施偉梅,王　楊,張穎豪

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

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響應(yīng)面法優(yōu)化提取莢果蕨總黃酮的工藝研究

施偉梅,王楊,張穎豪

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

摘要：采用響應(yīng)面法優(yōu)化莢果蕨總黃酮的熱浸提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法考察了提取溫度、提取時間、液料比和乙醇濃度對總黃酮提取率的影響，并利用Design-Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken中心組試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對各工藝參數(shù)進(jìn)行了回歸分析。結(jié)果表明：提取溫度是對響應(yīng)值影響最大的因素，最佳提取條件為提取溫度73℃、提取時間158min、液料比27、乙醇濃度74%，在此條件下，莢果蕨總黃酮的提取率為1.06%，與理論值相比略有增加，相對誤差為0.95%，驗(yàn)證了回歸模型的有效性。響應(yīng)面法對莢果蕨總黃酮的提取條件優(yōu)化合理可行，為莢果蕨總黃酮的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：莢果蕨；總黃酮；提?。豁憫?yīng)面分析

莢果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)又名黃瓜香、廣東菜，是球子蕨科莢果蕨屬多年生草本植物[1]。莢果蕨富含蛋白質(zhì)、多糖及多種微量元素，還有黃酮、蛻皮甾酮等天然活性成分，具藥食兩用的屬性[2-4]。莢果蕨清香可口，質(zhì)地脆嫩，已被開發(fā)成罐頭制品[5]。然而，迄今為止對莢果蕨的利用主要為其嫩葉的食用，而占其大部分重量的莖和老葉卻沒有得到很好的利用，因此對莢果蕨資源的全面利用尚待進(jìn)一步的研究和開發(fā)。目前，已有文獻(xiàn)對莢果蕨中營養(yǎng)葉的黃酮成分[6]及不同采收時期的總黃酮含量[7]進(jìn)行了研究，但是，其提取過程只考慮莢果蕨中的營養(yǎng)葉，而忽視了對全草的總黃酮的提取。本研究選用乙醇回流提取[8-9]莢果蕨中的總黃酮，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為莢果蕨的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

(一)儀器與試劑

DHG-9070電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司； Lambda 35紫外可見分光光度計(jì)，美國珀金埃爾默公司；TDL-50B臺式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；AB135-S電子分析天平，上海樹信儀表有限公司；Q-250B高速萬能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司。

莢果蕨：采于四川省南充市西山，將全草浸泡于蒸餾水中，晾干，在50℃烘箱中干燥至恒重后粉碎，過60目篩，置于干燥皿中密封保存?zhèn)溆茫惶J丁對照品，中國藥品生物制品檢定所；乙醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，使用時，配制成不同體積濃度的乙醇溶液；其他試劑均為分析純。

(二)試驗(yàn)方法

1.總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[10]，在波長510nm處測定吸光度，以蘆丁濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

2.莢果蕨總黃酮的提取及檢測

莢果蕨粉末2.000g→乙醚脫脂8h→乙醇水浴提取→趁熱抽濾→定容→提取液→按1.2.1項(xiàng)的方法測吸光度Y，根據(jù)回歸方程標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算總黃酮的提取率。

式中：b為莢果蕨提取液總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/ml；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，ml；W為莢果蕨粉末的質(zhì)量，g。

(三)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)研究了提取溫度、提取時間、液料比和乙醇濃度對莢果蕨總黃酮提取率的影響。

2.響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組試驗(yàn)法對莢果蕨總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定莢果蕨總黃酮的最佳工藝條件及在此條件下的總黃酮的最大提取率。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件采用Box-Behnken Design(BBD)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以提取溫度(X1)、提取時間(X2)、液料比(X3)和乙醇濃度(X4)為自變量，莢果蕨總黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)曲面因素與水平表

3.驗(yàn)證與比較試驗(yàn)

通過軟件分析獲得最佳提取工藝條件后，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取測定，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方程計(jì)算值的差異。

二、結(jié)果與分析

(一)單因素試驗(yàn)

