張清霞++王英+李曦+劉正坪++唐文華+童蘊(yùn)慧

摘要：利用煙草-花葉病病害體系檢測(cè)苯并噻唑硫代乙酸甲酯（benzothiadiazoles，BTH）、金針菇（Flammulina velutipes）發(fā)酵液提取物（JZG）誘導(dǎo)抗病作用。試驗(yàn)用盆栽珊西煙（Nicotiana tobacum，Xanthi-nc）為材料，用誘導(dǎo)劑處理煙草第6片葉，然后在上部未處理葉接種煙草花葉病毒（TMV），結(jié)果發(fā)現(xiàn)上部葉片產(chǎn)生的TMV枯斑數(shù)與對(duì)照相比顯著減少，說明這2種誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。同時(shí)研究了BTH、JZG作為誘導(dǎo)劑處理煙草后寄主內(nèi)幾種抗病相關(guān)酶的變化，結(jié)果表明煙草葉片組織中的幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性增加，且酶活性可在處理后15 d內(nèi)維持高于對(duì)照組的水平。

關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶；β-1，3-葡聚糖酶；煙草；金針菇；病程相關(guān)蛋白

中圖分類號(hào)： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0220-02

收稿日期：2015-05-11

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31000875）；揚(yáng)州大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助。

作者簡介：張清霞（1976—），女，博士，副教授，主要從事植物病害生物防治。E-mail：zqx817@sohu.com。

通信作者：唐文華，博士，教授，主要從事土傳病害生物防治研究。E-mail：wenhuatang@sina.com。誘導(dǎo)抗性是指植物受到適當(dāng)刺激后獲得的對(duì)隨后病原菌侵染的抵抗能力[1]。許多植物上誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)不僅在植物的初侵染部位增強(qiáng)，而且在未受侵染、空間上隔離的部位也增強(qiáng)，這種誘導(dǎo)抗性又稱為系統(tǒng)性獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。病原菌誘導(dǎo)的SAR一個(gè)顯著特征就是寄主植物水楊酸（ssalicylic acid，SA）合成的增加。SA是SAR信號(hào)傳導(dǎo)中的重要因子。SAR的另一個(gè)特征是所謂的SAR基因的激活，包括編碼病程相關(guān)蛋白的基因[2]，它們通常被用作誘導(dǎo)抗性的標(biāo)記。人們通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，不但真菌、細(xì)菌和病毒能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[2-3]，而且一些體外無殺菌作用的化學(xué)物質(zhì)，如水楊酸（SA）、2，6-二氯異煙酸（INA）、苯并噻唑硫代乙酸甲酯（benzothiadiazole，BTH）[4]等也具有這種能力。

植物誘導(dǎo)抗病性具有抗病譜廣、持續(xù)時(shí)間長、系統(tǒng)性等優(yōu)點(diǎn)，而且大部分的誘導(dǎo)劑對(duì)環(huán)境無污染[5]。這些特點(diǎn)說明植物誘導(dǎo)抗病性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有良好的應(yīng)用前景。BTH就是這樣一個(gè)理想的誘導(dǎo)劑，它不僅能誘導(dǎo)植物抵抗苗期病害，而且對(duì)植物采后病害也有良好的防治效果[6]。但是BTH目前只在歐洲市場實(shí)現(xiàn)了商品化，在我國尚未注冊(cè)應(yīng)用。本項(xiàng)工作作為尋找新型誘抗劑的初步研究，利用煙草系統(tǒng)來檢測(cè)金針菇發(fā)酵液是否具有誘導(dǎo)寄主抗病性的功能，以及經(jīng)該液體處理后寄主體內(nèi)抗病相關(guān)蛋白的變化。

1材料與方法

1.1植物材料

煙草品種：珊西煙（Nicotiana tobacum，Xanthi-nc），溫室中自然光照生長，植株第13片真葉完全展開時(shí)用于試驗(yàn)。

1.2供試抗性誘導(dǎo)劑

JZG（金針菇發(fā)酵液提取物），金針菇菌株接入馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，放置振蕩搖床（130 r/min）培養(yǎng)12 d（28 ℃），紗布過濾，濾液用乙酸乙酯以1 ∶ 1比例抽提，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以甲醇溶解濃縮物（濃縮1 000倍），使用時(shí)兌蒸餾水稀釋1 000倍；BTH（benzothiadiazoles），諾華農(nóng)化有限公司生產(chǎn)，使用濃度為75 μg/mL。

1.3供試毒源與濃度

TMV毒源由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植病系病毒室提供，取1 g病葉加10 mL磷酸緩沖液（pH值 6.8）研磨成勻漿，紗布過濾，磨擦接種普通煙，發(fā)病后病葉用作TMV毒源。

1.4處理時(shí)間與方法

取長勢(shì)均一的珊西煙（13葉期），各種誘導(dǎo)劑或清水以涂抹方式處理煙草的第6片葉，以濕潤為準(zhǔn)。清水處理為對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3株。處理6 d后，在上部未用誘導(dǎo)劑處理的第7、8、9片葉片表面采用摩擦接種法接種TMV。

1.5調(diào)查時(shí)間

TMV枯斑充分表現(xiàn)（接種TMV后2～3 d，25 ℃），統(tǒng)計(jì)各處理不同葉位的枯斑數(shù)目。

1.6取樣方法

分別在誘導(dǎo)劑處理珊西煙后1、6、9、15、20、25 d，取上部未處理的第7、8、9葉為樣本，液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.7酶活性的測(cè)定

