26種植物甲醇提取物對3種植物病原細菌的抑制活性

魏敬懷++周燚+余思策+向蘭香+杜曉英

摘要：以魔芋軟腐病菌（Ervinia carotovora pv.carotovora）、白菜黑腐病菌[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam） Dowson]、甜瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax avenae citrulli）為供試菌，采用瓊脂藥劑擴散法對26種植物進行抑菌活性篩選。結果表明，銅錢細辛、裸蕓香和小勾兒茶的甲醇提取物在20 mg/mL時對3種病原細菌均有抑制活性。其中，裸蕓香的抑制活性最好，抑菌圈平均直徑分別達1.712、1.611、1.889 cm；銅錢細辛的抑菌圈平均直徑分別為0962、0.874、1.011 cm；小勾兒茶的抑菌圈平均直徑分別為0.671、0.753、0.724 cm。裸蕓香石油醚層萃取部在 5 mg/mL 時對魔芋軟腐病菌的抑菌活性最好，抑菌圈的平均直徑達1.487 cm，是下一步研究的重點。

關鍵詞：植物源農(nóng)藥；甲醇提取物；植物病原細菌；抑菌活性

中圖分類號： S482.2+92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0233-03

收稿日期：2016-03-23

基金項目：湖北省自然科學基金（編號：2015CFA107）。

作者簡介：魏敬懷（1990—），男，安徽淮南人，碩士研究生，從事新農(nóng)藥開發(fā)的研究。E-mail：weijinghuaizmm@163.com。

通信作者：杜曉英，博士，副教授，碩士生導師，從事農(nóng)藥學的教學與研究工作。E-mail：cjdxdxy@163.com。作物細菌性病害是世界性常發(fā)流行性病害，細菌性病害的危害程度比真菌性病害更加嚴重和更加難以防治[1]。隨著蔬菜栽培連作年限的增加，病害發(fā)生逐漸加重[2]。魔芋軟腐病主要是由胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Erwinia bacterium）和菊歐文氏桿菌（Erwinia chrysanthemi）引起的細菌性病害[3]，在魔芋生長和貯藏期均可危害。生長期發(fā)病嚴重時可造成魔芋成片倒苗，發(fā)病嚴重地塊一般連作3年后魔芋基本無收成[4]。白菜黑腐病由野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris）引起，是一種世界性十字花科蔬菜重要病害[5]，嚴重影響白菜的產(chǎn)量和冬貯供應[6]。甜瓜細菌性果斑病又稱細菌性果腐病，其病原菌為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovorax citrulli）[7]，是近年由國外傳入我國的一種毀滅性病害[8]。目前針對以上3種病害主要依靠抗病育種和化學藥劑防治?？共∮N操作困難且周期較長，化學藥劑防治不但污染環(huán)境，而且長期大量使用化學藥劑易使細菌產(chǎn)生抗性，從而大大降低防治效果。自然界中，植物與病原物長期斗爭，此消彼長，結果形成了某些植物獨特的抑菌能力。因此研究植物天然物質(zhì)，尋找結構新穎，作用機理特殊的抑菌活性化合物，是殺菌劑研究與開發(fā)的一條重要途徑。目前關于植物抑菌成分的研究很多，科研人員發(fā)現(xiàn)菊科、唇形科、木蘭科、馬兜鈴科、蓼科、木樨科、百合科、葫蘆科、莎草科、豆科、十字花科、樟科等的某些植物中均含有天然殺菌成分[9-10]。本研究采集了26種植物，分別測定其對3種病原菌的抗菌活性，以期篩選到抑菌活性較好的植物，為下一步分離和純化活性化合物提供材料，同時為進一步開發(fā)利用和保護植物資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試植物材料

植物材料見表1，由武漢植物園江明喜研究員鑒定。

1.2供試細菌

魔芋軟腐病病原菌（Ervinia carotovora pv.carotovora）、白菜黑腐病病原菌[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam） Dowson]、甜瓜細菌性果斑病病原菌（Acidovorax avenae citrulli），以上3種病原細菌由長江大學農(nóng)學院植病課題組提供，周燚教授鑒定。

1.3培養(yǎng)基及其成分

培養(yǎng)基參照并改進袁尚勇的方法[11]制得。每1 L培養(yǎng)基含牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、蔗糖10 g、瓊脂12 g，培養(yǎng)基pH值調(diào)至7.0。

1.4試驗方法

1.4.1植物甲醇提取物對3種植物病原菌的抑菌活性測定方法植物有效成分的提取參照陳興龍等的方法[12]并加以改進，將采集的植物材料陰干，再置于50 ℃電熱鼓風箱烘干，粉碎，用5倍植物材料體積的甲醇分別避光浸提3、2、1 d，合并浸提液，過濾濃縮得植物粗提物，密封置于4 ℃冰箱備用。抑菌活性測定采用瓊脂藥劑擴散法[13]。具體操作如下：稱取1 g植物甲醇提取物，用5 mL丙酮溶解，配成濃度為200 mg/mL的提取物母液。取0.5 mL母液用無菌水定容至5 mL，配制成濃度為20 mg/mL的藥液備用。病原菌于斜面培養(yǎng)基上 30 ℃ 培養(yǎng)2 d，加入無菌水，刮下菌苔，與無菌水充分混合，用比較儀對照制成含細菌濃度為6×109～6×1010 CFU/L的細菌懸浮液。取200 μL細菌懸浮液加入到定量30 mL熔融冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基中，充分搖勻并用9 cm培養(yǎng)皿倒平板，用直徑0.5 cm滅菌打孔器于平板上打孔，并向孔中加入1滴瓊脂，每皿3孔，2個孔為藥劑處理，均加入50 μL藥液，1個孔為空白對照，加入50 μL 10%丙酮溶液。重復3次。將各處理于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察孔穴周圍有無抑菌圈，如有用十字交叉法測量各抑菌圈的直徑，去除孔穴直徑0.5 cm，取其平均值。

