王　維， 黃亞亞， 王　娜， 崔浪軍

( 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西安 710062 )

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早熟禾細(xì)胞膜脂肪酸衍生化方法比較

王維， 黃亞亞， 王娜， 崔浪軍*

( 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西安 710062 )

摘要：脂肪酸是生物膜的重要組成部分，由于植物細(xì)胞不同生物膜特性也不同，同一種酯化方法對(duì)不同生物膜脂肪酸酯化后測(cè)定分析的結(jié)果很難獲得滿意效果。為了尋找一種比較簡(jiǎn)單、可靠的衍生化方法，該研究以早熟禾葉片為材料，采用三種衍生化方法分別對(duì)其葉綠體、線粒體、液泡及細(xì)胞質(zhì)膜這4種膜脂肪酸衍生化，隨后進(jìn)行GC定量測(cè)定分析。結(jié)果表明：相對(duì)于BF3-甲醇和HCl-甲醇兩種酯化法對(duì)部分膜脂肪酸衍生化程度較低，氯乙酰酯化法對(duì)這4種膜脂肪酸的衍生化效率高、程度完全，GC測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高。該研究結(jié)果為其他相關(guān)植物細(xì)胞的不同膜脂肪酸測(cè)定分析提供了一定的理論借鑒。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞膜, 脂肪酸, 氣相色譜法, 氯乙酰

脂肪酸是植物膜系統(tǒng)的重要組成部分，各脂肪酸的含量及其之間的比例決定著膜的流動(dòng)性，而膜的流動(dòng)性與植物的物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換和代謝調(diào)節(jié)等生理功能密切相關(guān)(Liang et al，2005)。植物膜系統(tǒng)包括葉綠體膜、線粒體膜、細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜等。膜系統(tǒng)中不同的生物膜其生理學(xué)功能與脂肪酸的組成及結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系(Shaikh & Edidin，2008)。細(xì)胞膜是植物逆境傷害的首要發(fā)生地，而細(xì)胞膜的穩(wěn)定性又主要決定于膜脂肪酸不飽和性，不飽和性越高，膜穩(wěn)定性越高，植物抗逆性就越強(qiáng)(趙金梅等，2009)。因此研究植物細(xì)胞膜的脂肪酸組分與比例已成為當(dāng)前抗逆生理學(xué)的熱點(diǎn)問題(Quartacci，2001；Jiang & Gao，2004)。

目前，測(cè)定膜脂肪酸組成和含量的方法很多，但總體上主要步驟為有機(jī)溶劑對(duì)脂類抽提、脂肪酸衍生化與氣相色譜的定量測(cè)定(陳炳超，2012)。衍生化是將脂肪酸轉(zhuǎn)變成為揮發(fā)性物質(zhì)，即脂肪酸的酯化，其中甲酯化是目前采用較多的衍生化方法。甲酯化可分為三大類：由鹽酸、硫酸或三氟化硼等的酸催化和由甲氧基鈉等的堿催化或由二者結(jié)合共同來完成的甲酯化方法(Rodríguez-Palmero，1997)。由于不同生物膜的脂肪酸組成特性不同，研究植物不同細(xì)胞膜系統(tǒng)脂肪酸的含量及其之間的比例時(shí)，不同生物膜的脂肪酸酯化采用同一種酯化方法難以得到滿意效果，但如果采用不同的酯化方法，則費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來，甲酯化法衍生脂肪酸在測(cè)定脂肪酸含量中的應(yīng)用已有不少報(bào)道。已有的研究表明對(duì)于不同植物的膜系統(tǒng)脂肪酸、甚至對(duì)于同種植物的不同膜系統(tǒng)脂肪酸的衍生化采取的方法也不盡相同。藺冬梅等(2001)在測(cè)定豌豆葉綠體膜脂肪酸時(shí)先用KOH-甲醇溶液對(duì)其皂化后，再使用HCl-甲醇甲酯化(Zhang et al，2009 )。刁豐秋(1997)對(duì)大麥葉片類囊體膜脂肪酸測(cè)定時(shí)采用乙酸-甲醇甲酯化。楊秀梅等(2008)測(cè)定番茄類囊體膜脂肪酸時(shí)用KOH-甲醇溶液堿催化甲脂化。而Ramalho et al(1998)對(duì)咖啡類囊體膜、葉綠體膜脂肪酸衍生化時(shí)，先使用KOH-甲醇溶液皂化，再用BF3-甲醇完成甲酯化。Rousch et al(2003)對(duì)海洋硅藻脂肪酸和陳鵬等(2007)用鹽酸酸催化后再加入HCl-甲醇溶液完成脂肪酸甲酯化。張敏等(2009)在研究構(gòu)樹根與葉片內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂肪酸組成時(shí)采用BF3-乙醚-甲醇溶液酯化。因此，若能篩選出一種對(duì)植物不同細(xì)胞膜系統(tǒng)的脂肪酸衍生化效果均好的方法，其意義重大。

