李俊剛++姜立春++馬家俊

摘要：為了提高煙堿降解菌A4降解煙堿的能力，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法對(duì)菌株A4發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，通過單因素試驗(yàn)確定了影響菌株A4生長的培養(yǎng)基主要因素為pH值、煙堿含量、碳源、氮源；采用4個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交分析，確定了發(fā)酵的最佳條件為：在培養(yǎng)溫度為30 ℃、pH值7.0、煙堿含量2.0 g/L、接種量 5.0%、檸檬酸三鈉0.3%、胰蛋白胨1.5%條件下，培養(yǎng)48 h，其煙堿降解率為72.8%比優(yōu)化前提高了22.5%。結(jié)果為采用生物技術(shù)降解煙堿廢棄物以及改善煙葉品質(zhì)方面提供了良好的菌種資源。

關(guān)鍵詞：煙堿；煙堿降解菌；生物降解；條件優(yōu)化；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： TS41+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0431-04

煙堿（nicotine）又名尼古丁，是煙草生物堿的主要成分，占煙草生物堿的95%以上，是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一[1-2]。一般來講，煙堿含量高的煙葉，煙氣勁頭大，反之則小。煙堿含量較高的煙葉可利用性比較差，傳統(tǒng)物理和化學(xué)方法降解煙堿不僅會(huì)影響環(huán)境，甚至對(duì)人類造成危害。利用微生物降解煙堿含量不僅高效，而且具有一定的選擇性，可用于降解煙草中煙堿和環(huán)境中被煙堿污染的廢棄物，對(duì)香煙品質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生不利的影響，并滿足消費(fèi)群體對(duì)低煙堿卷煙的需求[3-6]。

目前，國內(nèi)外已有報(bào)道篩選分離出一些煙堿降解菌株[7-8]，這些微生物可以在煙草工業(yè)和處理煙草廢棄物中發(fā)揮重要作用。Tashiro等從44個(gè)含有煙堿的土壤和廢水取樣中獲得57種細(xì)菌，這些細(xì)菌都呈短棒狀，用煙堿作為唯一碳氮源，在2周內(nèi)能降解濃度為1.0 g/L的煙堿[9]?？做┑葟暮笔∠尻柺袩煵莘N植地中分離得到1 株煙堿降解菌，初步確定為煙堿節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.），該菌在煙堿質(zhì)量濃度為4 g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后煙堿降解率達(dá)71% 以上[10]。2005年，阮愛東等篩選出1株假單胞菌（Pseudomonas sp. HF-1），該菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 h，煙堿濃度為1.3 g/L，測得煙堿降解率為99.6%[11]。袁勇軍等從福建三明煙區(qū)的土壤中分離得到一種菌，經(jīng)過鑒定屬于為中間蒼白桿菌，該菌36 h降解了9756% 的煙堿，當(dāng)煙堿的濃度低于2 g/L時(shí)，菌株能完全降解煙堿[12]。本研究從川渝中煙工業(yè)公司四川公司綿陽分廠的垃圾堆廢棄煙渣中篩選后獲得優(yōu)良降解煙堿菌株A4，研究了不同煙堿濃度和不同培養(yǎng)條件下該菌株對(duì)煙堿的降解能力，旨在為降低煙葉煙堿含量、提高煙葉可用性等提供理論依據(jù)。1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株節(jié)桿菌屬A4菌株，本課題組從川渝中煙工業(yè)公司四川公司綿陽分廠的垃圾堆廢棄煙渣中篩選后獲得的優(yōu)良降解煙堿菌株，經(jīng)形態(tài)鑒定、生理生化特性測定和16S rRNA系統(tǒng)分析，初步鑒定為節(jié)桿菌屬，保存于綿陽師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2煙堿培養(yǎng)基K2HPO4 13.3 g，KH2PO4 4.0 g，酵母提取物1.0 g，微量元素溶液10 mL，加蒸餾水至1 000 mL，pH值70，培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，加入一定量煙堿（用0.22 μm濾膜過濾），固體煙堿培養(yǎng)基添加2.0%瓊脂[4]。

1.1.3微量元素溶液MnSO4·7H2O 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g 使用0.1 mol/L HCl定容至100 mL[5]。

1.2主要試劑與儀器

煙堿含量≥98%，宜陽縣天成生化有限責(zé)任公司；WFZ-UV-2000紫外分光光度儀，SC-3610低速離心機(jī)，KYC-100C恒溫氣浴式振蕩器，Sanyo高壓蒸汽滅菌鍋，YT-CJ-1N超凈工作臺(tái)等。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備接種1環(huán)A4菌到裝有10 mL煙堿液體培養(yǎng)基的試管中，于28 ℃下150 r/min培養(yǎng)48 h。再將這 2 mL 菌懸液接種到100 mL液體培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)48 h。

