廖映輝++黃彩微++史佑海+丁瓊

摘要：以生長于海南島霸王嶺的毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense）為材料，用分子檢測技術(shù)對其根部真菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測序，以及序列分析，共檢測出28種真菌，其中子囊菌門（Ascomycota）19種，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）8種，接合菌門（Zygomycota）1種，其中物種最豐富的真菌類群為子囊菌門錘舌菌綱的柔膜菌目。采用Bootstrap法估算真菌的物種豐富度，表明霸王嶺地區(qū)毛棉杜鵑的根系真菌至少有37種，并且物種累積曲線顯示：隨著根系真菌的宿主植物個體數(shù)增加，Shannon-weiner多樣性指數(shù)和物種豐富度增大，且物種數(shù)增加的潛力仍然較大。研究結(jié)果表明，毛棉杜鵑根部真菌種類極豐富，有必要全面開展杜鵑花屬植物根部真菌分子檢測，并從中篩選出對杜鵑花屬植物生長有良好效應(yīng)的真菌。全面揭示杜鵑花屬植物的根部共生真菌多樣性必將有助于杜鵑花屬植物的保育與引種栽培。

關(guān)鍵詞：杜鵑花屬；根系真菌；菌根；多樣性

中圖分類號： S685.210.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0432-06

收稿日期：2016-01-26

基金項(xiàng)目：海南省重大科技項(xiàng)目（編號：ZDZX2013012）。

作者簡介：廖映輝（1992—），女，福建龍巖人，碩士研究生，主要從事杜鵑花菌根真菌的多樣性研究。E-mail：328949021@qq.com。

通信作者：丁瓊，博士，講師，主要從事菌根研究。E-mail：dingqiong1@gmail.com。杜鵑花科（Ericaceae）植物根系在自然生境中與真菌形成的互利共生體，稱之為杜鵑花菌根（Ericoid mycorrhiza，ERM）[1]。野外條件下，杜鵑花類植物的菌根真菌能有效地加強(qiáng)其對土壤中可溶性無機(jī)態(tài)N、P或不可溶性N、P復(fù)合物的吸收利用[1-2]。北美地區(qū)的園藝生產(chǎn)中，常用杜鵑花類菌根真菌接種藍(lán)莓，以減少化肥的施用[3]。杜鵑花屬（Rhododendron）是杜鵑花科的物種較為豐富的屬，古詩有云“花中此物為西施，芙蓉芍藥皆嫫母”，具有極高的觀賞價值和園林應(yīng)用價值，在市場上具有極大的產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。我國是杜鵑花屬植物最為重要的起源地和分布中心，共有約530種，占世界總數(shù)的59%[4]。相對于其他杜鵑花科植物歐石楠屬（Calluna）和越橘屬（Vaccinium）而言，杜鵑花屬植物根系真菌的研究少之又少，自2000年來主要涉及宿主如R. fortunei、R. dauricum、R. decorum、R. obtusum var. kaempferi、R. argyrophyllum、R. floribundum、R. lochiae、R. pulchrum、R. maximum、R. rubropilosum等，且能形成杜鵑花類菌根真菌的大多數(shù)為子囊菌門，包括柔膜菌目真菌及樹粉孢屬真菌，少部分為擔(dān)子菌門或其他類真菌[5-23]。

海南島是我國唯一地處熱帶的島嶼，豐富的光照和溫度資源、復(fù)雜的地形和地貌孕育了多樣性的熱帶特色野生花卉資源，共分布9種1變種杜鵑花[24]。毛棉杜鵑（R. moulmainense Hook.f.）亦是其中一種，其分布范圍還遍及我國江西、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州和云南等地，多數(shù)生長在海拔700～1 500 m的山頂或山地林中。毛棉杜鵑花冠通常為淡紫色、粉紅色或者淡紅白色，狹漏斗形。花期長，花朵繁盛，顏色艷麗，還是杜鵑屬植物中少有的耐熱性種質(zhì)資源，具有非常高的園林應(yīng)用潛力。當(dāng)前野生杜鵑引種、栽培十分困難是其園林應(yīng)用的瓶頸。采用真菌分子檢測技術(shù)，揭示毛棉杜鵑在自然環(huán)境中的根系真菌多樣性，有助于今后篩選出能促進(jìn)毛棉杜鵑生長的菌根真菌，可以有效地指導(dǎo)其引種、栽培及園林應(yīng)用。本研究結(jié)果不僅對毛棉杜鵑種群的保育具有重要意義，而且對我國熱帶地方特色花卉資源利用及花卉產(chǎn)業(yè)的資源優(yōu)勢發(fā)揮有重要意義。

1材料與方法

1.1樣品采集地點(diǎn)

