孫兆林，閆慧嬌，宮成玉，孫常磊，王岱杰，李佳，王志偉，王曉*

(1．山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355;3.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺　264000)

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高速逆流色譜法連續(xù)分離制備小白菊內(nèi)酯

孫兆林1,2，閆慧嬌1，宮成玉3，孫常磊1,2，王岱杰1，李佳2，王志偉1，王曉1,2*

(1．山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355;3.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺264000)

摘要：高速逆流色譜法連續(xù)進樣，分離制備杭白菊中的小白菊內(nèi)酯。采用高速逆流色譜法進行分離，以正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4，V/V)為溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相，連續(xù)進樣3次，浸膏進樣量330、350、370 mg，轉(zhuǎn)速800 r/min，流速2.0 mL/min，檢測波長254 nm。從杭白菊超聲提取物中，分離得到小白菊內(nèi)酯5.0 、5.2 、5.5 mg，純度分別為93.1%、92.6%、92.9%。利用連續(xù)進樣的高速逆流色譜法，可高效分離和純化杭白菊中的小白菊內(nèi)酯。

關(guān)鍵詞：高速逆流色譜；連續(xù)多次進樣；杭白菊；小白菊內(nèi)酯

圖1　小白菊內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1Chemical structure of parthenolid

菊花為菊科植物菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat．)的頭狀干燥花序，具有散風清熱、平肝明目和清熱解毒之功效，用于治療風熱感冒、眼目昏花、頭痛眩暈、目赤腫痛以及瘡癰腫毒等證[1]。藥理實驗證明，菊花具有抗炎、殺菌、降壓和治療冠心病的作用，是衛(wèi)生部新一批的藥品和食品資源。按不同產(chǎn)地和加工方法，菊花分為杭菊、滁菊、毫菊、懷菊、貢菊和川菊等[2]。小白菊內(nèi)酯(parthenolide)是一種倍半萜烯內(nèi)酯化合物，最早從艾菊中純化得到[3]，Hfptinstall等[4-6]的大量研究證據(jù)表明小白菊內(nèi)酯具有抗氧化、抗凋亡以及抗炎等多種藥理特性，并用以治療銀屑病、關(guān)節(jié)炎、偏頭痛和發(fā)熱等多種疾病。近幾年，Zingarelli等[7-8]還報道小白菊內(nèi)酯對心肌梗死再灌住后的心肌具有保護作用，對胰腺腫瘤也有一定的抑制作用。國內(nèi)外大量文獻研究表明，現(xiàn)階段對于小白菊內(nèi)酯的藥理學(xué)研究較多，關(guān)于杭白菊的化學(xué)成分研究也只是局限于黃酮類化合物的研究[9]，尚未見到關(guān)于小白菊內(nèi)酯的分離制備純化研究。本文通過高速逆流連續(xù)分離制備的方法，實現(xiàn)了對杭白菊甲醇提取物中小白菊內(nèi)酯的高效、快速的分離純化，得到小白菊內(nèi)酯(結(jié)構(gòu)如圖1所示)。該研究為小白菊內(nèi)酯的藥理學(xué)研究以及臨床實驗提供技術(shù)支撐。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

中藥高速粉碎機(瑞安市永歷制藥機械制造有限公司)；3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)；高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)；8823-B紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)；TBP5002泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)；超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)；恒溫循環(huán)器(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)。Symmetry C18色譜柱(4.6 mm × 5 mm, 5 μm)，Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司)。

乙腈為色譜純(美國天地公司)；甲醇為分析純(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)；實驗用水為過濾蒸餾水及娃哈哈純凈水。

杭白菊藥材購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬中魯醫(yī)院。經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為菊科植物杭白菊(Chrysanthemummorifolium)的頭狀干燥花序。

1.2實驗方法

1.2.1小白菊內(nèi)酯粗提物的提取

將購買的杭白菊藥材1 kg，用高速中藥粉碎機粉碎成粉末狀，先用甲醇浸泡24 h，料液比1∶10，超聲提取15 min，抽濾，減壓濃縮至浸膏狀，得浸膏325.21 g。將少許提取物浸膏用甲醇溶解，HPLC檢測分析。

1.2.2樣品溶液和溶劑體系的配制

在2 000 mL分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4,V/V)溶劑體系，并充分搖勻，在室溫下放置30 min。使用前分別取上相和下相，在超聲震蕩儀中脫氣20 min，備用。

分別取330、350、370 mg小白菊內(nèi)酯粗提物浸膏，分別取上下相溶劑各10 mL作為樣品溶液，使樣品完全溶于上下相溶劑，備用。

1.2.3HSCCC的分離制備過程

以20.0 mL/min的流速向高速逆流色譜儀的分離管中注入上相，15 min后，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為800 r/min，記錄儀衰減100 mV，紙速6.0 cm/h；檢測器衰減2.0 A。同時以2.0 mL/min流速注入下相，打開紫外檢測器，待下相從柱出口流出，兩相達到動態(tài)平衡后，由進樣閥注入樣品溶液，檢測波長254 nm，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖接收目標成分。

1.2.4高效液相色譜分析條件

色譜柱：Symmetry C18柱(4.6 mm × 5 mm, 5 μm)，流動相為乙腈-水溶液，柱溫為25 ℃，50%乙腈等度洗脫；流速為0.8 mL/min；進樣量為10 μL;檢測波長為254 nm。

