李偉麗，黃麗芳，夏新界

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125;2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

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芡歐鼠尾草的組織培養(yǎng)和快速繁殖

李偉麗1,2，黃麗芳1，夏新界1

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125;2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

摘要：以芡歐鼠尾草(Salvia hispanica)成熟種子為外植體，1/2MS為基本培養(yǎng)基，研究不同濃度的外源激素對愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和生根的影響，從而初步建立了芡歐鼠尾草組織培養(yǎng)的快速繁殖體系。結(jié)果表明，誘導(dǎo)種子愈傷組織的最適宜培養(yǎng)基為1/2MS+10.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+0.4 mg·L-1ZT，誘導(dǎo)率為66.5%；不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為1/2MS+3.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，增殖倍數(shù)為7.69；生根的最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg·L-1NAA，生根率達100%，平均生根數(shù)為5.68；移栽后植株生長良好，成活率較高，達97%。

關(guān)鍵詞：芡歐鼠尾草；成熟種子；組織培養(yǎng)；快速繁殖

芡歐鼠尾草(Salviahispanica)為唇形科鼠尾草屬一年生草本植物，英文名為Chia(奇亞)，原產(chǎn)于墨西哥南部和危地馬拉北部。喜陽，但也能忍耐半陰，耐旱，耐貧瘠，不耐澇，適于生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。芡歐鼠尾草的種子又稱奇亞籽，具有悠久的食用和藥用歷史[3]。除直接食用外，也被用于餅干、面包、酸奶等食品的生產(chǎn)[4-5]。同時，奇亞籽也可作為營養(yǎng)強化劑及食品添加劑。我國已于2014年批準(zhǔn)奇亞籽為新食品原料。研究表明，奇亞籽中富含多種蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、維生素、ω-3系列多不飽和脂肪酸和抗氧化劑等成分，具有維持正常血脂水平、抗腫瘤、抗氧化、改善糖尿病和心血管疾病等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等方面[6-10]。

隨著消費者保健意識的增強和對健康營養(yǎng)食品要求的不斷提高，芡歐鼠尾草已成為國內(nèi)外食品研究領(lǐng)域的熱點，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有著巨大的開發(fā)利用前景[11]。近年來隨著人們對芡歐鼠尾草的需求逐漸擴大和開發(fā)日漸迅速，原料需求逐步增加。由于工業(yè)需求的不斷增加，大量野生資源被消耗，芡歐鼠尾草種質(zhì)資源面臨枯竭。因此，人工種植和栽培芡歐鼠尾草受到重視，利用組織培養(yǎng)可以在短期內(nèi)生產(chǎn)大量的優(yōu)質(zhì)種苗，可為芡歐鼠尾草的生理生化、遺傳轉(zhuǎn)化工作提供理論參考。目前，關(guān)于藥用鼠尾草屬植物組織培養(yǎng)有一些報道，如王宗霞和康慧[12]通過頂芽培養(yǎng)獲得了藍花鼠尾草(S.farinacea)的再生植株；王萌等[13]通過葉片獲得了甘西鼠尾草(S.przewalskii)的再生植株；有關(guān)芡歐鼠尾草組織培養(yǎng)的研究在國外也有一定報道，如Mirian等[14]通過幼嫩葉片、子葉和帶芽莖段3種外植體，首次進行芡歐鼠尾草的微體快繁研究；Marconi等[15]以莖段為材料建立了芡歐鼠尾草的組織培養(yǎng)體系。然而國內(nèi)則尚未見相關(guān)報道?；诖?，本研究以芡歐鼠尾草的種子為外植體，探討芡歐鼠尾草再生組織培養(yǎng)的最佳條件，以期為人工規(guī)?；a(chǎn)芡歐鼠尾草提供重要的技術(shù)參考，同時對保護芡歐鼠尾草野生種質(zhì)資源具有重要的現(xiàn)實意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料來源于中國科學(xué)院作物耐逆境分子生物學(xué)課題組試驗基地，選用成熟的芡歐鼠尾草種子為外植體。

1.2試驗方法

1.2.1無菌材料的獲得選取芡歐鼠尾草無病、無蟲害的成熟種子。將種子置于消毒瓶中，用70%乙醇溶液消毒30 s，再用無菌水沖洗3～4次后放入0.1%升汞(HgCl2)溶液中浸泡10 min,期間不斷搖晃，取出后用無菌水清洗5～6次，無菌濾紙吸干種子表面水分。