樣品采集于海南霸王嶺國家級自然保護(hù)區(qū)（18.87°～1920° N，108.88°～109.33° E），地處海南島西南部昌江縣境內(nèi)。保護(hù)區(qū)的氣候?qū)贌釒Ъ撅L(fēng)氣候，年平均溫度23.6 ℃，年均降水量1 500～2 000 mm[25]。海拔高度在100～1 700 m范圍，保護(hù)區(qū)內(nèi)的土壤以磚紅壤為主要類型，隨著海拔高度的增加不斷過渡為山地紅壤[26]。低地雨林和山地雨林是該地區(qū)分布最廣的2個主要植被類型，低地雨林是以青梅（Vatica mangachapoi）、荔枝（Litchi chinensis）等為優(yōu)勢種，山地雨林以雞毛松（Podocarpus imbricatus）、陸均松（Dacrydium pierrei）等為優(yōu)勢種[27]。

1.2樣品采集

采集時，選取成年的植株，沿主干找到最細(xì)的發(fā)根部分，在不同位置上用枝剪小心剪下。將取到的發(fā)根同附著的土塊在水中浸泡約1 h，用水小心沖洗干凈后置于裝有75%乙醇的塑料管中，標(biāo)號，-80 ℃冰箱中保存。共采集8株毛棉杜鵑植株。

1.3真菌分子檢測

1.3.1DNA提取杜鵑花屬植物根系真菌DNA的提取采用改良的CTAB法[28]。在提取DNA之前，對根系樣品進(jìn)行預(yù)處理。每份樣品提取12份DNA，每份DNA樣品為隨機(jī)挑選的50份約1.5 cm長的毛根，并置于1.5 mL的離心管中，加入20 μL CTAB提取緩沖液，放置于-80 ℃冰箱冰凍1夜后在冰浴中使用電鉆研磨成沫。

1.3.2ITS擴(kuò)增采用普通的PCR方法擴(kuò)增真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，擴(kuò)增引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），引物序列由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總共25 μL，分別含有：1 μL 模板DNA，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 μL 10×PCR緩沖液（TaKaRa，Otsu，Japan），ITS1F與ITS4引物各0.2 μmol/L，0.8 μmol/L牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），1.5 U Taq DNA聚合酶（TaKaRa，Otsu，Japan）。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。最后將ITS-PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀觀察、拍照。

1.3.3PCR產(chǎn)物克隆及測序?qū)⑼恢仓甑?2份PCR產(chǎn)物混合后電泳、切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物作為外源DNA，克隆到pMD19-T Vector （TaKaRa，Otsu，Japan），在16 ℃ 下連接過夜，用E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，Otsu，Japan）進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從每株宿主植物的根系真菌克隆文庫中隨機(jī)挑選30個呈白斑的克隆，用引物ITS1F和ITS4擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。電泳檢測呈陽性PCR產(chǎn)物測序委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3.4生物信息學(xué)分析在Bioedit軟件中對真菌的 ITS1-5.8S-ITS2 全序列進(jìn)行編輯和比對。ITS序列一致性（identity）≥97%的真菌被視為同一個分類單元（operational taxonomical unit，OTU）。每個OTU的參考序列與NCBI（GenBank）數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，確定與試驗(yàn)克隆親緣關(guān)系最近的種屬。將ITS序列通過ClustalX2進(jìn)行序列間的匹配排序（必要時需要手動調(diào)整）。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用MEGA 5。將本試驗(yàn)獲得的ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，獲得相應(yīng)的序列號為KU550104-KU550131。

1.4數(shù)據(jù)分析

用軟件Estimate S 9中提供的Bootstrap方法估計研究區(qū)物種豐富度，并計算Shannon-Weiner多樣性指數(shù)，并用物種累積曲線評估抽樣到的真菌群落的物種是否能較全面地反映當(dāng)?shù)匚锓N庫。

2結(jié)果與分析

2.1毛棉杜鵑根系真菌多樣性

對8株毛棉杜鵑的根系真菌進(jìn)行檢測，獲得真菌ITS有效序列84條，并劃分為28個OTUs（以后統(tǒng)稱為物種）（表1）。子囊菌門（Ascomycota）19種，其中包括錘舌菌綱（Leotiomycetes）13種、糞殼菌綱（Sordariomycetes）2種、散囊菌綱（Eurotiomycetes）3種和未能鑒定到綱水平的盤菌亞門（Pezizomycotina）1種；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）8種，均為傘菌綱（Agaricomycetes）的物種；除此以外，還有1種為接合菌門（Zygomycota）的物種。與此同時，共有26種真菌鑒定到了目的水平，分別為子囊菌門的柔膜菌目（Helotiales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、Chaetosphaeriales、肉座菌目（Hypocreales）、斑痣盤菌目（Rhytismatales）和樹粉孢屬（Oidiodendron）；擔(dān)子菌門的傘菌目（Agaricales）、紅菇目（Russulales）、蠟殼耳目（Sebacinales）、革菌目（Thelephorales）、Trechisporales及接合菌門的被孢霉目（Mortierellales）（圖1）。在目水平上，物種豐富度最高的真菌類群為錘舌菌綱的柔膜菌目（11種）（圖2）。

