寧　超， 榮小靈， 杜　靖

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 烏魯木齊　830011； 2第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 烏魯木齊　830064；3高職學(xué)院機(jī)能教研室， 烏魯木齊　830011)

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·民族腫瘤學(xué)·

PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義

寧超1， 榮小靈2， 杜靖3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 烏魯木齊830011；2第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 烏魯木齊830064；3高職學(xué)院機(jī)能教研室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的研究體外特定細(xì)胞株(C33a、HaCaT及SiHa)中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1R)和雌激素受體(ER)蛋白的表達(dá)量，分析各蛋白的表達(dá)與HPV16感染致癌的關(guān)系。 方法培養(yǎng)C33a、HaCaT及SiHa 3種細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)IGF-1R、PI3K、ERK和ER蛋白在3種細(xì)胞株中的表達(dá)水平。結(jié)果IGF-1R、PI3K和ERK蛋白在SiHa細(xì)胞株中的表達(dá)高于在C33a、HaCaT細(xì)胞株中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在SiHa細(xì)胞株中ER的表達(dá)低于在C33a細(xì)胞株中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)I3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宮頸癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)不同程度的表達(dá),可能與HPV16感染后宮頸癌變存在一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：宮頸癌細(xì)胞； PI3K； ERK； IGF-1R； ER

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，且發(fā)病年齡日益年輕化。新疆地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率和病死率一直居全國(guó)首位，南疆維吾爾族婦女宮頸癌患病率在全國(guó)少數(shù)民族中居第1位，被列為新疆特高發(fā)腫瘤之一[1-2]。目前認(rèn)為人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因之一。腫瘤的發(fā)生需多因素協(xié)同作用，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1R)、雌激素受體(ER)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、存活、黏附和遷移，參與抗腫瘤細(xì)胞凋亡[3-5]，并相互影響。然而PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)與HPV16感染與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展是否存在關(guān)聯(lián)少有報(bào)道。本研究分別檢測(cè)HPV16陰性的子宮頸癌C33a細(xì)胞株、永生性人類角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株中和HPV16陽(yáng)性的子宮頸癌SiHa細(xì)胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)水平，探討4種蛋白的關(guān)系，從分子水平為宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器HPV16陰性的子宮頸癌C33a細(xì)胞株、永生性人類角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株和HPV16陽(yáng)性的子宮頸癌 SiHa細(xì)胞株均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，兔源ERK(ERK1)抗體(1∶1 000)、兔源IGF-1R抗體(1∶500)、兔源ER(ER-α)抗體(1∶1 000)均購(gòu)自美國(guó)abcam公司，兔源PI3K(PI3Kp85)抗體(1∶600)、β-actin多克隆兔抗(1∶1 000)均購(gòu)自美國(guó)SANTA公司。DMEM培養(yǎng)基、胰酶(Biosharp，中國(guó))，雙抗/青鏈霉素合劑(Gibco，美國(guó))，TBST(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，5%CO2孵育箱(HeraCell-150，Thermo Fishers公司)，生物安全柜(ThermoKS-18，Thermo Fishers公司)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2方法

1.2.1C33a、HaCaT及SiHa細(xì)胞培養(yǎng)配制含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，DMEM全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于含5% CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1～2天更換培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞整合度達(dá)80%時(shí)，采用胰蛋白酶(0.25%)消化方法，按1∶2或1∶3比例傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2Western blot檢測(cè)PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)將C33a、HaCaT及SiHa細(xì)胞分別收集到相應(yīng)的EP管中，提取蛋白并分裝置-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠分離，4℃電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，TBST洗膜，加入PI3K、ER、ERK和IGF-1R抗體，室溫孵育1 h，轉(zhuǎn)至4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入二抗，室溫避光孵育2 h，顯色液顯色，將PVDF膜上的條帶利用凝膠成像處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果采用Quantity one 凝膠分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白和β-actin的光密度比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)Western Blot結(jié)果PI3K、ERK和IGF-1R蛋白在SiHa細(xì)胞株中的表達(dá)量高于在C33a及HaCaT細(xì)胞株中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與SiHa和HaCaT細(xì)胞株比較，ER在C33a細(xì)胞株中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

1：HaCaT細(xì)胞株；2：SiHa細(xì)胞株；3：C33a細(xì)胞株

2.2C33a、HaCaT及SiHa細(xì)胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)方差齊性檢驗(yàn)顯示，F(xiàn)PI3K=3.179，P=0.113；FERK=0.230，P=0.801；FIGF-1R=3.886，P=0.083；FER=0.046，P=0.955，表明方差齊，可用單因素方差分析和LSD-t進(jìn)行組間比較。PI3K、ERK和IGF-1R蛋白在SiHa細(xì)胞株中表達(dá)量高于在C33a及HaCaT細(xì)胞株中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與SiHa細(xì)胞株比較，ER在C33a細(xì)胞株中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖2)。

表1　C33a、HaCaT及SiHa細(xì)胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)

注：與C33a細(xì)胞株比較，*P<0.05； 與HaCaT細(xì)胞株比較，△P<0.05。

注：與C33a細(xì)胞株比較，*P<0.05; 與HaCaT細(xì)胞株比較，△P<0.05。

圖2C33a、HaCaT及SiHa細(xì)胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(dá)