1.3.2煙堿含量測定將純化菌株接入煙堿培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)，以未接菌的煙堿培養(yǎng)基為空白對(duì)照。發(fā)酵液于8 000 r/min離心20 min，上清液用0.05 mol/L HCl溶液稀釋至合適的吸光度范圍。以0.05 mol/L HCl溶液為參比，進(jìn)行全波長掃描，測得煙堿最大吸收波長為260 nm，在此波長下計(jì)算煙堿降解率：煙堿降解率=（初始培養(yǎng)液中煙堿含量-發(fā)酵液中煙堿含量）/初始培養(yǎng)液中煙堿含量×100%。

1.3.3單因素試驗(yàn)對(duì)A4菌株初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間、煙堿濃度、接種量、培養(yǎng)溫度等發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化。分別設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基中5、6、7、8、9的不同初始pH值；20、25、30、35、40 ℃的不同培養(yǎng)溫度；6、12、18、24、48、72 h不同培養(yǎng)時(shí)間；0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 g/L的不同煙堿濃度；0.5%、1.0%、20%、3.0%、5.0%、8.0%的不同接種量。120 r/min搖床培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)液中煙堿的吸光度，測得不同單因素條件下的煙堿降解率，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)平行，取平均值。

1.3.4不同培養(yǎng)基組分對(duì)菌株降解煙堿的影響分別以含量為2.0 g/L的萄葡糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉等碳源添加培養(yǎng)基中，用于篩選最適碳源[13]；分別以含量為10 g/L的胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸銨、氯化銨等氮源添加培養(yǎng)基中，用于篩選最適氮源。

1.3.5正交試驗(yàn)為確定最適合煙堿降解條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)降解煙堿影響較大的4個(gè)因素，即A：pH值；B：煙堿濃度；C：檸檬酸三鈉；D：胰蛋白胨，設(shè)計(jì)了4個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)L9（34），以煙堿降解率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)（表1），確定復(fù)合因素對(duì)菌株A4降解煙堿的影響。

2結(jié)果與分析

2.1煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取煙堿質(zhì)量濃度為1.0 g/L的工作液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用濃度為0.05 mol/L的鹽酸溶液定容到50 mL，稀釋至0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014 mg/mL。用同濃度的鹽酸溶液做參比，在此波長下測量不同濃度煙堿的吸光值，以煙堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為坐標(biāo)軸繪制煙堿含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。吸光值（y）與煙堿含量（x）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=38.929x-0.008 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。

2.2單因素培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1不同pH值對(duì)菌株降解煙堿的影響在初始pH 值不同的條件下，在150 r/min、30 ℃下振蕩培養(yǎng)72 h，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，在pH值為6.0～7.5時(shí)，菌株降解煙堿的效果比較好。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，降解效果最好，其降解率達(dá) 27.5%；而pH值<6.0或>8.0時(shí)菌株降解煙堿的能力下降較快。通常認(rèn)為培養(yǎng)基中的氫離子和氫氧根離子間接的對(duì)微生物產(chǎn)生影響，起初作用于胞外可解離的弱酸或弱堿，容易形成透過細(xì)胞膜的游離態(tài)進(jìn)入胞內(nèi)，再作用于參與代謝的各種酶類，從而影響菌體的生長和酶的合成，進(jìn)而影響菌株A4對(duì)煙堿的降解率[14]。因此，煙堿降解菌A4的最適降解pH值為7. 0。

2.2.2不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株降解煙堿的影響在培養(yǎng)時(shí)間不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、溫度為30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)72 h，每隔6 h取樣測煙堿濃度1次，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，煙堿濃度隨菌株培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低，其降解率逐漸升高；在48 h時(shí)，培養(yǎng)液中煙堿濃度僅為 1.27 g/L，其降解率達(dá)36.5%，此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，其煙堿降解率變化不大。因此，選擇48 h為菌株最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.3不同煙堿濃度對(duì)菌株降解煙堿的影響在培養(yǎng)基中煙堿濃度不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、溫度為30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，結(jié)果表明，當(dāng)煙堿質(zhì)量濃度為0.1～2.0 g/L 時(shí)，隨著濃度的升高，煙堿降解效率逐漸升高；在濃度為2.0 g/L時(shí)，其降解率最高，為35.8%。當(dāng)濃度高于 2.0 g/L 時(shí)，煙堿降解率迅速下降，當(dāng)濃度達(dá)到3.0 g/L時(shí)，其降解率最低，為13.3%（圖4），這可能由于高濃度煙堿對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，抑制了其生長從而影響了對(duì)煙堿的降解。因此，煙堿降解菌A4最適初始煙堿濃度為2.0 g/L。