通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對發(fā)現(xiàn)，有11個OTUs與來自草本或木本植物的根系真菌同源性達(dá)97%以上（表1）。其中7個OTUs（OTU 8-11；OTU 17-18；OTU 22）屬于柔膜菌目，OTU 4與Chaetosphaeria sp.（AY781219）具有較高的相似性，OTU 5和OTU 23分別與Cladophialophora sp.（AB986333）、Rhytismataceae sp. （JQ272405）同源性高達(dá)99%，而OTU 20與Oidiodendron citrinum（NR_111033）同源性達(dá)95%，因此被鑒定為樹粉孢屬真菌。在這11個OTU中，9個OTUs都曾在杜鵑花科植物根系中檢測到，1個OTU（OTU 5）在蘭科植物Cypripedium的根系中出現(xiàn)，另一個（OTU 9）則在鐵杉屬根系中檢測到。在這9個OTU中，除OTU 20和OTU 11僅在杜鵑花科植物根系中出現(xiàn)外，其余OTU（OTU 4、OTU 8、OTU 10、OTU 17、OTU 18、OTU 22、OTU 23）不僅在杜鵑花科植物根系（Rhododendron、Eucalyptus、Woollsia、Enkianthus、Vaccinium、Pyrola、Epacris、Calluna）中檢測到，還在少數(shù)的蘭科植物（Hoffmannseggella；Lecanorchis）和外生菌根根段（Picea；Deschampsia；Lithocarpus；Pinus；Fagus）中檢測到。

2.3根系真菌物種豐富度估計及物種累積曲線

用Bootstrap算法估計的海南霸王嶺毛棉杜鵑根系真菌物種數(shù)37種，高于實(shí)際觀察到的物種數(shù)（28種）。隨著根系真菌的宿主植物個體數(shù)增加，物種豐富度不斷增大，且從物種累積曲線來看檢測到的真菌物種數(shù)增加的潛力仍然較大，然而Shannon-Weiner多樣性指數(shù)卻趨于平緩（圖3）。

3討論與結(jié)論

本次從海南霸王嶺毛棉杜鵑根系中共檢測到28種真菌，通過序列比對和真菌ITS序列譜系樹分析發(fā)現(xiàn)子囊菌門的真菌種類豐富約占68%（19種），其中又以柔膜菌目真菌占的比例最大，共有11種，其中有7種與來自杜鵑花科植物或少數(shù)其他草本或木本植物根系真菌同源性達(dá)97%以上。子囊

菌門柔膜菌目的真菌是一類多樣且典型的杜鵑花菌根真菌，國內(nèi)外大多學(xué)者在對杜鵑花菌根真菌研究中也都發(fā)現(xiàn)了該類真菌，在多種杜鵑花根系中都檢測到[5，9-13，18，22，29]。在這7種柔膜菌目真菌中，OTU 9僅與來自Tsuga heterophylla的根系真菌（FJ152534）同源性達(dá)98%，OTU 11僅與Epacris microphylla的根系真菌同源性達(dá)98%[30]，其余5個OTU都曾在多種杜鵑花科植物根系及少數(shù)外生菌根根段中檢測到。OTU 7曾被報道與中國的Rhododendron fortunei和Vaccinium vitis-idaea（KJ817304），日本的Enkianthus campanulatus，美國的Pyrola和澳大利亞的Epacris microphylla等多種杜鵑花科植物根系共生[13，30-32]，且曾在美國的Picea根系中出現(xiàn)[33]，OTU10則在澳大利亞的Rhododendron lochiae，美國的Rhododendron maximum，德國的Calluna vulgaris（FM172790）和瑞士的Picea abies均有報道[5，9，34]。OTU 17和OTU 18都為粒毛盤菌（Lachnum）的物種，都與來自多種不同草本或木本植物的根系真菌同源性達(dá)97%以上。OTU 17曾在杜鵑花科植物Vacciniumuliginosu（KJ817288）、Pyrola、Calluna vulgaris和Enkianthus cernuus，禾本科植物Deschampsia flexuosa及殼斗科植物