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾屬植物，廣泛分布于世界各地，是園林綠化、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)及牧場(chǎng)的主要草種，因而受到高度關(guān)注(方強(qiáng)恩等，2011)。本研究以早熟禾為材料，在提取獲得其葉片的葉綠體膜、線粒體膜、細(xì)胞質(zhì)膜以及液泡膜脂肪酸的基礎(chǔ)上，分別用三種酯化方法對(duì)膜脂肪酸酯化，再利用氣相色譜法進(jìn)行比較分析，旨在選擇出一種同時(shí)適用于這四種膜脂肪酸酯化的方法，從而為相關(guān)植物的細(xì)胞膜脂肪酸測(cè)定提供借鑒。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料選擇健康的早熟禾(Poapratensis)種子播種在裝有混合培養(yǎng)基質(zhì)(蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土，1∶1)的花盆中。日常管理培養(yǎng)20 d后采集葉片。1.1.2 試劑甲醇、異丙醇、氯仿、鹽酸、氫氧化鉀、正己烷、三氟化硼等均為天津市科密歐化學(xué)試劑公司；氯乙?！梅治黾?；7種脂肪酸(16∶0、16∶1、17∶0、18∶0、18∶1、18∶2、18∶3)購(gòu)買于Nu-Chek Prep (Elysian，MN)。17∶0脂肪酸用作內(nèi)標(biāo)物。

1.1.3 儀器和設(shè)備超聲波細(xì)胞破碎儀(Biosafer 4D)、離心機(jī)(eppendorf 5810R)、氣相色譜儀(GC-system，HP-6890)：美國(guó)Agilent公司；AB135-S型精密電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Mili-Q Synthesis超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 膜的提取葉片葉綠體和線粒體膜的提取參照張娟(2009)的方法。葉片細(xì)胞質(zhì)膜與液泡膜的提取與純化分別參照Liang et al(2005)和Quartacci et al(2001)的方法。獲得的膜懸浮液置于-80 ℃保存待用。

1.2.2 膜脂肪酸的提取與測(cè)定取相同量的膜懸浮液(平均約2 mL)，先加入4 mL沸騰異丙醇，后加入12 mL氯仿∶甲醇∶水=1∶1∶1(v/v/v)，搖勻超聲波破碎，4 500 ×g離心10 min，N2吹干下層的氯仿層獲得脂肪酸。取少量提取純化后的膜脂，加入已知量的內(nèi)標(biāo)(17∶0)，分別用以下三種方法酯化。

方法一：參照Ramalho et al(1998)的方法。取少量提取的膜脂，先加入3 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液65 ℃水浴30 min，進(jìn)行皂化反應(yīng)，再用2 mL BF3-甲醇(體積比為1∶4)65 ℃酯化30 min，完成脂肪酸甲脂化。

方法二：參照Rousch et al(2003)的方法。稱取少量提取的膜脂肪酸，采用鹽酸酸催化后，加入2 mL 2.5%(w/w)HCl-甲醇溶液，80 ℃水浴2 h，脂肪酸甲脂化完成。

方法三：參照Masood et al(2005)對(duì)動(dòng)物血紅細(xì)胞膜脂肪酸測(cè)定方法。考慮到植物細(xì)胞膜系統(tǒng)與血紅細(xì)胞質(zhì)膜之間組成上的差異，本研究首先提取獲得早熟禾細(xì)胞膜系統(tǒng)脂肪酸，再對(duì)上述衍生化方法進(jìn)行簡(jiǎn)單優(yōu)化。用預(yù)先制備的酯化反應(yīng)儲(chǔ)備液(1.8 mL甲醇，100 μL內(nèi)標(biāo))，分別配制3%、5%、7%、9%(v/v)的氯乙酰-甲醇酯化反應(yīng)液。取少許等量的膜脂，密封80 ℃水浴1 h完成脂肪酸甲脂化。GC檢測(cè)結(jié)果顯示，用3%氯乙酰-酯化反應(yīng)液衍生化后，GC檢測(cè)色譜峰面積較小，出現(xiàn)部分齊肩峰，但5%、7%和9%(v/v)氯乙酰-酯化反應(yīng)液衍生化后，GC色譜峰形及分離效果均好。因此選擇5%(v/v)氯乙酰-甲醇酯化反應(yīng)液進(jìn)行酯化反應(yīng)。