將各處理珊西煙葉片在液氮中研磨，按1 g ∶ 2 mL的比例用0.1 mol/L的檸檬酸鈉緩沖液（pH值為5.0）制成勻漿，15 000 r/min 離心15 min（4 ℃），取上清液為粗酶液。按 Boller 的方法[7]測(cè)定總幾丁質(zhì)酶活力?？値锥≠|(zhì)酶活力的定義：在以上條件下催化相當(dāng)于1 μmol N-乙?；咸前罚℅luNAc）所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。按 Abeles 等的方法[8]測(cè)定β-1，3-葡聚糖酶活力。β-1，3-葡聚糖酶活力的定義：1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖當(dāng)量還原糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

2結(jié)果與分析

2.1BTH與JZG對(duì)珊西煙抗病性的誘導(dǎo)

使用BTH與JZG處理珊西煙第6片葉，6 d后在上部未處理的第7、8、9片葉接種TMV，接種2 d后枯斑反應(yīng)完全顯現(xiàn)。由表1可見，BTH和JZG處理的第7、8、9片葉上的TMV枯斑數(shù)較對(duì)照差異顯著（P<0.05），據(jù)目測(cè)觀察，病斑大小無差異。TMV枯斑數(shù)以第7葉上最多，第8葉、第9葉次之，說明BTH、JZG在幼嫩組織上誘導(dǎo)的抗性較強(qiáng)，這也符合系統(tǒng)性誘導(dǎo)抗性的特性。說明BTH和JZG能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，減少了TMV的侵染。

2.2BTH和JZG處理珊西煙后總幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

用BTH和JZG 處理珊西煙第6片葉，對(duì)照用清水處理，之后1、6、9、15、20 d及25 d取上部未處理葉片為樣本測(cè)定總幾丁質(zhì)酶的活性和β-1，3-葡聚糖酶活性，結(jié)果見圖1，BTH和JZG均能增強(qiáng)珊西煙葉片中總幾丁質(zhì)酶活性。從處理后 1 d 即可檢測(cè)到酶活性高于對(duì)照，BTH處理珊西煙后煙草葉組織中幾丁質(zhì)酶活性持續(xù)上升，處理后25 d內(nèi)維持高于對(duì)照的酶活性水平，且在處理后20 d達(dá)到最高，以后逐漸下降直至對(duì)照水平；JZG處理的珊西煙幾丁質(zhì)酶活性則在誘導(dǎo)后 15 d 達(dá)到最高水平。對(duì)β-1，3-葡聚糖酶的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果（圖2）：BTH和JZG處理珊西煙后，均使其葉片組織中β-1，3-葡聚糖酶活性增加，明顯高于對(duì)照水平，二者都能在誘導(dǎo)后15 d內(nèi)使β-1，3-葡聚糖酶活性保持高于對(duì)照的水平，以后酶活性緩慢下降。BTH和JZG處理珊西煙后，珊西煙葉片的總幾丁質(zhì)酶活性由低到高增加，以后呈下降趨勢(shì)，而β-1，3-葡聚糖酶活性雖然高于對(duì)照，但是從誘導(dǎo)1 d起就呈下降趨勢(shì)。

已有報(bào)道說明BTH能在許多作物上誘導(dǎo)SAR，在煙草上可誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性增強(qiáng)[9]。JZG與BTH在珊西煙上具有相似的反應(yīng)，都可誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，并且降低TMV的侵染率，說明JZG作為誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。

3討論

用BTH和JZG處理珊西煙下部葉片后，發(fā)現(xiàn)上部未處理葉片上TMV枯斑數(shù)目均較清水對(duì)照顯著減少。這一特性符合系統(tǒng)性獲得性抗性的主要特征：即經(jīng)過生物的或非生物因子誘導(dǎo)處理后，植株處理或未處理部位產(chǎn)生對(duì)隨后病原物侵染的抗性。

幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶是植物病程相關(guān)蛋白（PRs），也是SAR的重要標(biāo)記。正常情況下，這2種酶只有低水平的組成型表達(dá)，當(dāng)用誘導(dǎo)因子處理后，酶活性會(huì)迅速增加。這2種酶在離體條件下具有聯(lián)合抑菌活性，因此通常被看作是植物抵抗病原菌潛在的抗性機(jī)制[10-11]。BTH和JZG能誘導(dǎo)珊西煙體內(nèi)總幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性的提高，并且能維持較長一段時(shí)間，這對(duì)于誘導(dǎo)抗病效果是一個(gè)重要的影響因素。BTH和JZG誘導(dǎo)珊西煙后20 d內(nèi)，幾丁質(zhì)酶活性保持在較高的水平，β-1，3-葡聚糖酶活性也可在誘導(dǎo)后15 d內(nèi)維持在較高的水平。這說明BTH和JZG處理珊西煙植株15～20 d內(nèi)，植株是處在抗病反應(yīng)時(shí)期。這為適時(shí)地使用BTH和JZG提供了參考的信息，即可在病害發(fā)生前的15 d內(nèi)使用誘導(dǎo)劑。

BTH是已經(jīng)商品化的誘抗劑，它能在許多作物上誘導(dǎo)抗性，而且其誘導(dǎo)植物的抗性與其誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性的增加有關(guān)[12]。本研究表明金針菇發(fā)酵液提取物與BTH有相似的抗TMV反應(yīng)，且具有相似的酶活性變化趨勢(shì)。這說明JZG作為誘導(dǎo)劑可能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生與BTH誘導(dǎo)（部分）相同的防衛(wèi)反應(yīng)，也就是說金針菇發(fā)酵液的乙酸乙酯提取相中有起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)，其有效成分還有待于今后進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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