Lithocarpus densiflorus的根系中出現(xiàn)[31-32，35-36]。OTU 18則曾在多種杜鵑花屬植物Rhododendron lochiae、Rhododendron fortunei、Rhododendron dauricum（KJ817276）和其他多種杜鵑花科植物Pyrola、Epacris microphylla、Erica glumiflora、Enkianthus perulatus、Vaccinium vitis-idaea（AJ430215）中檢測到[5，13，30-31，37]。OTU 22與Phialocephala fortinii（NR_103577）同源性高達(dá)99%，被鑒定為Phialocephala fortinii。Phialocephala fortinii是北半球地區(qū)侵染植物根系的典型的暗色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes，DSE）復(fù)合體中常見的一種真菌。關(guān)于這種內(nèi)生真菌或菌根真菌的習(xí)性在以往的研究中爭議較大，有學(xué)者認(rèn)為Phialocephala fortinii是菌根性的真菌[38-39]，它曾在Rhododendron decorum、Rhododendron maximum、Rhododendron fortunei、Calluna vulgaris、Pyrola media、Pyrola asarifolia、Vaccinium macrocarpon出現(xiàn)[9-10，13，40-42]。而周詩涵等在臺灣地區(qū)的紅毛杜鵑根系中也檢測到Phialocephala，菌根形態(tài)鑒定與rDNA序列分析，以及回接試驗(yàn)均證實(shí)Phialocephala能與杜鵑花類植物形成杜鵑花菌根[23]。

除此之外，還有4個OTU（OTU4、OTU5、OTU20、OTU23）

與NCBI中不同植物的根系真菌同源性達(dá)97%以上。OTU5與美國的Cypripedium acaule的根系真菌同源性達(dá)98%[43]。OTU4和OTU23不僅在杜鵑花科植物中檢測到，還在其他植物根系中也有出現(xiàn)。前者曾報道在Hoffmannseggella caulescens、Rhododendron lochiae、Eucalyptus、Woollsia pungens根系出現(xiàn)[5，44-46]，后者則在Rhododendron maximum和Fagus（FN619991）根系中檢測到[9]。OTU20與Oidiodendron citrinum（NR_111033）同源性達(dá)95%，因此鑒定為樹粉孢屬真菌。樹粉孢屬是常見的杜鵑花菌根真菌，特別是在北半球的杜鵑花根系中是非常常見的，本研究中樹粉孢屬與日本的Enkianthus campanulatus（99%）、中國四川及云南的Rhododendron decorum（98%）、南非的Erica caffra（98%）及澳大利亞熱帶森林的Epacris pulchella的根系共生真菌同源性高達(dá)98%或99%[10，32，37，47]。然而，在本研究中并沒有出現(xiàn)分布最廣且在杜鵑花類菌根真菌中研究最多的Oidiodendron maius。從這些同源性達(dá)97%的根系真菌的宿主植物分析中推測杜鵑花類菌根真菌類型在目的水平上總體相似，但不同的種之間可能受到其寄主植物的影響。

擔(dān)子菌門的真菌物種數(shù)在本研究中僅占29%，為傘菌綱中傘菌目、紅菇目、蠟殼耳目、革菌目、Trechisporales。在早期，蠟殼耳目的真菌被認(rèn)為是腐生真菌，后續(xù)的研究表明Sebacinales 真菌可以劃分為Clad A與Clad B兩大支系[48]。Clad A被報道既能與蘭科形成內(nèi)生型菌根，又能與殼斗科、松科植物形成外生菌根[49]，Clad B與杜鵑花科植物，如杜鵑花屬、越橘屬，帚石楠屬等宿主共生。紅菇目和革菌目是典型的外生菌根真菌，在美國大煙霧山國家公園Rhododendron maximum及澳大利亞Rhododendron hirsutum根系中也曾分離到紅菇[7-9]，中國云南的Rhododendron decorum根系中曾有革菌目的出現(xiàn)[10]。

群落物種豐富度的研究表明，受抽樣樣本大小的限制，在一個地區(qū)觀察到的物種往往只能代表當(dāng)?shù)匚锓N庫中的一部分，然而，可以采用物種豐富度估計的方法來最大限度地估計當(dāng)?shù)匚锓N數(shù)。本研究用Bootstrap估計的杜鵑花根系真菌物種數(shù)37種，高于實(shí)際觀察到的物種數(shù)（28種）。物種累積曲線表明，隨著杜鵑花宿主植物個體數(shù)增加，檢測到的根系真菌物種數(shù)增加的潛力仍然較大，因此，全面揭示杜鵑花菌根真菌資源的多樣性是杜鵑花菌肥開發(fā)利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

另外，本試驗(yàn)研究檢測到的真菌有93%的物種只能鑒定到目，能鑒定到科、屬、種水平的真菌僅占少數(shù)。主要是因?yàn)镹CBI等公共數(shù)據(jù)庫中暫時缺少與這些真菌高同源性，并且已知分類地位的代表性序列。隨著NCBI數(shù)據(jù)庫中分類信息準(zhǔn)確的真菌DNA條形碼序列累積，本研究檢測到的真菌序列將會獲得更精細(xì)的分類信息。

