A549細胞凍存與復蘇方法的改進

季曉宇　鞠曉梅　湯　賀　姜　萌　羅來鵬　劉宇軒　侯毅鞠

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A549細胞凍存與復蘇方法的改進

季曉宇鞠曉梅湯賀姜萌羅來鵬劉宇軒侯毅鞠

吉林醫(yī)藥學院檢驗學院

季曉宇（1995-）女（漢族），河北省保定市人，在讀本科；通訊作者：侯毅鞠（1974-）女（漢族），吉林省吉林市人，副教授，碩士學位，主要從事血液腫瘤相關的研究工作。

行業(yè)曲線

起始于20世紀早期的細胞培養(yǎng)技術作為生命科學研究最基礎的環(huán)節(jié)，隨著分子生物學實驗技術的發(fā)展，在生物學研究領域得到了廣泛應用，如培養(yǎng)腫瘤細胞是研發(fā)抗腫瘤新藥的常規(guī)技術 。A549是1972年由Giard DJ通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系的一種肺癌細胞。我們以A549細胞為例，研究細胞培養(yǎng)中最基本但又很關鍵的凍存與復蘇的方法和條件，使A549凍存復蘇后獲得最高生物學特性，推動后期實驗順利進行。

實驗所需材料與方法

實驗材料

A549肺癌細胞，RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司），胎牛血清（四季青），DMSO（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），胰蛋白酶（北京鼎國生物技術有限公司），CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺。

實驗方法

A549細胞的培養(yǎng)及傳代

在溫度為37℃±1、CO2濃度為5%培養(yǎng)箱內(nèi)，用胎牛血清為10%的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%即可傳代培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液后加入適量胰酶，37℃消化1～2 min，見有細小白沙狀物順瓶底滑脫，顯微鏡下觀察到大部分細胞呈現(xiàn)圓形，細胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化，收集細胞懸液，800 r·min-1，5min離心，去掉上清，加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基以后吹打混勻，按照1∶2進行傳代培養(yǎng)。

不同濃度DMSO凍存A549細胞

常用的細胞凍存液為含10%二甲基亞砜、20%胎牛血清、70% RPMI-1640的培基。取生長狀態(tài)良好的A549細胞，待貼壁生長至80%～90%時，按前述方法消化細胞，待消化充分后，收集細胞懸液進行離心，將細胞分成密度相同的 4 組，凍存保護液DMSO終濃度依次為 5%、10%、15%、20%分裝于凍存管，冷凍保存。15天后取出，置于37℃水浴中輕輕晃動，迅速溶解，800 r·min-1，5min離心，去掉上清，加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基以后吹打混勻，于溫度為37℃±1、CO2濃度為5%培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

A549細胞的復蘇

選擇凍存條件最優(yōu)的細胞（10%DMSO濃度凍存的A549細胞），選用兩種不同方法來復蘇。第1組：凍存管立即放于37℃水浴，輕晃至融化后加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，800 r·min-1離心5min，棄去上清，加入培養(yǎng)基混勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。第2組采用改良復蘇方法：立即將凍存管置于42℃水浴快速融化，加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，800 r·min-1離心5min，棄去上清，加入培養(yǎng)基混勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。兩組均靜置12 h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

復蘇細胞形態(tài)學觀察

培養(yǎng)24h后行瑞士染色，光學顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及其生長狀況。

臺盼藍染色法判斷A549細胞存活率

細胞培養(yǎng)12h后用臺盼藍染液計數(shù)，每個標本計數(shù) 500個細胞，計數(shù)3次取平均值。在顯微鏡下觀察，死細胞被染成深藍色；活細胞邊緣光滑且胞體透明、染色很淡。計數(shù)3個不重疊視野的未藍染細胞數(shù)，計算細胞的平均存活率。