1.4.2裸蕓香萃取物對魔芋軟腐病原菌的抑制活性測定采取液-液萃取法。分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯與裸蕓香提取物的水溶物進行等量液-液萃取，每萃取重復3次，合并濃縮各萃取層得到各層萃取部，密封后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。萃取部抗菌活性測定方法同“1.4.1”節(jié)，植物萃取物藥液濃度為5 mg/mL。

2結果與分析

2.126種植物甲醇提取物對3種病原細菌的抑菌活性初篩

采取瓊脂藥劑擴散法測定26種植物甲醇提取物對3種病原細菌的抑制活性，結果見表2。由表2可知，在供試的26種植物中，銅錢細辛、小勾兒茶和裸蕓香的甲醇提取物在濃度為20 mg/mL時對3種植物病原細菌均有抑制活性。其中裸蕓香甲醇提取物對魔芋軟腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌圈直徑最大，抑菌圈平均直徑分別為1712、1.611、1.889 cm；銅錢細辛甲醇提取物對魔芋軟腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌圈直徑次之，抑菌圈平均直徑分別為0.962、0.874、1.011 cm；小勾兒茶甲醇提取物對魔芋軟腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌圈直徑最小，抑菌圈平均直徑僅分別為0.671、0753、0.724 cm。其余供試的23種植物甲醇提取物在濃度為20 mg/mL時對3種植物病原細菌的平均抑菌圈直徑均為0，均無抑菌活性。

2.2裸蕓香甲醇提取物各萃取部對魔芋軟腐病菌的抑菌活性

采取瓊脂藥劑擴散法測定裸蕓香甲醇提取物的各溶劑萃

取部對3種病原細菌的抑制活性，結果見表3。由表3可知，裸蕓香甲醇提取物的各有機溶劑萃取部在濃度為5 mg/mL時對魔芋軟腐病菌均有抑制作用，其中石油醚萃取部抑菌圈的平均直徑最大，達1.487 cm；乙酸乙酯萃取部的抑菌圈平均直徑最小，僅為1.159 cm。裸蕓香甲醇提取物水部濃縮物濃度為5 mg/mL時對魔芋軟腐病菌抑菌圈直徑為0，無抑菌效果。

3討論

本研究測定的26種植物甲醇提取物中，大部分對供試的3種病原細菌無抑制活性，相同的植物提取物對不同的病原細菌的抑制活性也有差別。在對供試3種病原細菌均有抑制活性的3種植物中，在濃度為20 mg/mL時，裸蕓香甲醇提取物的抑菌活性最好，銅錢細辛次之，小勾兒茶最差。由于不同病原菌對相同物質(zhì)的敏感度并不相同，對供試病原菌無活性的這23種植物也可能對其他病原細菌或真菌有抑制活性，本研究并未涉及，所以可以進一步研究這些植物對其他病原菌的抑制活性，以便發(fā)現(xiàn)更多的殺菌植物，以豐富植物性殺菌劑的研究內(nèi)容，為植物性殺菌劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。采取液-液萃取法跟蹤分離裸蕓香甲醇提取物對魔芋軟腐病病原菌的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，在濃度為5 mg/mL裸蕓香甲醇提取物的石油醚層萃取部對魔芋軟腐病病原菌的抑制活性最好，可采取色譜技術對裸蕓香甲醇提取物的石油醚層萃取部進一步分離，以期分離出具有抑菌活性的單體，為新農(nóng)藥的研究與開發(fā)提供結構新穎的先導化合物。

參考文獻：

[1]胡重怡，蔡劉體. 噬菌體治療作物細菌性病害的研究進展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2011，39（3）：101-103.

[2]李寶聚. 我國蔬菜病害研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國蔬菜，2006（1）：1-5.

[3]吳金平. 魔芋軟腐病病原菌及其拮抗菌的研究[D]. 武漢：武漢大學，2010.

[4]魯紅學，周燚，趙明敏，等. 不同藥劑對魔芋軟腐病的防治效果[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（4）：44-45.

[5]Williams P H. Black rot：a continuing threat to world crucifers[J]. Plant Disease，1980，64（8）：736-742.

[6]李省印. 西安地區(qū)大白菜主要病害發(fā)生原因調(diào)查[J]. 北方園藝，1989（9）：29-32.

[7]閻莎莎，王鐵霖，趙廷昌. 瓜類細菌性果斑病研究進展[J]. 植物檢疫，2011，25（3）：71-76.

[8]王雪，高潔，張靜，等. 63種殺菌劑對西瓜、甜瓜細菌性果斑病菌的室內(nèi)毒力測定[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2012，34（6）：612-617，623.

[9]王發(fā)松，楊得波，任三香，等. 香葉樹果揮發(fā)油的化學成分和抗菌活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，11（6）：14.

[10]于文喜，康迎昆，靳春波，等. 暴馬丁香心材提取物中有效抗菌成分的研究[J]. 林業(yè)科技，1996，21（6）：23-25.

[11]袁尚勇. 魔芋軟腐菌生物學特性測定及軟腐病防治方法研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2007.

[12]陳興龍，潘汝謙，蓋云鵬，等. 31種植物甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的抑菌活性測定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2012，39（3）：1-3.

[13]周立剛. 植物抗菌化合物[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2005：74-83.