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廖映輝 黃彩微 史佑海 丁瓊

摘要：以生長于海南島霸王嶺的毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense）為材料，用分子檢測技術(shù)對其根部真菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測序，以及序列分析，共檢測出28種真菌，其中子囊菌門（Ascomycota）19種，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）8種，接合菌門（Zygomycota）1種，其中物種最豐富的真菌類群為子囊菌門錘舌菌綱的柔膜菌目。采用Bootstrap法估算真菌的物種豐富度，表明霸王嶺地區(qū)毛棉杜鵑的根系真菌至少有37種，并且物種累積曲線顯示：隨著根系真菌的宿主植物個體數(shù)增加，Shannon-weiner多樣性指數(shù)和物種豐富度增大，且物種數(shù)增加的潛力仍然較大。研究結(jié)果表明，毛棉杜鵑根部真菌種類極豐富，有必要全面開展杜鵑花屬植物根部真菌分子檢測，并從中篩選出對杜鵑花屬植物生長有良好效應(yīng)的真菌。全面揭示杜鵑花屬植物的根部共生真菌多樣性必將有助于杜鵑花屬植物的保育與引種栽培。

關(guān)鍵詞：杜鵑花屬；根系真菌；菌根；多樣性

中圖分類號： S685.210.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0432-06

收稿日期：2016-01-26

基金項(xiàng)目：海南省重大科技項(xiàng)目（編號：ZDZX2013012）。

作者簡介：廖映輝（1992—），女，福建龍巖人，碩士研究生，主要從事杜鵑花菌根真菌的多樣性研究。E-mail：328949021@qq.com。

通信作者：丁瓊，博士，講師，主要從事菌根研究。E-mail：dingqiong1@gmail.com。杜鵑花科（Ericaceae）植物根系在自然生境中與真菌形成的互利共生體，稱之為杜鵑花菌根（Ericoid mycorrhiza，ERM）[1]。野外條件下，杜鵑花類植物的菌根真菌能有效地加強(qiáng)其對土壤中可溶性無機(jī)態(tài)N、P或不可溶性N、P復(fù)合物的吸收利用[1-2]。北美地區(qū)的園藝生產(chǎn)中，常用杜鵑花類菌根真菌接種藍(lán)莓，以減少化肥的施用[3]。杜鵑花屬（Rhododendron）是杜鵑花科的物種較為豐富的屬，古詩有云“花中此物為西施，芙蓉芍藥皆嫫母”，具有極高的觀賞價值和園林應(yīng)用價值，在市場上具有極大的產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。我國是杜鵑花屬植物最為重要的起源地和分布中心，共有約530種，占世界總數(shù)的59%[4]。相對于其他杜鵑花科植物歐石楠屬（Calluna）和越橘屬（Vaccinium）而言，杜鵑花屬植物根系真菌的研究少之又少，自2000年來主要涉及宿主如R. fortunei、R. dauricum、R. decorum、R. obtusum var. kaempferi、R. argyrophyllum、R. floribundum、R. lochiae、R. pulchrum、R. maximum、R. rubropilosum等，且能形成杜鵑花類菌根真菌的大多數(shù)為子囊菌門，包括柔膜菌目真菌及樹粉孢屬真菌，少部分為擔(dān)子菌門或其他類真菌[5-23]。

海南島是我國唯一地處熱帶的島嶼，豐富的光照和溫度資源、復(fù)雜的地形和地貌孕育了多樣性的熱帶特色野生花卉資源，共分布9種1變種杜鵑花[24]。毛棉杜鵑（R. moulmainense Hook.f.）亦是其中一種，其分布范圍還遍及我國江西、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州和云南等地，多數(shù)生長在海拔700～1 500 m的山頂或山地林中。毛棉杜鵑花冠通常為淡紫色、粉紅色或者淡紅白色，狹漏斗形。花期長，花朵繁盛，顏色艷麗，還是杜鵑屬植物中少有的耐熱性種質(zhì)資源，具有非常高的園林應(yīng)用潛力。當(dāng)前野生杜鵑引種、栽培十分困難是其園林應(yīng)用的瓶頸。采用真菌分子檢測技術(shù)，揭示毛棉杜鵑在自然環(huán)境中的根系真菌多樣性，有助于今后篩選出能促進(jìn)毛棉杜鵑生長的菌根真菌，可以有效地指導(dǎo)其引種、栽培及園林應(yīng)用。本研究結(jié)果不僅對毛棉杜鵑種群的保育具有重要意義，而且對我國熱帶地方特色花卉資源利用及花卉產(chǎn)業(yè)的資源優(yōu)勢發(fā)揮有重要意義。

1材料與方法

1.1樣品采集地點(diǎn)