經(jīng)以上三種方法完成脂類水解的脂肪酸甲脂化后，冷卻至室溫，先加入1 mL雙蒸水和2 mL正己烷，搖勻，吸出正己烷層，N2吹干，再加入一定量的正己烷定容后得到供試品溶液，取樣2 μL，用氣相色譜儀(GC-system，HP-6890)檢測(cè)。色譜檢測(cè)條件為進(jìn)樣口：分流/不分流進(jìn)樣器，260 ℃，分流比為50∶1；檢測(cè)器：FID，280 ℃；色譜柱：HP-INNOWAX柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；載氣：氦氣(平均限速36 cm·s-1)；柱溫:50 ℃保持1 min，25 ℃·min-1升溫至200 ℃，而后3 ℃·min-1升溫至230 ℃，再10 ℃·min-1升溫至250 ℃。

1.2.3 脂肪酸含量的計(jì)算根據(jù)色譜圖數(shù)據(jù)按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1 葉綠體膜脂肪酸酯化氣相色譜檢測(cè)

圖1顯示，三種方法酯化葉綠體膜脂肪酸后獲得的氣相色譜檢測(cè)圖基線平穩(wěn)，7種脂肪酸16∶0、16∶1、17∶0、18∶0、18∶1、18∶2和18∶3分離效果好(圖1：A，B，C)。但在相同的進(jìn)樣量下，方法二的各個(gè)峰面積比方法一和方法三的大，表明方法二對(duì)早熟禾葉綠體膜脂肪酸的酯化程度比后兩者的更高。本研究以17∶0為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算結(jié)果表明葉綠體膜脂肪酸經(jīng)三種方法酯化后所測(cè)定的6種脂肪酸含量無顯著性差異，但方法一對(duì)葉綠體膜中幾種脂肪酸含量測(cè)定的數(shù)據(jù)相對(duì)偏差較大，酯化不穩(wěn)定，表明衍生化程度不完全(表1)。

圖 1　三種方法酯化后葉綠體膜脂肪酸的氣相色譜圖A. 方法一； B. 方法二； C. 方法三　1=16∶0; 2=16∶1; 3=17∶0; 4=18∶0; 5=18∶1; 6=18∶2; 7=18∶3。下同。Fig. 1　Typical chromatogram of a fatty acid profile of chloroplast membranes from bluegrass processed by three methods　A. Method I; B. Method Ⅱ; C. Method Ⅲ. 1=16∶0; 2=16∶1; 3=17∶0; 4=18∶0; 5=18∶1; 6=18∶2; 7=18∶3. The same below.

脂肪酸類型Fattyacidtype葉綠體膜Chloroplastmembrane方法一MethodI方法二MethodⅡ方法三MethodⅢ16∶042.35±5.4041.39±3.3241.91±3.3216∶13.35±0.413.91±0.203.42±0.2118∶012.1±3.1710.87±0.5610.43±0.8318∶18.71±0.639.13±0.849.31±0.4618∶226.35±1.9026.96±2.6326.49±1.3518∶37.18±1.457.83±0.538.44±0.45

注：數(shù)據(jù)為4個(gè)重復(fù)的平均值± SD。下同。

Note：Data are presented as means ± SD，n=4. The same below.

圖 2　三種方法酯化后線粒體膜脂肪酸的氣相色譜圖Fig. 2　Typical chromatogram of a fatty acid profile of mitochondrial membranes from bluegrass processed by three methods

脂肪酸類型Fattyacidtype線粒體膜Mitochondrialmembrane方法一MethodI方法二MethodⅡ方法三MethodⅢ16∶043.53±4.8948.87±1.4542.9±2.9816∶12.03±0.541.88±0.271.98±0.1218∶010.24±1.0233.83±0.7310.89±0.1218∶19.17±0.927.52±0.839.24±0.4318∶230.92±4.117.32±0.9031.35±1.0718∶34.11±0.440.18±0.125.28±0.34

圖 3　三種方法酯化后液泡膜脂肪酸的氣相色譜圖Fig. 3　Typical chromatogram of a fatty acid profile of tonoplast membranes from bluegrass processed by three methods