1.2.2種子愈傷組織的誘導(dǎo)和分化將外植體接種到1/2MS基本培養(yǎng)基中，利用L9(34)正交試驗設(shè)計,研究不同濃度的NAA(0、0.5和1.0 mg·L-1)、6-BA(3.0、5.0和10.0 mg·L-1)和ZT(0、0.4和0.8 mg·L-1)組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。因芡歐鼠尾草種子較小(圖1)，用1 000 μL移液槍吸取種子。將種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個處理接種5瓶，每瓶接種10個，重復(fù)4次。接種20 d后統(tǒng)計種子愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率。

1.2.3不定芽的增殖將誘導(dǎo)出的叢生芽分成單株，基部保留部分愈傷塊，切割后接種到增殖培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和NAA。每個處理接種5瓶，每瓶接種5個，重復(fù)4次。30 d后，觀察統(tǒng)計不定芽的增殖倍數(shù)和生長狀況。

1.2.4繼代生根待不定芽生長至約4 cm時自基部剪下，接種至適宜的增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每30 d左右繼代一次。生根培養(yǎng)時，將組培苗接種至添加不同濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個處理接種5瓶，每瓶接種5個，重復(fù)4次。培養(yǎng)16 d后，觀察統(tǒng)計不定芽的生根率、平均生根系數(shù)及生長狀況。

1.2.5煉苗移栽取生長健壯、葉色濃綠、根系發(fā)達、長8～10 cm的組培苗，打開瓶蓋，室溫條件下煉苗2 d后取出，清洗根部殘留的培養(yǎng)基，稍微蘸取IBA (0.1 mg·L-1) 溶液，再將其移栽至小盆中，移栽基質(zhì)為泥炭土和珍珠巖(1∶1)的混合基質(zhì)(培養(yǎng)基質(zhì)預(yù)先用1/1 000的高錳酸鉀溶液浸泡2 h，瀝干備用)，遮陰培養(yǎng)，散射光照。每周噴施1/2的營養(yǎng)液一次，定期觀察幼苗生長情況，20 d后，統(tǒng)計移栽苗的成活率。然后，將部分組培苗置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分組培苗移栽于大田中，完全暴露于自然的環(huán)境下。

1.3培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基均以1/2MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含蔗糖30 g·L-1、瓊脂8 g·L-1，培養(yǎng)基在高壓滅菌前將pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，空氣相對濕度為70%，光照強度為2 000 lx,光照時間為12 h·d-1。

1.4評價指標(biāo)

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

分化率=(有芽形成的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織的總數(shù))×100%；

增殖倍數(shù)=增殖后的幼苗數(shù)/接種的幼苗數(shù)；

生根率=(生根的幼苗數(shù)/接種的幼苗數(shù))×100%；

平均生根數(shù)=根的總數(shù)/生根的苗數(shù)。

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測定結(jié)果，并用Duncan法對各測定結(jié)果進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素濃度的培養(yǎng)基對種子誘導(dǎo)的影響

將無菌的種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，各處理均能誘導(dǎo)出愈傷組織。培養(yǎng)20 d左右開始形成愈傷組織，且部分愈傷組織的邊緣同步分化出綠色的小芽(圖1)，隨后不斷增加。以愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率為指標(biāo)，記錄數(shù)據(jù)并對誘導(dǎo)率進行極差分析(表1)。結(jié)果表明，不同濃度的6-BA、NAA和ZT組合對愈傷組織的誘導(dǎo)和分化有明顯影響，單獨使用6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)率極低，處理A6、A8的誘導(dǎo)率(42.5%、40.5%)顯著高于處理A2、A3(15.5%、12.5%)(P<0.05)?？芍狽AA較ZT對芡歐鼠尾草種子愈傷組織誘導(dǎo)更有效，更有利于愈傷的誘導(dǎo)。同時，根據(jù)R值判斷可知，6-BA、NAA、ZT對愈傷組織的誘導(dǎo)作用為NAA>6-BA>ZT。經(jīng)多重比較分析可知，處理A9培養(yǎng)基配方對愈傷組織誘導(dǎo)的效果更明顯，顯著高于其它處理(P<0.05)。A9條件下叢生芽誘導(dǎo)率高達66.5%，且不定芽葉片嫩綠，莖較粗。因此，處理A9，即1/2MS+10.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+0.4 mg·L-1ZT是芡歐鼠尾草種子誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基。