樣品采集于海南霸王嶺國家級自然保護(hù)區(qū)（18.87°～1920° N，108.88°～109.33° E），地處海南島西南部昌江縣境內(nèi)。保護(hù)區(qū)的氣候?qū)贌釒Ъ撅L(fēng)氣候，年平均溫度23.6 ℃，年均降水量1 500～2 000 mm[25]。海拔高度在100～1 700 m范圍，保護(hù)區(qū)內(nèi)的土壤以磚紅壤為主要類型，隨著海拔高度的增加不斷過渡為山地紅壤[26]。低地雨林和山地雨林是該地區(qū)分布最廣的2個主要植被類型，低地雨林是以青梅（Vatica mangachapoi）、荔枝（Litchi chinensis）等為優(yōu)勢種，山地雨林以雞毛松（Podocarpus imbricatus）、陸均松（Dacrydium pierrei）等為優(yōu)勢種[27]。

1.2樣品采集

采集時，選取成年的植株，沿主干找到最細(xì)的發(fā)根部分，在不同位置上用枝剪小心剪下。將取到的發(fā)根同附著的土塊在水中浸泡約1 h，用水小心沖洗干凈后置于裝有75%乙醇的塑料管中，標(biāo)號，-80 ℃冰箱中保存。共采集8株毛棉杜鵑植株。

1.3真菌分子檢測

1.3.1DNA提取杜鵑花屬植物根系真菌DNA的提取采用改良的CTAB法[28]。在提取DNA之前，對根系樣品進(jìn)行預(yù)處理。每份樣品提取12份DNA，每份DNA樣品為隨機(jī)挑選的50份約1.5 cm長的毛根，并置于1.5 mL的離心管中，加入20 μL CTAB提取緩沖液，放置于-80 ℃冰箱冰凍1夜后在冰浴中使用電鉆研磨成沫。

1.3.2ITS擴(kuò)增采用普通的PCR方法擴(kuò)增真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，擴(kuò)增引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），引物序列由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總共25 μL，分別含有：1 μL 模板DNA，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 μL 10×PCR緩沖液（TaKaRa，Otsu，Japan），ITS1F與ITS4引物各0.2 μmol/L，0.8 μmol/L牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），1.5 U Taq DNA聚合酶（TaKaRa，Otsu，Japan）。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。最后將ITS-PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀觀察、拍照。

1.3.3PCR產(chǎn)物克隆及測序?qū)⑼恢仓甑?2份PCR產(chǎn)物混合后電泳、切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物作為外源DNA，克隆到pMD19-T Vector （TaKaRa，Otsu，Japan），在16 ℃ 下連接過夜，用E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，Otsu，Japan）進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從每株宿主植物的根系真菌克隆文庫中隨機(jī)挑選30個呈白斑的克隆，用引物ITS1F和ITS4擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。電泳檢測呈陽性PCR產(chǎn)物測序委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3.4生物信息學(xué)分析在Bioedit軟件中對真菌的 ITS1-5.8S-ITS2 全序列進(jìn)行編輯和比對。ITS序列一致性（identity）≥97%的真菌被視為同一個分類單元（operational taxonomical unit，OTU）。每個OTU的參考序列與NCBI（GenBank）數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，確定與試驗(yàn)克隆親緣關(guān)系最近的種屬。將ITS序列通過ClustalX2進(jìn)行序列間的匹配排序（必要時需要手動調(diào)整）。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用MEGA 5。將本試驗(yàn)獲得的ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，獲得相應(yīng)的序列號為KU550104-KU550131。

1.4數(shù)據(jù)分析

用軟件Estimate S 9中提供的Bootstrap方法估計研究區(qū)物種豐富度，并計算Shannon-Weiner多樣性指數(shù)，并用物種累積曲線評估抽樣到的真菌群落的物種是否能較全面地反映當(dāng)?shù)匚锓N庫。

2結(jié)果與分析

2.1毛棉杜鵑根系真菌多樣性

對8株毛棉杜鵑的根系真菌進(jìn)行檢測，獲得真菌ITS有效序列84條，并劃分為28個OTUs（以后統(tǒng)稱為物種）（表1）。子囊菌門（Ascomycota）19種，其中包括錘舌菌綱（Leotiomycetes）13種、糞殼菌綱（Sordariomycetes）2種、散囊菌綱（Eurotiomycetes）3種和未能鑒定到綱水平的盤菌亞門（Pezizomycotina）1種；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）8種，均為傘菌綱（Agaricomycetes）的物種；除此以外，還有1種為接合菌門（Zygomycota）的物種。與此同時，共有26種真菌鑒定到了目的水平，分別為子囊菌門的柔膜菌目（Helotiales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、Chaetosphaeriales、肉座菌目（Hypocreales）、斑痣盤菌目（Rhytismatales）和樹粉孢屬（Oidiodendron）；擔(dān)子菌門的傘菌目（Agaricales）、紅菇目（Russulales）、蠟殼耳目（Sebacinales）、革菌目（Thelephorales）、Trechisporales及接合菌門的被孢霉目（Mortierellales）（圖1）。在目水平上，物種豐富度最高的真菌類群為錘舌菌綱的柔膜菌目（11種）（圖2）。