圖1

繪制細胞生長曲線

分別取復蘇后的細胞，調(diào)整濃度為6×106·mL-1接種培養(yǎng)。以h為橫坐標，以細胞濃度為縱坐標繪制出生長曲線，比較不同濃度二甲基亞砜凍存細胞，及不同復蘇方法的差異。

結果

A549細胞復蘇形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下：濃度為5%、10%、15%的DMSO凍存細胞復蘇后貼壁狀態(tài)較好，形態(tài)較凍存之前無明顯變化或有多角形；20%濃度DMSO細胞生長較慢，可為多角形。兩種復蘇方法比較，改良復蘇方法細胞形態(tài)較好。

臺盼藍拒染法判斷A549細胞的存活率

5%、10%、15%、20%、DMSO的凍存A549細胞的復蘇存活率分別為（87.60±1.26）%、（88.07±2.07）%、（87.17±1.31）%、（42.53±1.10）%；t=2.920，p＜0.05，分別組間比較5%、10%、15%二甲基亞砜組凍存A549 細胞復蘇率與 20%二甲基亞砜組， 差異顯著（t=1.49～78.32，P均 ＜ 0.05）。傳統(tǒng)復蘇方法與改良復蘇方法細胞存活率分別為（88.07±2.07）%、（90.67±1.48）%；t=2.920，p＜0.05。組間比較無顯著差異（t=2.69，p＞0.05）.

A549細胞的生長曲線

不同濃度DOMS凍存液（圖1a）

由圖可看出5%、10%、15%二甲基亞砜濃度凍存細胞較快達到對數(shù)生長期。20%濃度凍存細胞生長緩慢，對細胞損害較大。

不同復蘇方法（圖1b）

如圖可見兩種復蘇方法無顯著差異。

討論

細胞體外培養(yǎng)凍存復蘇以后的生長狀態(tài)會對許多生物學試驗的效果產(chǎn)生直接影響，而其凍存復蘇后的生長狀態(tài)則主要與凍存保護劑的種類、濃度和細胞凍存與復蘇的方法條件及培養(yǎng)基血清濃度等有關。細胞凍存在低溫環(huán)境下，其活力代謝與生化反應基本保持靜止狀態(tài)，故冷凍保存時間的長短對細胞影響較小或無明顯影響。所用凍存液種類、濃度及降溫的速率是凍存細胞取得良好效果的關鍵。

本研究選用不同DMSO濃度的凍存保護液凍存A549細胞。結果顯示 5%、10% 和 15%組DMSO保存效果最佳明顯優(yōu)于20%組， 且10%組優(yōu)于 5% 和 15%組，但無明顯差異；當 DMSO增至 20%濃度時，細胞的復蘇率下降明顯。細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑——終濃度5%～15%的甘油或二甲基亞砜，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷，故應用10%濃度的DMSO凍存A549細胞較好。

復蘇細胞原則為越快越好，在進行細胞復蘇時，傳統(tǒng)的方法是37℃水浴融化后離心培養(yǎng)，改良的復蘇方法是42℃水浴中溶解，37℃水浴至融化后離心培養(yǎng)。本實驗中改良后細胞生長情況與傳統(tǒng)復蘇方法無顯著差異。

細胞培養(yǎng)技術不僅僅是本試驗中所涉及到的幾點，還受諸如培養(yǎng)的溫度、濕度、CO2濃度等多個條件和因素的影響。若能協(xié)調(diào)好眾多的影響因素，盡可能降低細胞損傷，進一步改善細胞復蘇與凍存技術，保證細胞活力， 可以隨時提供生長狀態(tài)良好的細胞，以便更有效地促進A549細胞在藥物敏感性研究、肺癌發(fā)病機制、信號轉導機制及誘導分化、藥物治療誘導肺癌細胞凋亡及評價細胞毒試驗等方面的廣泛應用。

基金項目：吉林省教育廳科學技術研究項目（No.2012489；No.2012338）；2013年吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目

DOI：10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.13.027