1.提取溫度對總黃酮提取率的影響

設(shè)定乙醇濃度為80%、液料比為20、提取時間為2h的條件下，考察了不同提取溫度對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出，隨著溫度升高，總黃酮提取率不斷升高，當(dāng)溫度到達(dá)70℃時總黃酮提取率達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，提取率反而下降。這是因?yàn)殡S著溫度升高，一方面溶劑分子和黃酮類物質(zhì)分子的平均動能增加，另一方面體系的粘度下降，二者共同作用，使得黃酮類物質(zhì)的擴(kuò)散作用增強(qiáng)，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出；當(dāng)超出70℃之后，溫度過高，乙醇汽化嚴(yán)重，同時溫度過高，黃酮類物質(zhì)會被氧化而遭到破壞[11]，從而導(dǎo)致總黃酮提取率的下降。因此，最佳提取溫度選擇為70℃。

提取溫度℃提取率/%1.11.00.90.80.70.60.50.4405060708090100

圖1提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.提取時間對總黃酮提取率的影響

設(shè)定提取溫度為70℃、乙醇濃度為80%、液料比為20的條件下，考察了不同提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，莢果蕨總黃酮提取率隨著提取時間的增加，呈先增加后下降的趨勢，當(dāng)提取時間為150min時，提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)樘崛r間過長時，溶出的雜質(zhì)增多與黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生競爭，且黃酮類物質(zhì)在較長時間的高溫下容易被氧化而遭到降解[12]，從而導(dǎo)致提取率的不升反降。因此，最佳提取時間選定為150min。

提取溫度℃提取率/%1.11.00.90.80.70.60.50.4405060708090100

圖2提取時間對總黃酮提取率的影響

3.液料比對總黃酮提取率的影響

設(shè)定提取溫度為70℃、提取時間為150min、乙醇濃度為80%的條件下，考察了不同液料比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，隨著液料比的增加，總黃酮的溶出量逐漸增加，當(dāng)液料比為25時黃酮類物質(zhì)提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大液料比，提取率反而下降，這是因?yàn)檫^大的液料比，會增加濃縮成本，造成黃酮類物質(zhì)的損失以及溶劑和資源的浪費(fèi)[13]，因此，最佳液料比選擇為25。

1.051.000.950.900.850.8010152025303540提取率/%液料比/mL?g-1

圖3液料比對總黃酮提取率的影響

4.乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

設(shè)定提取溫度為70℃、提取時間為150min、液料比為25的條件下，考察了不同乙醇濃度對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4可看出，隨著乙醇濃度增加，總黃酮的提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為70%時總黃酮提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)橐掖紳舛冗^大時，親脂性強(qiáng)的物質(zhì)溶出隨之增加[14]，干擾因素也隨之加大，因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定最佳乙醇濃度為70%。

1.051.000.950.900.850.800.750.700.650.60405060708090100乙醇濃度/%提取率/%

圖4乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

(二)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

1.響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取溫度(X1)、提取時間(X2)、液料比(X3)和乙醇濃度(X4)四個因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表2，響應(yīng)面分析方案見表3。

表2　響應(yīng)曲面試驗(yàn)以及響應(yīng)值

表3　響應(yīng)曲面方差分析表

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表4　Box-Behnken 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從方差分析表3可知，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得模型的F值為13.57，P值為<0.0001，表示該模型顯著。由模型擬合得到的回歸方程為：Y=+1.031+0.053 6X1+0.022 5X2+0.016 9X3+0.033 7X4+0.024 0X1X2+0.028 5X1X3-0.017 2X1X4+0.023 0X2X3-5.000×10-3X2X4-2.250 0×10-3X3X4- 0.119 5X12-0.076 8X22-0.030 7X32-0.035 3X42，其方程的R2=0.931 4，表明該回歸方程擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。方程中P<0.05 的項(xiàng)代表顯著項(xiàng)， 包括X1-提取溫度、X2-提取時間、X4-乙醇濃度及二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42。由此可知，各影響因素與響應(yīng)值的關(guān)系并不是簡單的線性關(guān)系。方程的失擬度F值為4.06，P=0.094 4>0.05，表示失擬度不顯著，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，調(diào)整系數(shù)為0.8627，表明有86.27%的數(shù)值可以用該模型來解釋。綜合上述結(jié)果可知，此回歸方程可以用于對莢果蕨總黃酮的提取率進(jìn)行預(yù)測分析。由此得到莢果蕨總黃酮提取率最大預(yù)測值為1.05%，最優(yōu)提取工藝為：提取溫度72.81℃、提取時間157.51min、液料比為27.43，乙醇濃度73.75%。