2.2.4不同接種量對(duì)菌株降解煙堿的影響在培養(yǎng)基中接種量不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、溫度為30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，結(jié)果表明，隨著接種量的升高，其煙堿降解率也逐漸增高，當(dāng)接入量為0.5%～5.0%時(shí)，隨接入量的增加，降解率上升較快，但接入量高于5.0%時(shí)降解率趨于平穩(wěn)（圖5）。因此，選擇5.0%作為最適接種量。

2.2.5不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株降解煙堿的影響在培養(yǎng)基中培養(yǎng)溫度不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、接種量為5.0%條件下振蕩培養(yǎng)48 h，結(jié)果表明，溫度過低或過高對(duì)煙堿的降解都有較大影響，在溫度為25～35 ℃，菌株降解效果較好，在30 ℃時(shí)降解率達(dá)到最高，為54.2%（圖6）。因此，選擇 30 ℃ 作為最適培養(yǎng)溫度。

2.3培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.3.1不同碳源對(duì)菌株降解煙堿的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中改用了不同碳源，考察不同碳源對(duì)菌株A4降解煙堿的影響，碳源是不可缺少的重要元素之一，不同的碳源會(huì)影響微生物的生長和降解酶的合成。從圖7可以看出，A4菌株降解率隨著培養(yǎng)液中添加的碳源不同其降解率也隨之改變。當(dāng)培養(yǎng)液中添加檸檬酸三鈉為碳源時(shí)，菌株的降解率最大，為46.1%，且對(duì)煙堿降解影響較大。當(dāng)培養(yǎng)液中分別添加乳糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉作為碳源時(shí)，A4菌株的降解率依次為23.3%、30.2%、26.5%和26.3%，其中以葡萄糖作為碳源時(shí)的降解率最低，為21.5%。因此，選擇檸檬酸三鈉作為最適碳源。

2.3.2不同氮源對(duì)菌株降解煙堿的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中改用了不同氮源，考察不同氮源對(duì)菌株A4降解煙堿的影響。從圖8可以看出，A4菌株降解率隨著培養(yǎng)液中添加的氮源不同其降解率也隨之改變。當(dāng)培養(yǎng)液中添加胰蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株的降解率最大，為50.3%，當(dāng)培養(yǎng)液中分別添加牛肉膏、酵母粉和氯化銨作為氮源時(shí)，A4菌株的降解率依次為40.3%、48.8%、31.2%，其中以硝酸銨作為氮源時(shí)的降解率最低，為23.2%，表明該菌株不能很好地利用無機(jī)氮源。因此，選擇胰蛋白胨作為最適碳源。

2.4正交試驗(yàn)

為了更好地提高煙堿降解率，本研究選擇了影響煙堿降解較大的4個(gè)因素，即pH值、煙堿濃度、檸檬酸三鈉和胰蛋白胨含量，進(jìn)行3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步提高煙堿降解率。在不同條件下，以降解率為指標(biāo)分析煙堿降解條件，結(jié)果見表2。由極值R值可知，不同因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響依次為：B>A>C>D；從方差分析可看出，因素B的主效應(yīng)很顯著，即煙堿濃度對(duì)菌株降解效率有較大影響，其次是pH值和檸檬酸三鈉，最后為胰蛋白胨（表3）。綜合各種因素得出，4個(gè)因素正交試驗(yàn)降解煙堿適宜條件最優(yōu)水平組合為A2B2C3D3，即：pH值為7.0，煙堿濃度為2.0 g/L，檸檬酸三鈉濃度為0.3%，胰蛋白胨含量為1.5%（表2）。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，依據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最適培養(yǎng)基組成進(jìn)行試驗(yàn)。3個(gè)平行試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過正交優(yōu)化培養(yǎng)基后煙堿降解率為72.8%，比優(yōu)化前50.3%提高了44.7%，可見優(yōu)化后的培養(yǎng)基能明顯提高菌株A4對(duì)煙堿的降解能力。

3結(jié)論

通過以煙堿降解率為指標(biāo)的單因素和正交試驗(yàn)，確定A4菌株的最優(yōu)煙堿降解方案：即pH值7.0、接種量5.0%、檸檬酸三鈉含量0.3%、胰蛋白胨含量1.5%、煙堿含量2.0 g/L，溫度30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，以上述優(yōu)化組合培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)液中煙堿的吸光度，其煙堿降解率達(dá)到72.8%，同單因素培養(yǎng)條件下的降解率50.3%相比，提高了44.7%，優(yōu)化后的組合有明顯的降解優(yōu)勢。該試驗(yàn)結(jié)果表明，煙堿降解菌A4 對(duì)煙堿具有較強(qiáng)的代謝降解能力，這將為利用生物技術(shù)降解煙堿廢棄物和降低煙葉中煙堿含量提供良好的菌種資源。

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