2.2 線粒體膜脂肪酸酯化氣相色譜檢測(cè)結(jié)果

與葉綠體膜脂肪酸酯化不同的是，在相同進(jìn)樣量下，線粒體膜脂肪酸經(jīng)方法二酯化后的各個(gè)峰面積比方法一和方法三的小(圖2)。經(jīng)方法一對(duì)線粒體膜中幾種脂肪酸酯化后，測(cè)定的數(shù)據(jù)相對(duì)偏差較大，衍生化效果不穩(wěn)定。經(jīng)方法三酯化后分離效果好，所測(cè)定的6種脂肪酸含量差異不顯著(圖2：A，C；表2)。用方法二酯化后色譜圖表明，脂肪酸18∶1和18∶2含量很低，18∶3幾乎檢測(cè)不到(圖2：B；表2)。說明用方法二酯化早熟禾葉片線粒體膜脂肪酸時(shí)有可能18∶1，18∶2和18∶3有時(shí)不能完全衍生化。

2.3 液泡膜和質(zhì)膜脂肪酸酯化氣相色譜檢測(cè)結(jié)果

由圖3和圖4可知，用這三種方法分別對(duì)液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜的6種脂肪酸酯化，所得色譜圖中各脂肪酸峰分離效果均好。圖3結(jié)果表明，方法二酯化后的各個(gè)峰面積比方法一和方法三的大，而在質(zhì)膜氣相色譜檢測(cè)圖中，三種酯化方法下各個(gè)峰面積基本接近(圖4)。此外，測(cè)定二者本身的6種脂肪酸含量在方法之間差異不顯著(表3，表4)。

3討論與結(jié)論

脂肪酸衍生化程度的高低直接影響后續(xù)氣相色譜的分離效果與脂肪酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。本研究結(jié)果表明相同進(jìn)樣量、相同色譜條件下檢測(cè)得到的幾種脂肪酸分離效果均好，但色譜圖峰面積大小有時(shí)不同，表明不同的酯化方法對(duì)同一種膜脂肪酸的酯化程度不同。在三種酯化方法中，我們所采用的均為內(nèi)標(biāo)法(以17∶0為內(nèi)標(biāo))。內(nèi)標(biāo)法結(jié)合峰面積歸一法和外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)，在加入內(nèi)標(biāo)后，按峰面積歸一法的分析方法進(jìn)行分析，避免了由于進(jìn)樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的偶然誤差。結(jié)果表明三種酯化方法對(duì)同一種膜脂肪酸的酯化程度有差異。

圖 4　三種方法酯化后細(xì)胞質(zhì)膜脂肪酸的氣相色譜圖Fig. 4　Typical chromatogram of a fatty acid profile of plasma membranes from bluegrass that was processed by three methods

脂肪酸類型Fattyacidtype液泡膜Tonoplastmembrane方法一MethodI方法二MethodⅡ方法三MethodⅢ16∶042.37±1.4043.69±1.3242.88±2.8516∶12.82±0.112.91±0.333.02±0.1218∶012.15±0.4711.84±1.0611.93±0.4318∶15.65±0.235.1±0.145.81±0.2218∶214.07±0.9013.82±1.1113.89±0.6518∶322.03±1.1622.46±2.0323.47±1.01

酯化方法的不同，可能會(huì)影響脂肪酸定量的準(zhǔn)確度。本研究結(jié)果表明，對(duì)早熟禾葉綠體用BF3-甲醇酯化后測(cè)得的脂肪酸16∶0和18∶0的含量數(shù)據(jù)相對(duì)偏差較大，說明方法一對(duì)該膜系統(tǒng)的這部分脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定，與方法二和方法三在衍生生化程度上存在差異。對(duì)線粒體而言，通過HCl-甲醇酯化后獲得的脂肪酸18∶1、18∶2和18∶3的氣相色譜峰面積相對(duì)過小，說明方法二對(duì)某些脂肪酸衍生化程度不高，而方法一和方法三酯化后的分離效果好， 脂肪酸含量測(cè)定差異不顯著。但方法一對(duì)咖啡類囊體膜，葉綠體膜(Ramalho et al，1998)、方法二對(duì)海洋硅藻(Rousch et al，2003)脂肪酸衍生化程度高。造成這種差異可能與材料本身來源及特性有關(guān)。植物細(xì)胞生物膜中脂肪酸常以磷脂、糖脂、脂蛋白等形式存在，在外界影響下其含量配比會(huì)發(fā)生變化，如在鋁脅迫下，小麥根液泡膜磷脂和半乳糖脂含量會(huì)增加(何飛龍，2000)。脂肪酸飽和程度會(huì)影響膜脂的流動(dòng)性，在各種因素影響下，膜脂肪酸的存在形式并非固定不變，常處于液晶轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)受到紫外線B輻射時(shí)，小麥葉綠體膜類脂組分配比及脂肪酸不飽和度指數(shù)常會(huì)發(fā)生變化(楊景宏等，2000)。低溫逆境下，水稻劍葉葉綠體類囊體膜內(nèi)產(chǎn)生的大量氧自由基，引起膜脂過氧化及不飽和類脂和脂肪酸含量的變化(王靜，2006)。所以材料中脂肪酸的結(jié)合形式與存在狀態(tài)都可能會(huì)造成衍生化上的差異。就液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜而言，除了方法二酯化液泡膜脂肪酸后氣相測(cè)得的六種脂肪酸色譜峰面積相對(duì)大些外，總的來說用三種方法酯化后檢測(cè)分離效果均好。