2.試驗(yàn)因素交互作用對響應(yīng)值影響的3D分析

各因素及其相互作用對響應(yīng)值的影響可以通過相應(yīng)曲面3D圖直觀反映出來，具體結(jié)果見圖5。由圖5可知，并不是所有因素對莢果蕨總黃酮的提取都有顯著的影響，提取溫度的影響最為顯著，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率隨之增大，隨后提取溫度繼續(xù)增大，總黃酮提取率則明顯下降，表現(xiàn)為曲面較陡; 提取時間的影響次之，表現(xiàn)為曲面較平緩，響應(yīng)值變化較??；乙醇濃度和液料比影響最小，曲面基本表現(xiàn)為一平直線。各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響大小主次因素順序?yàn)樘崛囟?提取時間>乙醇濃度>液料比。

提取率1.11.00.90.80.71801261201321381741681621561441501.11.00.90.80.7提取率6065707580提取時間/min提取溫度℃807570656075706560提取溫度℃乙醇濃度/%乙醇濃度/%提取時間/min提取率1.11.00.90.80.78075706560180126120132138174168162156144150提取率1.11.00.90.80.78075706560乙醇濃度/%302826222420液料比/mL?g-16065707580提取溫度℃302826242220提取率1.11.00.90.80.7提取率1.11.00.90.80.7302826242220提取時間/min180126120132138174168162156144150液料比/mL?g-1液料比/mL?g-1ABCDEF

圖5各因素交互作用對總黃酮得率Y影響的響應(yīng)曲面(3D)

A.提取溫度和提取時間對黃酮提取率的響應(yīng)面圖；B.提取溫度和乙醇濃度對黃酮提取率的響應(yīng)面圖；C.提取時間和乙醇濃度對黃酮提取率的響應(yīng)面圖；D.液料比和乙醇濃度對黃酮提取率的響應(yīng)面圖；E.提取時間和液料比對黃酮提取率的響應(yīng)面圖；F.液料比和提取溫度對黃酮提取率的響應(yīng)面圖

3.最佳提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，采用上述最?yōu)提取條件進(jìn)行莢果蕨總黃酮的提取驗(yàn)證試驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：提取溫度73℃、提取時間158min、液料比為27，乙醇濃度74% ，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際提取率為1.06%。該實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好，結(jié)果相對于預(yù)測值誤差為1.03%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)可靠，得到的總黃酮提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價值。

三、結(jié)論

利用乙醇為溶劑提取莢果蕨總黃酮，并通過響應(yīng)面分析得到了最佳提取條件，回歸模型預(yù)測的莢果蕨總黃酮提取的最佳工藝條件為：提取溫度73℃、提取時間158min、液料比為27，乙醇濃度74%，實(shí)際提取率為1.06%，相對于預(yù)測值相對誤差為0.95%。響應(yīng)面法對莢果蕨總黃酮的提取條件優(yōu)化合理可行，為提高莢果蕨總黃酮的提取率提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯夏侯國論)

收稿日期：2016-05-16

基金項(xiàng)目：贛南醫(yī)學(xué)院科研課題(YB201429)

作者簡介：施偉梅，女，贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院講師。

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-0408(2016)02-0011-06

Optimization of Extracting Flavonoids from Matteuccia Struthiopteris(L.)Todaro by Response Surface Methodology

Shi Wei-mei, Wang Yang, Zhang Ying-hao

(College of Pharmacy, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China)

Abstract：Response surface methodology was employed to determine optimum conditions for extraction of total flavonoids from Matteuccia struthiopteris(L.) Todaro. The temperature on extraction, extraction time, liquid-solid ratio and the concentration of ethanol were chosen to conduct the single factor experiments. And regression analysis on various process parameters was carried out according to the Design-Expert 8.0.6 software and the Box-Behnken center combination experimental principles. The results showed that the largest effect on response was the extraction temperature, and the optimum extraction condition was: extraction temperature 73℃, extraction time 158min, liquid-solid ratio 27 and the concentration of ethanol 74%, respectively. Under these conditions, the actual value was 1.06%, which had a slight increase as compared to the predicted value, and the relative error was 0.95%, indicating that the regression model fitted well with the experimental data. This study could provide a theoretical direction for extracting flavonoids from Matteuccia struthiopteris(L.) Todaro on a large scale.

Key words：Matteuccia struthiopteris(L.) Todaro; flavonoids; extraction; response surface methodology