2結(jié)果與討論

2.1HSCCC溶劑體系的選擇及優(yōu)化

高速逆流色譜分離中溶劑體系的選擇是非常重要的，溶劑體系符合與否是由目標化合物在兩相溶劑中的分配系數(shù)(KD)來確定的。一般來說，對HSCCC最合適的KD值范圍是0.5～2.0[10]。本實驗中，目標產(chǎn)物存在于超聲提取的甲醇部位，因此選用中極性的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系。本實驗測定了目標化合物在不同體積比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系中的KD值。實驗結(jié)果表明，目標化合物可以在兩相溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4，V/V)時，達到分離的目的。目標化合物在不同體積比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的KD見表1。體積比為5∶5∶4∶6和5∶5∶5∶5的體系雖然能獲得較高的固定相保留率，但樣品與雜質(zhì)的分離度太小。體積比為5∶5∶6∶4的溶劑體系的KD值比較接近于1，最適合用于HSCCC 系統(tǒng)分離[11]。

表1杭白菊甲醇粗提物中小白菊內(nèi)酯在不同體積比溶劑體系中的KD值

Table 1Partition coefficients (KD) of parthenolide in crude extract fromChrysanthemummorifolium

for different two-phase solvent systems

正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系(V/V)KD5∶5∶4∶646.025∶5∶5∶53.135∶5∶6∶41.05

2.2HSCCC分離純化的結(jié)果

以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4,V/V)為兩相溶劑體系，按照1.2.3節(jié)所述的方法對杭白菊提取物進行分離純化。分別將330、350、370 mg樣品溶于20 mL等體積混合的上下相溶液中進行HSCCC分離(見圖2)，根據(jù)圖2中的陰影部分進行手動分段收集，得到目標化合物。將餾分減壓濃縮干燥，其質(zhì)量依次為5.0、5.2、5.5 mg。經(jīng)過HPLC分析并應(yīng)用面積歸一法測定化合物的純度分別為93.1%、92.6%和92.9%,分析結(jié)果見圖3。

圖2　杭白菊中小白菊內(nèi)酯成分的高速逆流圖譜Fig.2　HSCCC chromatogram of parthenolide from Chrysanthemum morifolium

a杭白菊甲醇提取物總樣;b 小白菊內(nèi)酯標準品;c HSCCC譜圖中陰影部分圖3　HPLC圖譜Fig.3　HPLC chromatograms

2.3化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

白色片狀結(jié)晶ESI-MSm/z: 248(M+), 230(M+-H2O), 190(M+-COOHCH2)。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 6.12 (1H, d,J= 3.1 Hz, H-13b), 5.79 (1H, d,J= 3.1 Hz, H-13a), 5.26 (1H, br,H-1), 4.06 (1H, t,J= 8.5 Hz, H-6), 2.90 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 1.65 (3H, br s, Me-10), 1.20 (3H, s, Me-4)。13C-NMR (150 MHz, DMSO) δ: 169.7 (C-12), 140.5 (C-11), 135.0 (C-10), 124.9 (C-1), 121.1 (C-13), 82.6 (C-6), 65.7 (C-5), 61.7 (C-4), 46.9 (C-7), 36.4 (C-3), 30.0 (C-8), 24.1 (C-2), 17.3 (C-14),17.0 (C-15)。

綜合該化合物的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)，與文獻[12-14]報道中的小白菊內(nèi)酯相關(guān)數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為小白菊內(nèi)酯。

3結(jié)論

小白菊內(nèi)酯具有廣泛的藥用價值，開展小白菊內(nèi)酯的藥效學(xué)等研究均需要高純度的小白菊內(nèi)酯，使得小白菊內(nèi)酯快速高效的分離純化技術(shù)需求愈加緊迫。本研究建立了HSCCC連續(xù)進樣制備小白菊內(nèi)酯的方法，所得樣品純度高，方法簡便、快速且節(jié)省溶劑，具有較大的實用價值，為更好地開發(fā)利用小白菊內(nèi)酯提供了技術(shù)支撐。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.004

收稿日期：2015-12-10

基金項目：山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金(ZR2015YL012)；山東省科學(xué)院青年科學(xué)基金(2014QN005)

作者簡介：孫兆林(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為中藥資源與質(zhì)量控制。 *通訊作者，王曉(1972-)，男，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。Email: wangx@sdas.org

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)03-0018-05

Continuous separation and preparation of parthenolide fromChrysanthemummorifoliumwith high-speed counter-current chromatography

SUN Zhao-lin1,2,YAN Hui-jiao1,GONG Cheng-yu3,SUN Chang-lei1,2, WANG Dai-jie1,LI Jia2, WANG Zhi-wei1, WANG Xiao1,2*

(1. Shandong Provincial Key Laboratory of TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China;2. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;3.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai 264000,China)

Abstract∶We separated and prepared parthenolide from Chrysanthemum morifolium with continuous multiple preparation and high-speed counter-current chromatography (HSCCC). We acquired parthenolide of 5.0,5.2 and 5.5 mg from Chrysanthemum morifolium extract of 330,350 and 370 mg. Their purities were respectively 93.1%, 92.6%, and 92.9%. Experimental conditions were HSCCC, solvent system of n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (5∶5∶6∶4, V/V), upper stationary phase and lower mobile phase, rotation speed of 800.0 r/min, flow rate of 2.0 mL/min and detection wavelength of 254 nm. It shows that continuous preparation HSCCC can efficiently separate and purify parthenolide from Chrysanthemum morifolium.

Key words∶high-speed counter-current chromatography; continuous multiple preparation; Chrysanthemum morifolium; parthenolide

【中藥與天然活性產(chǎn)物】