通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對發(fā)現(xiàn)，有11個OTUs與來自草本或木本植物的根系真菌同源性達(dá)97%以上（表1）。其中7個OTUs（OTU 8-11；OTU 17-18；OTU 22）屬于柔膜菌目，OTU 4與Chaetosphaeria sp.（AY781219）具有較高的相似性，OTU 5和OTU 23分別與Cladophialophora sp.（AB986333）、Rhytismataceae sp. （JQ272405）同源性高達(dá)99%，而OTU 20與Oidiodendron citrinum（NR_111033）同源性達(dá)95%，因此被鑒定為樹粉孢屬真菌。在這11個OTU中，9個OTUs都曾在杜鵑花科植物根系中檢測到，1個OTU（OTU 5）在蘭科植物Cypripedium的根系中出現(xiàn)，另一個（OTU 9）則在鐵杉屬根系中檢測到。在這9個OTU中，除OTU 20和OTU 11僅在杜鵑花科植物根系中出現(xiàn)外，其余OTU（OTU 4、OTU 8、OTU 10、OTU 17、OTU 18、OTU 22、OTU 23）不僅在杜鵑花科植物根系（Rhododendron、Eucalyptus、Woollsia、Enkianthus、Vaccinium、Pyrola、Epacris、Calluna）中檢測到，還在少數(shù)的蘭科植物（Hoffmannseggella；Lecanorchis）和外生菌根根段（Picea；Deschampsia；Lithocarpus；Pinus；Fagus）中檢測到。

2.3根系真菌物種豐富度估計及物種累積曲線

用Bootstrap算法估計的海南霸王嶺毛棉杜鵑根系真菌物種數(shù)37種，高于實(shí)際觀察到的物種數(shù)（28種）。隨著根系真菌的宿主植物個體數(shù)增加，物種豐富度不斷增大，且從物種累積曲線來看檢測到的真菌物種數(shù)增加的潛力仍然較大，然而Shannon-Weiner多樣性指數(shù)卻趨于平緩（圖3）。

3討論與結(jié)論

本次從海南霸王嶺毛棉杜鵑根系中共檢測到28種真菌，通過序列比對和真菌ITS序列譜系樹分析發(fā)現(xiàn)子囊菌門的真菌種類豐富約占68%（19種），其中又以柔膜菌目真菌占的比例最大，共有11種，其中有7種與來自杜鵑花科植物或少數(shù)其他草本或木本植物根系真菌同源性達(dá)97%以上。子囊

菌門柔膜菌目的真菌是一類多樣且典型的杜鵑花菌根真菌，國內(nèi)外大多學(xué)者在對杜鵑花菌根真菌研究中也都發(fā)現(xiàn)了該類真菌，在多種杜鵑花根系中都檢測到[5，9-13，18，22，29]。在這7種柔膜菌目真菌中，OTU 9僅與來自Tsuga heterophylla的根系真菌（FJ152534）同源性達(dá)98%，OTU 11僅與Epacris microphylla的根系真菌同源性達(dá)98%[30]，其余5個OTU都曾在多種杜鵑花科植物根系及少數(shù)外生菌根根段中檢測到。OTU 7曾被報道與中國的Rhododendron fortunei和Vaccinium vitis-idaea（KJ817304），日本的Enkianthus campanulatus，美國的Pyrola和澳大利亞的Epacris microphylla等多種杜鵑花科植物根系共生[13，30-32]，且曾在美國的Picea根系中出現(xiàn)[33]，OTU10則在澳大利亞的Rhododendron lochiae，美國的Rhododendron maximum，德國的Calluna vulgaris（FM172790）和瑞士的Picea abies均有報道[5，9，34]。OTU 17和OTU 18都為粒毛盤菌（Lachnum）的物種，都與來自多種不同草本或木本植物的根系真菌同源性達(dá)97%以上。OTU 17曾在杜鵑花科植物Vacciniumuliginosu（KJ817288）、Pyrola、Calluna vulgaris和Enkianthus cernuus，禾本科植物Deschampsia flexuosa及殼斗科植物

