韓露，張繼倬，陳興華

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院心外科，北京 100038）

尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響

韓露，張繼倬，陳興華

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院心外科，北京 100038）

目的探討尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法40只新西蘭家兔隨機分為4組，對照組（A組）、缺血組（B組）、再灌注組（C組）、尼卡地平組（D組）。通過結(jié)扎冠狀動脈左側(cè)旋支40 min，開放120 min建立缺血再灌注模型。采用磷脂酰絲氨酸外翻分析方法（Annexin V法）檢測家兔心肌凋亡情況。結(jié)果病理切片提示D組心肌細(xì)胞受損情況明顯低于B組和C組（P＜0.01）。D組心肌細(xì)胞凋亡明顯少于B組及C組（均P＜0.01），但高于A組（P＜0.05）；D組心肌細(xì)胞壞死少于B組及C組（均P＜0.01），與A組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論尼卡地平可以減少家兔缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

凋亡；尼卡地平；缺血再灌注；心肌細(xì)胞；Annexin V

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冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是影響人類健康的殺手之一，因病情嚴(yán)重需要行冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass graft，CABG）的患者越來越多，很多患者因為高齡，冠狀動脈病變嚴(yán)重，在手術(shù)麻醉誘導(dǎo)的時候會出現(xiàn)高血壓危象（特別是高血壓?、蠹墸?，導(dǎo)致心肌耗氧增加，從而發(fā)生急性心肌梗死等并發(fā)癥；另外心臟旁路移植手術(shù)能導(dǎo)致心臟缺血再灌注損傷，這些均是患者圍手術(shù)死亡的重要原因［1］。大量實驗及臨床觀察［2］表明心肌細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵性的作用。尼卡地平注射液是第二代二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，其靜脈制劑已經(jīng)廣泛用于治療原發(fā)性高血壓和圍術(shù)期高血壓［3］。尼卡地平能否在術(shù)前起到心肌缺血預(yù)適應(yīng)，術(shù)中、術(shù)后能否減輕患者的缺血再灌注損傷還不清楚。本實驗探討尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1　　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器

新西蘭家兔40只［興隆實驗動物養(yǎng)殖廠，許可證SYXK（京）2011?0018普通級］。主要試劑包括尼卡地平［安斯泰來制藥（中國）有限公司］、Annexin V（磷脂酰絲氨酸外翻分析）細(xì)胞凋亡試劑盒、PBS液、胰酶消化液（北京四正佰生物科技有限公司）。主要儀器有小動物呼吸機、動物監(jiān)測儀、流式細(xì)胞儀等。

1.2方法

1.2.1分組：隨機均分為4組，對照組（A組），僅穿線，不阻斷，160 min后直接取心肌標(biāo)本；缺血組（B組），穿線后阻斷，160 min后取心肌標(biāo)本；再灌注組（C組），穿線后阻斷缺血40 min，開放再灌注120 min后取心肌標(biāo)本；尼卡地平組（D組），手術(shù)開始前30min于家兔耳緣靜脈全程泵入尼卡地平［0.2 μg/（kg·min）］，穿線后阻斷缺血40 min，再灌注120 min后取心肌標(biāo)本。

1.2.2手術(shù)方法：所有家兔均經(jīng)耳緣靜脈注射20%烏拉坦注射液（1 g/kg）及10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉成功后，剪出頸部及胸部兔毛，經(jīng)口給予氣管插管（如家兔呼吸欠佳，給予小動物呼吸機輔助呼吸），取胸骨旁切口總切口，至劍突處約10 cm切口，游離劍突上3個肋骨，靠胸骨側(cè)剪斷劍突向上第二、三肋骨，游離相關(guān)組織，小型牽張器牽開，剪開縱行剪開心包（注意小心勿損傷胸膜）于左心耳下，心臟旋支起始處縫1針套環(huán)后收緊結(jié)扎。

1.2.3心肌細(xì)胞檢測：家兔安樂死后取左心耳結(jié)扎處下方心肌，用10%甲醛固定保存，做HE染色，切片，顯微鏡觀察心肌梗死病變情況。手術(shù)結(jié)束后根據(jù)分組情況取左心耳結(jié)扎處下方心肌（約5 g），PBS液保存。1 h內(nèi)將標(biāo)本經(jīng)小剪刀剪碎，經(jīng)PBS液沖洗3次，離心機離心去上清，0.25%的胰酶消化1 h，離心機離心取上清，加入100 μL結(jié)合緩沖液和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Annexin V（20 μg/mL）10 μL，室溫避光30 min，再加入碘化丙錠（50 μg/mL）5 μL，避光反應(yīng)5 min后，加入400 μL結(jié)合緩沖液，立即用Facscan進行流式細(xì)胞術(shù)檢測（一般不超過1 h），同時以不加Annexin V FITC及PI的一管作為陰性對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　　結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞染色結(jié)果比較