2.2不同濃度的6-BA、NAA組合對不定芽增殖的影響

將初代培養(yǎng)的0.5 cm以上的不定芽接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，不定芽體積不斷增多，迅速伸長(圖1)。方差分析與多重比較結(jié)果表明，不同濃度NAA和6-BA組合對芡歐鼠尾草不定芽增殖有明顯影響。培養(yǎng)基中僅含NAA時，不定芽增殖倍數(shù)隨NAA濃度增加先升高后下降，其最大值為6.78(表2)；當(dāng)NAA濃度為0.5 mg·L-1時，不定芽增殖倍數(shù)隨6-BA濃度增加而下降，最大值為7.69。因此，最適宜不定芽增殖的NAA濃度為0.5 mg·L-1。NAA濃度為0.5 mg·L-1時不定芽增殖倍數(shù)均較高，其中處理B5的不定芽增殖倍數(shù)顯著高于其它處理(P<0.05)，不定芽增殖倍數(shù)最高。且處理B5誘導(dǎo)出的不定芽苗葉色濃綠，莖較粗壯，植株較高。因此，處理B5，即1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-16-BA是芡歐鼠尾草不定芽增殖的最適宜培養(yǎng)基。

2.3不同培養(yǎng)基對生根與移栽的影響

將經(jīng)增殖培養(yǎng)長至4 cm左右高的組培苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，基部分化出根點，9 d后長出白色根，16d后統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果表明，各處理條件下的幼苗易生根，且生長狀況好。不定芽在不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，同樣可以誘導(dǎo)出根，生根率高達90%(表3)，但誘導(dǎo)生根時間較長，且根較細弱；添加低濃度的NAA(0.1～0.5 mg·L-1)可促進芡歐鼠尾草根的形成，生根率達98%以上，不同濃度之間無顯著差異。NAA濃度為0.5 mg·L-1時，培養(yǎng)9 d左右可形成完整根系，根長而多(圖1)，平均根數(shù)最高達5.68，顯著高于其它處理(P<0.05)。綜上所述，本試驗中芡歐鼠尾草適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg·L-1NAA。芡歐鼠尾草試管苗移栽成活率較高，在溫室煉苗、移栽后20 d，新葉長出，生長旺盛，移栽成活率達97%。生長于溫室和大田中的植株長勢均較好，葉色濃綠(圖1)。

表1　不同濃度NAA, 6-BA和 ZT組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±SD。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)?！?”表示生長的強弱，越多表示長勢越好。表2、表3同。

Note: Values are represented as mean ± SD. Different lower case letters within the same column show significant difference at 0.05 level. “+” in the table means the growing status, more “+” indicates stronger vigorous growth. The same in Table 2 and Table 3.

圖1　芡歐鼠尾草種子的離體培養(yǎng)和植株再生

編號Number植物生長調(diào)節(jié)劑Plantgrowthregulator/mg·L-1NAA6-BA增殖倍數(shù)Proliferationmultiples生長狀況GrowthstatusB10.205.15±0.11d 細長SlenderB20.506.78±0.08b 健壯HealthyandstrongB30.805.33±0.13d 健壯,生長慢Healthyandstrong,growingslowlyB41.004.70±0.06e 老化,長勢弱Aging,growingweakB50.53.07.69±0.09a 粗壯,長勢強Thickandstrong,growingstrongB60.55.06.39±0.07c 健壯,生長慢Healthyandstrong,growingslowly

3討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)中，植物細胞受到包括生理、形態(tài)、生化等多因素的影響，其中外植體和植物激素是關(guān)鍵的制約因素。唇形科鼠尾草屬植物叢生芽誘導(dǎo)常用的外植體多為葉片、莖段、莖尖、頂芽[16-19]，較少有關(guān)種子作為外植體的報道[20-22]。成熟種子同其它類型外植體相比，取材容易，受消毒的影響小，且不受季節(jié)和植株發(fā)育時期等因素的限制，具備取材方便、操作簡單等特點。因此，成熟種子作為外植體進行組織培養(yǎng)建立一個高頻的植株再生體系成為大多數(shù)研究者的首選[23]。所以，本研究選擇的外植體為芡歐鼠尾草成熟的種子。

表3　不同培養(yǎng)基對移栽苗生根的影響

此外，在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑用量雖然微小，但不可缺少[24]。植物激素起著傳遞遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等發(fā)育信號的作用[25]。植物激素中細胞分裂素的主要作用是促進細胞分裂，誘導(dǎo)愈傷組織[26]。在鼠尾草植物愈傷組織誘導(dǎo)中，6-BA是重要的激素之一，對愈傷組織的誘導(dǎo)起決定性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，外植體在僅含6-BA的培養(yǎng)基上也能誘導(dǎo)出愈傷組織，這與鼠尾草屬其它植物研究結(jié)果不同[21]。分析原因可能是基本培養(yǎng)基種類，鼠尾草種類、材料部位和激素濃度的不同造成的，這一問題仍有待進一步研究。值得一提的是，愈傷組織誘導(dǎo)中細胞分裂素和生長素的比例尤為重要[27]。根據(jù)前人研究可知，6-BA(0.4～3.0 mg·L-1)與NAA(0.06～1.0 mg·L-1)的比值通常在6～10，本研究所加6-BA和NAA配比符合這一范圍。