表 4　三種方法酯化后細(xì)胞質(zhì)膜脂肪酸含量

綜合比較分析這三種酯化的衍生化方法，發(fā)現(xiàn)方法三用氯乙酰對(duì)脂肪酸酯化而后進(jìn)行氣相色譜測(cè)定更能同時(shí)適用于早熟禾的這四種膜脂肪酸含量測(cè)定。方法三是Masood et al(2005)在Griffiths et al(2010)傳統(tǒng)的酯化方法基礎(chǔ)上，將許多補(bǔ)充的反應(yīng)環(huán)節(jié)簡(jiǎn)化成的一步法，在與脂肪酸樣品反應(yīng)之前，先制備一種甲醇、乙酰氯儲(chǔ)備液，然后再與脂肪酸樣品反應(yīng)。該方法更多是用來檢測(cè)動(dòng)物或人體血紅細(xì)胞膜脂肪酸含量，在植物細(xì)胞膜脂肪酸酯化上的應(yīng)用還很少。本研究結(jié)果表明，雖然植物細(xì)胞膜系統(tǒng)與動(dòng)物血紅細(xì)胞質(zhì)膜之間組成上存在差異，但將氯乙酰與反應(yīng)儲(chǔ)備液(內(nèi)標(biāo)、甲醇)的配比優(yōu)化后，用該方法能準(zhǔn)確同時(shí)測(cè)定早熟禾四種不同細(xì)胞器膜脂肪酸含量，且效果顯著。該方法與傳統(tǒng)植物膜脂肪酸衍生化相比具有步驟少、操作簡(jiǎn)單、能同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定幾種膜系統(tǒng)脂肪酸等優(yōu)勢(shì)，這為其他相關(guān)植物的細(xì)胞膜脂肪酸測(cè)定提供借鑒。

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Comparison of three derivatization methods for the determination of fatty acid profiles in cell membranes for bluegrass (Poapratensis)

WANG Wei， HUANG Ya-Ya， WANG Na， CUI Lang-Jun*

(KeyLaboratoryofMedicinalResourcesandNaturalPharmaceuticalChemistry，MinistryofEducation，CollegeofLifeSciences，ShaanxiNormalUniversity， Xi’an 710062， China )

Abstract:The characteristic difference in bio-membrane in plant cells makes it difficult to use the same esterification method to determine the fatty acids contents，which are the important component of cell biological membrane. In order to establish a simple and reliable esterification method，in the present study，we isolated four kinds of cell membranes，chloroplasts，mitochondria，vacuoles and cytoplasm membrane respectively. Their fatty acids were extracted，esterified and determined by gas chromatography (GC) following three different methods. The results showed that both BF3-methanol and HCl-methanol esterification methods could not effectively esterify some of the fatty acids in mitochondria. Compared with the two approaches，acetyl chloride method could trans-esterify fatty acids completely and efficiently. Our data on fatty acids analysis with GC determination indicated that the third method had a high repeatability and accuracy. The current study provides valuable information for fatty acid determination on the plant cell membranes from different species.

Key words:cell membrane, fatty acid, gas chromatography, acetyl chloride

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201306017

收稿日期:2014-08-10修回日期：2014-11-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2012GS610102)[Supported by the National Planning Program Beneficial to People of Ministral of Science and Technology(2012GS610102)]。

作者簡(jiǎn)介：王維(1989-)，女，陜西興平人，碩士研究生，主要從事植物生物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)研究，(E-mail)wangwei89825@163.com。 *通訊作者：崔浪軍，碩士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)，(E-mail) ljcui@snnu.edu.cn。

中圖分類號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142(2016)06-0741-06

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