結(jié)果顯示，A組心肌可見肌纖維呈束狀排列，細(xì)胞染色正常，細(xì)胞核排列基本規(guī)則；B組心肌可見失去正常肌纖維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞染色異常，水腫明顯，細(xì)胞核固縮；C組可見正常肌纖維結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞染色異常，細(xì)胞水腫，細(xì)胞核排列不規(guī)則；D組可見間質(zhì)水腫輕，細(xì)胞染色基本正常，肌纖維排列基本正常。見圖1。

圖1　　各組心肌細(xì)胞染色結(jié)果比較 ×200Fig.1　Comparison of staining results of myocardial cells in each group×200

2.2各組心肌凋亡結(jié)果比較

結(jié)果顯示，D組心肌細(xì)胞的凋亡程度低于B組和C組（P分別為0.000 4，0.000 3，），高于A組（P= 0.034 3）。心肌細(xì)胞的壞死程度D組低于B組和C組（P分別為0.000 2，0.003 8，），但與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.106 3，）。見圖2、表1。

圖2　　流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡及壞死結(jié)果Fig.2　Flow cytometry instrument testing each cell apoptosis and necrosis

表1　　各組細(xì)胞凋亡及壞死情況比較（±s，%）Tab.1　Cell apoptosis and necrosis in each group（±s，%）

表1　　各組細(xì)胞凋亡及壞死情況比較（±s，%）Tab.1　Cell apoptosis and necrosis in each group（±s，%）

1）P＜0.05 vs groups A，B，and C；2）P＜0.01 vs groups B and C.

Group　n　Apoptosis　Necrosis n Percentage（%）　n　Percentage（%）A 10　1 981±1 325　22.00±2.94　202±111　2.99±0.48 B 10　12 713±3 937　28.64±2.67　3 243±1 174　18.64±3.88 C 10　13 676±3 404　34.15±9.18　3 181±2 339　11.41±2.88 D 10　3 599±1 639　22.39±3.441）　295±63　3.64±0.882）

3　　討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者很多需要行冠狀動脈旁路移植術(shù)，很多高齡患者冠狀動脈病變嚴(yán)重，術(shù)前有高血壓病史，在手術(shù)麻醉誘導(dǎo)的時候會出現(xiàn)高血壓危象，導(dǎo)致心肌耗氧增加而發(fā)生心肌缺血，甚至出現(xiàn)急性心肌梗死等并發(fā)癥，導(dǎo)致術(shù)中及術(shù)后循環(huán)不穩(wěn)，心肌酶升高等情況，從而危及患者生命。尼卡地平是術(shù)前患者用來降壓的藥物，除了降壓作用外是否還有其他改善心肌缺血的作用既往的文獻沒有報道［4］。本實驗結(jié)果顯示，D組心肌細(xì)胞的凋亡及壞死程度低于B組和C組（P＜0.01），可見尼卡地平可以減輕心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌細(xì)胞壞死。說明術(shù)前應(yīng)用尼卡地平對心肌進行缺血預(yù)適應(yīng)有一定作用，一定程度上能改善心肌缺血及再灌注損傷，從而改善心臟功能。雖然在細(xì)胞凋亡D組高于A組（P＜0.01），但在心肌壞死方面2者卻無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），說明尼卡地平缺血預(yù)適應(yīng)后無太多壞死心肌，與以往研究［5］結(jié)果一致。

尼卡地平是一種新型L型鈣離子拮抗劑，能抑制心肌與血管平滑肌的跨膜鈣離子內(nèi)流而不改變血鈣濃度，血管選擇性較強，在血管平滑肌作用勝于心肌。動物實驗中選擇性擴張冠狀血管平滑肌，此作用產(chǎn)生時的血藥濃度對心肌不產(chǎn)生負(fù)性肌力作用，對心律及心收縮力的影響極小。因而能改善冠狀動脈供血，減少心肌耗氧。研究［6-7］顯示尼卡地平分布于缺血的細(xì)胞膜，可以改善組織灌注及代謝紊亂，抑制細(xì)胞鈣內(nèi)流，減輕線粒體鈣超載，恢復(fù)三磷酸腺苷生成，減輕細(xì)胞內(nèi)乳酸中毒，降低細(xì)胞內(nèi)pH，從而改善心肌缺氧狀態(tài)，減少心肌凋亡的發(fā)生。通過動物實驗［8］證明尼卡地平在急性心力衰竭患者中可增加心臟指數(shù)、降低全身外周血管阻力，降低肺動脈楔壓，但對心率無影響。因而對心肌凋亡及壞死有一定的抑制作用。