有研究表明，在繼代培養(yǎng)過程中，需附加外源生長素來維持愈傷組織的增殖和生長，生長素進入愈傷組織的細胞后，誘發(fā)一系列生理效應(yīng)，進而維持細胞在繼代培養(yǎng)過程中正常的生理活動[28]。適當(dāng)增加NAA的濃度有利于提高不定芽的增殖率。本研究在增殖培養(yǎng)中提高了NAA的含量比例。NAA濃度為0.5 mg·L-1時，不定芽增殖率隨6-BA濃度增加而下降，且最高增殖率時6-BA濃度為3.0 mg·L-1，這一結(jié)果與沙紅和瘳康[17]指出的當(dāng)6-BA濃度高于0.8 mg·L-1時，鼠尾草增殖倍數(shù)開始減少的觀點有一定差異。

根據(jù)沙紅和廖康[17]的研究得知，1/2MS培養(yǎng)基的生根效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基，生根率最高為70%。本研究發(fā)現(xiàn)，在完全不含植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基，生根率達到90%，更有利于根的生成，且再生植株長勢也較好。因此，1/2MS培養(yǎng)基較適合于芡歐鼠尾草組培苗的生根培養(yǎng)。這一結(jié)果也與房師梅等[18]對丹參(S.miltiorrhiza)組培快繁技術(shù)的研究結(jié)果一致，而與王宗霞和康慧[12]對藍花鼠尾草(S.farinacea)生根的研究結(jié)果相反。

本研究用種子作外植體，試驗材料取材容易，數(shù)量大。將種子接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，直接長出愈傷的同時，又能分化出芽，而且同步誘導(dǎo)愈傷和芽的頻率高，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中9 d左右形成完整植株；不僅簡化了操作過程，而且大大縮短了培養(yǎng)時間，節(jié)省了生產(chǎn)成本，可批量生產(chǎn)，應(yīng)用價值高。再生體系的建立不僅使芡歐鼠尾草的大規(guī)模快繁生產(chǎn)成為可能，還為今后芡歐鼠尾草優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源再生體系的構(gòu)建以及生理生化研究等方面提供了技術(shù)保障。

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(責(zé)任編輯武艷培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0424

*收稿日期：2015-08-06接受日期：2015-10-09

基金項目：湖南省科技計劃項目——名貴暢銷花卉新品種繁育與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)研究(2014FJ3089)

通信作者：黃麗芳(1976-)，女(回族)，湖南中方人，助理研究員，碩士，主要從事花卉和藥用植物品種選育與栽培技術(shù)研究。E-mail:hlf@isa.ac.cn

中圖分類號：Q943.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-0629(2016)3-0393-07* 1

Corresponding author:Huang Li-fangE-mail: hlf@isa.ac.cn

Tissue culture and rapid propagation ofSalviahispanica

Li Wei-li1,2, Huang Li-fang1, Xia Xin-jie1

(1.Key laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;2.University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China)

Abstract:In order to establish the tissue culture and rapid propagation system of Salvia hispanica, the present study explored the impacts of different concentrations of hormone on callus induction, proliferation and root induction with the mature seed of S. hispanica as explant and 1/2MS as the basic medium. The results showed that the optimal medium for callus induction was 1/2MS medium with 10.0 mg·L-16-BA, 1.0 mg·L-1NAA and 0.4 mg·L-1ZT, which had the highest induction rate of 66.5%. The optimal medium for the proliferation was 1/2MS medium with 3.0 mg·L-16-BA and 0.5 mg·L-1NAA, with the highest multiplication coefficient of 7.69. The optimal medium for the root induction was 1/2MS medium with 0.5 mg·L-1NAA, which had the highest root induction rate of 100% and the average rooting coefficient of 5.68. Plants grew very well after transplanting with a survival rate of 97%.

Key words:Salvia hispanica； mature seed； tissue culture； rapid propagation

李偉麗,黃麗芳,夏新界.芡歐鼠尾草的組織培養(yǎng)和快速繁殖.草業(yè)科學(xué),2016,33(3)：393-399.

Li W L,Huang L F,Xia X J.Tissue culture and rapid propagation ofSalviahispanica.Pratacultural Science，2016,33(3)：393-399.

第一作者：李偉麗(1988-)，女，河南商水人，在讀碩士生，主要從事藥用植物品種選育與栽培技術(shù)工作。E-mail:wlli1127@126.com