用MEGA5.0軟件（http：//www.megasoftware.net/）[36]自帶的Clustal W應(yīng)用對(duì)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴(kuò)展罰分設(shè)置為0.2。然后利用MEGA5.0軟件將比對(duì)好的序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正、成對(duì)刪除、1 000次重復(fù)等建樹(shù)參數(shù)[37]。

2結(jié)果與分析

2.1桃PME基因家族的鑒定與注釋

根據(jù)擬南芥PME蛋白的氨基酸序列，通過(guò)對(duì)桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp比對(duì)搜索，在桃基因組中共鑒定出69個(gè)PME蛋白（表1）。根據(jù)PME蛋白中有無(wú)PME、PMEI結(jié)構(gòu)域可以將這69個(gè)PME蛋白分成2大類：Group Ⅰ、Group Ⅱ。利用MEGA 5.0軟件對(duì)桃和模式植物擬南芥中PME蛋白進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和聚類分析的研究，又可以將Group Ⅱ細(xì)分成Group Ⅱ-a、Group Ⅱ-b、Group Ⅱ-c 3類（圖1）。Group Ⅰ包括32個(gè)PME蛋白成員，只具有1個(gè)PME結(jié)構(gòu)域；基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度相對(duì)較短，長(zhǎng)度為501～1 443 bp，編碼166～480位氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量為18.67～51.48 ku，等電點(diǎn)范圍為 4.93～9.42。Group Ⅱ包括37個(gè)PME蛋白成員，同時(shí)具有PME、PMEI結(jié)構(gòu)域；基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為477～3 534 bp，編碼158～1 177位氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量為17.26～127.82 ku，等電點(diǎn)為5.54～9.63。對(duì)桃PME蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)表明，其中39個(gè)PME蛋白存在1段N末端信號(hào)肽，信號(hào)肽長(zhǎng)度范圍在1～16到1～33個(gè)氨基酸之間。值得注意的是，Group Ⅱ-b中的12個(gè)蛋白成員均沒(méi)有預(yù)測(cè)到信號(hào)肽的存在。前人研究發(fā)現(xiàn)，PME蛋白的糖基化影響其酶活性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性、對(duì)果膠的活性等[38-39]。筆者對(duì)桃PME蛋白糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)表明，PME蛋白中廣泛存在著1～14個(gè)不等的糖基化位點(diǎn)。2.2桃PME基因的染色體定位分析

為對(duì)桃PME基因在染色體上的分布有更加明確的認(rèn)識(shí)，根據(jù)桃PME基因的基因組信息，分別將其定位到桃的8條染色體上，其中Prupe.I005000、Prupe.I005200這2個(gè)PME基因位于scaffold_51上而未能正確定位到染色體上（圖2）。結(jié)果表明，PME基因在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第1、2、6、7條染色體上具有較多的PME基因，而第3、4、5、8條染色體上的PME基因比較少。此外，PME基因在染色體上的分布存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)串聯(lián)重復(fù)的基因簇，共包含47個(gè)基因，占PME基因總數(shù)的68.1%。

2.3桃PME基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究桃PME基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)桃基因組信息獲取了每個(gè)PME基因的DNA、CDS序列信息并構(gòu)建了其基因結(jié)構(gòu)（圖3）。結(jié)果表明，大部分PME基因都有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)基因結(jié)構(gòu)和基因進(jìn)化樹(shù)的比較分析發(fā)現(xiàn)：每個(gè)分支中

2.4桃PME蛋白的氨基酸序列比對(duì)和保守域分析

為研究桃PME蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用CLUSTAL X對(duì)桃PME蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。圖4的比對(duì)結(jié)果表明，PME蛋白一般具有5個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域：Region Ⅰ（GxYxE）、Region Ⅱ（QAVAxR）、Region Ⅲ（QDTL）、Region Ⅳ（GxxDFIFG）、Region Ⅴ（YLGRxWx）。另外，利用MEME軟件對(duì)桃PME蛋白保守基序的分析發(fā)現(xiàn)了12個(gè)比較保守的基序（motif 1～motif 12）（圖5），其中motif 7、motif 6、motif 4、motif 1、motif 2分別對(duì)應(yīng)Ⅰ—Ⅴ 5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。

3結(jié)論與討論

桃、擬南芥、水稻、楊樹(shù)基因組大小分別為230、125、466、480 Mbp，這4個(gè)物種基因組中PME基因的數(shù)量分別為69、66、35、89個(gè)，說(shuō)明桃基因組中PME基因出現(xiàn)了一定的數(shù)目擴(kuò)增。基因擴(kuò)增是基因組進(jìn)化最主要的驅(qū)動(dòng)力之一，是產(chǎn)生具有新功能的基因和進(jìn)化出新物種的主要原因之一?；蚩梢酝ㄟ^(guò)多種方式進(jìn)行擴(kuò)增，包括全基因組復(fù)制、串連復(fù)制、片

段復(fù)制和逆轉(zhuǎn)座復(fù)制等。對(duì)桃PME基因染色體定位的研究發(fā)現(xiàn)，PME基因在染色體上的分布存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共有18個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含47個(gè)基因，占PME基因總數(shù)的68.1%，說(shuō)明串聯(lián)重復(fù)是桃PME基因擴(kuò)增的主要方式。

對(duì)桃、擬南芥、楊樹(shù)、水稻和小立碗蘚等5個(gè)代表性物種中PME基因家族成員分類比較的研究發(fā)現(xiàn)，桃、擬南芥、楊樹(shù)、水稻這4個(gè)高等植物中均同時(shí)具有Group Ⅰ、Group Ⅱ 2類PME基因，但是小立碗蘚中只具有Group Ⅰ類的PME基因。筆者也分析了6種真菌、10種細(xì)菌中的PME基因，發(fā)現(xiàn)它們也都屬于Group Ⅰ類，這說(shuō)明Group Ⅱ類的PME基因是在苔蘚植物、維管植物分化完成后才出現(xiàn)的，這與Markovi等對(duì)細(xì)菌、真菌和高等植物中PME基因進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果[10]是一致的。但是關(guān)于PME基因到底是在哪一類物種中首先出現(xiàn)的，還需要進(jìn)一步研究。

桃的使用主要是鮮食、加工2種方式，而這2種方式對(duì)果實(shí)的硬度、成熟度要求不同[40-41]。果實(shí)的軟化主要是多聚半乳糖醛酸酶（PG）、PME相互作用的結(jié)果。目前一般認(rèn)為，PME的作用是去除果膠分子鏈上半乳糖醛酸羧基上的酯化基團(tuán)（主要是羥甲基或羥乙基），增加果膠在水中的溶解度，從而造成適于PG作用的條件[42]。Tieman等應(yīng)用反義RNA技術(shù)在番茄中高表達(dá)反義PME mRNA，抑制了果實(shí)中果膠甲酯酶的活性，其成熟過(guò)程雖然沒(méi)有受到明顯干擾，但是果膠的高度甲酯化明顯影響了果膠代謝，改善了果實(shí)品質(zhì)[43]。另外，果膠甲酯酶在果汁生產(chǎn)中廣泛用于澄清果汁、提高果漿出汁率、浸提和液化果肉組織以及用于生產(chǎn)混濁果汁及帶果肉的果汁等[44]，具有重要的食品加工價(jià)值。因而對(duì)桃PME基因的研究能夠?yàn)榕嘤鲜袌?chǎng)需求的桃優(yōu)良品種、應(yīng)用基因工程改良果實(shí)成熟特性以及桃加工方式的創(chuàng)新等提供重要的理論依據(jù)，具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

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