綜上所述，尼卡地平對心肌缺血及再灌注損傷有缺血預(yù)適應(yīng)作用，可以減少缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及壞死。在選擇圍手術(shù)期降壓藥物方面，尼卡地平更有優(yōu)勢，今后應(yīng)進一步研究冠脈橋內(nèi)給予小劑量尼卡地平是否能進一步抑制心肌凋亡及壞死。

［1］SHARMA AK.OPCAB technique for high?risk patients（letter）［J］.Ann Thorac Surg，2012，94（10）：1036.DOI：10.1016/j.athorac?sur.2012.03.097.

［2］EMMERT MY，SALZBERG SP，SEIFERT B，et al.Routine off?pump coronary artery bypass grafting is safe and feasible in highrisk patients with left main disease［J］.Ann Thorac Surg，2010，89（11）25-30.DOI：10.1016/j.athoracsur.2009.12.059.

［3］黃正明.尼卡地平抗高血壓的藥理研究［J］.國外醫(yī)學(xué)：藥學(xué)分冊，2001，28（12）：110.DOI：10.13220/j.cnki.jipr.1991.02.018.

［4］BEKKER A，DIDEHVAR S，KIM S，et al.Efficacy of clevidipine in controlling perioperative hypertension in neurosurgical patients：ini?tial single?center experience［J］.J Neurosurg Anesthesiol，2010，22 （3）：330-335.DOI：10.1097/ANA.0b013e3181e3077b.

［5］TAGAKI H，WATANABE T，MIZUNO Y，et al.ALICE（All?Litera?ture Investigation of Cardiovascular Evidence）Group.A meta?analy?sis of adjusted risk estimates for survival from observational studies of complete versus incomplete revascularization in patients with multivessel disease undergoing coronary artery bypass grafting［J］. Interact Cardiovasc Thorac Surg，2014，18（6）：679-682.DOI：10.1093/icvts/ivu024.

［6］ZHANG WH，F(xiàn)U SB，LU FH，et al.Involvement of calcium?sensing receptor in ischemia/reperfusion?induced apoptosis in rat cardiomy?ocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，347（4）：872-881.DOI：10.1016/j.bbrc.2006.06.176.

［7］YAN N，SHI Y.Mechanisms of apoptosis through structural biology ［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2005，21（1）：35-56.DOI：10.1146/ annurev.cellbio.21.012704.131040.

［8］謝云燕，秦儉.烏拉地爾和尼卡地平靜脈用藥對老年高血壓急癥患者兒茶酚胺的影響［J］.心肺血管病雜志，2014，33（4）：521-524.DOI：10.3969/j.issn.1007-5062.2014.04.014.

（編輯武玉欣）

EffectsofNicardipineonApoptosisinIschemiaReperfusionMyocardiumofRabbits

HANLu，ZHANGJizhuo，CHENXinghua
（DepartmentofCardiacSurgery，BeijingShijitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100038，China）

ObjectiveTo investigate the effects of nicardipine on apoptosis in ischemia?reperfusion myocardium of rabbits.MethodsForty New Zealandrabbitwererandomlydividedinto4groups：controlgroup（group A），ischemiagroup（group B），ischemia?reperfusiongroup（group C），ni?cardipine treatment group（group D）.Ischemia?reperfusion model was established by left circumflex branch coronary artery ligation for 40 min，fol?lowedby120minreperfusion.Apoptoticcardiomyocytewasdetectedusingtheanalysisfortheexposureofphosphatidyl?serine（AnnexinV）meth?od.ResultsMyocardial celldamage waslower inDgroupthanthatingroupBandgroupCfrompathology（P＜0.01）.Themyocardial cellapopto?sis in group D is less than that of group B and group C（P＜0.01），but higher than that of group A（P＜0.05）.Myocardial cell necrosis is lower than group B and group C（P＜0.01），and no difference was found comparing with group A（P＞0.05）.ConclusionNicardipine horizon can reduce themyocardialcellapoptosisinrabbitswithmyocardialischemicreperfusioninjury.

apoptosis；nicardipine；ischemia?reperfusion；cardiomyocyte；anexin V

R654.2

A

0258-4646（2016）08-0746-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.018

韓露（1978-），男，主治醫(yī)師，博士. E-mail：moer031@163.com

2015-06-18
網(wǎng)絡(luò)出版時間：