3討論

HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要原因之一，機(jī)體內(nèi)一系列細(xì)胞生長(zhǎng)增殖信號(hào)表達(dá)異常，都有可能引起細(xì)胞正常的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控發(fā)生異常改變。本研究通過(guò)測(cè)定體外特定細(xì)胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白的表達(dá)量，分析各蛋白與HPV16感染致癌的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K、ERK和IGF-1R在SiHa細(xì)胞株中高表達(dá)，與C33a、HaCaT細(xì)胞株中表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示4種蛋白不同程度的表達(dá)可能與HPV感染后致癌作用有關(guān)。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡與分化等生理過(guò)程，多種腫瘤及癌前病變發(fā)現(xiàn)PI3K基因突變是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要特征。ERK和其信號(hào)途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起中介和信號(hào)放大作用[6]，研究表明ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了Ras基因突變引發(fā)的宮頸癌細(xì)胞增殖[7]。IGF-1R已被證實(shí)其具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡的作用，是重要的促腫瘤生長(zhǎng)因子，其表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。人體中最主要的雌激素17β-雌二醇(Estrogen，E2)不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度水平而調(diào)節(jié)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖活動(dòng)[10]，還參與上調(diào)HPVE6、E7基因的表達(dá)，在HPV感染的宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起促進(jìn)作用，增加宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。

Harris等[12]利用PIK3CA作為探針，通過(guò)熒光原位雜交的方法檢測(cè)到宮頸癌細(xì)胞株C-4I、CaSki和ME-180中PI3K拷貝數(shù)顯著增加，結(jié)合本研究結(jié)果，提示PI3K通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠協(xié)助HPV16誘發(fā)宮頸腫瘤。ERK信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白合成調(diào)控宮頸癌SiHa細(xì)胞的行為[13]。當(dāng)宮頸感染HPV16后，HPV16編碼的蛋白介導(dǎo)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強(qiáng)正常宮頸上皮的癌變率。近年來(lái)，有關(guān)IGF家族是否增加HPV病毒的易患性及其在HPV病毒持續(xù)感染中的作用的研究不斷增加。發(fā)現(xiàn)IGF-1基因的調(diào)控可影響正常上皮組織增生、增加HPV感染后致癌的可能性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，癌基因能夠通過(guò)提高IGF-1R基因的活性而發(fā)揮致癌作用， IGF-1R基因的高表達(dá)成為某些癌基因發(fā)揮致癌作用的先決和必備條件[15]。因此，IGF-1R高表達(dá)促進(jìn)了HPV16感染后子宮頸癌變的概率。由此可以推測(cè)，PI3K、ERK和IGF-1R蛋白表達(dá)量升高與HPV16感染過(guò)程可能存在協(xié)同關(guān)系。

張曉波等[16]研究顯示高危型人乳頭瘤病毒(High-Risk HPV、HR-HPV)感染是誘發(fā)宮頸癌的首要啟動(dòng)因素，ER在HPV感染引起的宮頸癌早期起促進(jìn)作用。王立群等[17]研究結(jié)果顯示，在子宮肌瘤細(xì)胞中ER和IGF-1R的表達(dá)明顯高于子宮肌層細(xì)胞的表達(dá)。說(shuō)明子宮肌瘤的生長(zhǎng)與子宮肌瘤組織ER和IGF-1R的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R和ER在SiHa細(xì)胞株中的表達(dá)高于在HaCaT細(xì)胞株中的表達(dá)(P<0.05)，提示IGF-1R和ER在HPV16感染宮頸癌發(fā)生機(jī)制中可能具有協(xié)同作用。IGR-1R活化后通過(guò)Ras/MEK/ERK信號(hào)通路啟動(dòng)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，不僅刺激細(xì)胞增生、分化以及存活，還可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路刺激細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、抗凋亡、促細(xì)胞增殖[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PI3K、ERK、IGF-1R在SiHa細(xì)胞株中高表達(dá)，在HaCaT細(xì)胞株中低表達(dá)(P<0.05)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致，提示PI3K、ERK和IGF-1R蛋白高表達(dá)可能促進(jìn)了HPV16感染后的宮頸細(xì)胞癌變。同時(shí)本研究觀察到C33a細(xì)胞株中ER高表達(dá)，而PI3K、ERK、IGF-1R 3種蛋白表達(dá)量并不高，提示ER并非是在感染HPV的前提下導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的單一因素，可能是PI3K、ERK、IGF-1R和ER 4種蛋白與HPV的共同作用促使宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

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(本文編輯楊晨晨)

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃項(xiàng)目(XJEDU2012I24)

作者簡(jiǎn)介：寧超(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：婦科腫瘤。 通信作者：杜靖，女，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:598733481@qq.com。

中圖分類號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)08-1044-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.027

[收稿日期：2016-05-16]

The expression of PI3K, ERK, IGF-1R and ER protein in cervical carcinoma cell lines

NING Chao1, RONG Xiaoling2, DU Jing3

(1DepartmentofPreclinicalMedicineCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830064,China;3DepartmentofMedicalPhysiology&Biochemistry,HigherVocationalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of PhosPhoinositide 3 kinase (PI3K), extracellular regulated protein coyness(ERK), Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (IGF-1R) and Estrogen receptor (ER) in the specific cervical carcinoma cell lines, and to clarify the relationship between the expression of four proteins and HPV16 in the development of cervical carcinoma. MethodsThe Western blotting was used to detect the substances expression level of IGF-1R, PI3K, ERK and ER proteins in C33a, HaCaT and SiHa. ResultsThe exprssion of IGF-1R, PI3K and ERK in SiHa cell were significantly higher than that in C33a, HaCaT (P<0.05), and the exprssion of ER in the SiHa cell was significantly down-regulated compared with C33a (P<0.05). ConclusionThe differences of protein expression levels in PI3K, ERK , IGF-1R and ER suggested that those maybe associate with the infection of HPV16 in the occurrence of cervical cancer.

Keywords：cervical cancer cells; PI3K; ERK; IGF-1R; ER