Lithocarpus densiflorus的根系中出現(xiàn)[31-32，35-36]。OTU 18則曾在多種杜鵑花屬植物Rhododendron lochiae、Rhododendron fortunei、Rhododendron dauricum（KJ817276）和其他多種杜鵑花科植物Pyrola、Epacris microphylla、Erica glumiflora、Enkianthus perulatus、Vaccinium vitis-idaea（AJ430215）中檢測到[5，13，30-31，37]。OTU 22與Phialocephala fortinii（NR_103577）同源性高達(dá)99%，被鑒定為Phialocephala fortinii。Phialocephala fortinii是北半球地區(qū)侵染植物根系的典型的暗色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes，DSE）復(fù)合體中常見的一種真菌。關(guān)于這種內(nèi)生真菌或菌根真菌的習(xí)性在以往的研究中爭議較大，有學(xué)者認(rèn)為Phialocephala fortinii是菌根性的真菌[38-39]，它曾在Rhododendron decorum、Rhododendron maximum、Rhododendron fortunei、Calluna vulgaris、Pyrola media、Pyrola asarifolia、Vaccinium macrocarpon出現(xiàn)[9-10，13，40-42]。而周詩涵等在臺灣地區(qū)的紅毛杜鵑根系中也檢測到Phialocephala，菌根形態(tài)鑒定與rDNA序列分析，以及回接試驗(yàn)均證實(shí)Phialocephala能與杜鵑花類植物形成杜鵑花菌根[23]。

除此之外，還有4個OTU（OTU4、OTU5、OTU20、OTU23）

與NCBI中不同植物的根系真菌同源性達(dá)97%以上。OTU5與美國的Cypripedium acaule的根系真菌同源性達(dá)98%[43]。OTU4和OTU23不僅在杜鵑花科植物中檢測到，還在其他植物根系中也有出現(xiàn)。前者曾報道在Hoffmannseggella caulescens、Rhododendron lochiae、Eucalyptus、Woollsia pungens根系出現(xiàn)[5，44-46]，后者則在Rhododendron maximum和Fagus（FN619991）根系中檢測到[9]。OTU20與Oidiodendron citrinum（NR_111033）同源性達(dá)95%，因此鑒定為樹粉孢屬真菌。樹粉孢屬是常見的杜鵑花菌根真菌，特別是在北半球的杜鵑花根系中是非常常見的，本研究中樹粉孢屬與日本的Enkianthus campanulatus（99%）、中國四川及云南的Rhododendron decorum（98%）、南非的Erica caffra（98%）及澳大利亞熱帶森林的Epacris pulchella的根系共生真菌同源性高達(dá)98%或99%[10，32，37，47]。然而，在本研究中并沒有出現(xiàn)分布最廣且在杜鵑花類菌根真菌中研究最多的Oidiodendron maius。從這些同源性達(dá)97%的根系真菌的宿主植物分析中推測杜鵑花類菌根真菌類型在目的水平上總體相似，但不同的種之間可能受到其寄主植物的影響。

擔(dān)子菌門的真菌物種數(shù)在本研究中僅占29%，為傘菌綱中傘菌目、紅菇目、蠟殼耳目、革菌目、Trechisporales。在早期，蠟殼耳目的真菌被認(rèn)為是腐生真菌，后續(xù)的研究表明Sebacinales 真菌可以劃分為Clad A與Clad B兩大支系[48]。Clad A被報道既能與蘭科形成內(nèi)生型菌根，又能與殼斗科、松科植物形成外生菌根[49]，Clad B與杜鵑花科植物，如杜鵑花屬、越橘屬，帚石楠屬等宿主共生。紅菇目和革菌目是典型的外生菌根真菌，在美國大煙霧山國家公園Rhododendron maximum及澳大利亞Rhododendron hirsutum根系中也曾分離到紅菇[7-9]，中國云南的Rhododendron decorum根系中曾有革菌目的出現(xiàn)[10]。

群落物種豐富度的研究表明，受抽樣樣本大小的限制，在一個地區(qū)觀察到的物種往往只能代表當(dāng)?shù)匚锓N庫中的一部分，然而，可以采用物種豐富度估計的方法來最大限度地估計當(dāng)?shù)匚锓N數(shù)。本研究用Bootstrap估計的杜鵑花根系真菌物種數(shù)37種，高于實(shí)際觀察到的物種數(shù)（28種）。物種累積曲線表明，隨著杜鵑花宿主植物個體數(shù)增加，檢測到的根系真菌物種數(shù)增加的潛力仍然較大，因此，全面揭示杜鵑花菌根真菌資源的多樣性是杜鵑花菌肥開發(fā)利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

另外，本試驗(yàn)研究檢測到的真菌有93%的物種只能鑒定到目，能鑒定到科、屬、種水平的真菌僅占少數(shù)。主要是因?yàn)镹CBI等公共數(shù)據(jù)庫中暫時缺少與這些真菌高同源性，并且已知分類地位的代表性序列。隨著NCBI數(shù)據(jù)庫中分類信息準(zhǔn)確的真菌DNA條形碼序列累積，本研究檢測到的真菌序列將會獲得更精細(xì)的分類信息。

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