朱海振，耿　濤，李雪濤，林　盛，韓　靜，江飛龍，陳光朋，譚詩生△，陳正堂▲

(1.貴州省人民醫(yī)院腫瘤科，貴陽 550002；2.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037；3.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000)

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利用分子信標檢測microRNA并成像肺癌干細胞的實驗研究*

朱海振1，耿濤1，李雪濤2，林盛3，韓靜2，江飛龍2，陳光朋2，譚詩生1△，陳正堂2▲

(1.貴州省人民醫(yī)院腫瘤科，貴陽 550002；2.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037；3.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000)

[摘要]目的利用miR-155分子信標(MB)檢測CD133+CD326+肺癌干細胞(LCSCs)中高表達的miR-155并成像肺癌干細胞。方法采用對A549細胞逆向誘導(dǎo)及紫杉醇富集的方法，通過流式細胞儀從A549細胞中分選出CD133+CD326+細胞，并對其干性進行鑒定。以殼聚糖納米(CS)作為載體轉(zhuǎn)染miR-155 MB，激光共聚焦顯微鏡檢測miR-155 MB對LCSCs中miR-155的識別功能并成像，并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進一步驗證。結(jié)果分選的CD133+CD326+細胞在干細胞培養(yǎng)基中成球生長，干性相關(guān)基因CD133、CD326、OCT-4、Nanog表達為A549細胞的3.27、3.39、6.01、3.42倍(P<0.05)，在細胞數(shù)為1×104數(shù)量下仍具備成瘤能力。CS轉(zhuǎn)染miR-155 MB后在A549及LCSCs中均可看到較強的紅色熒光，以LCSCs中熒光信號最強(P<0.05)，且熒光信號強弱趨勢與qRT-PCR檢測的miR-155的表達趨勢較一致。結(jié)論利用miR-155 MB能夠檢測LCSCs中高表達的miR-155并使其成像，為監(jiān)測并發(fā)現(xiàn)肺癌干細胞提供新思路。

[關(guān)鍵詞]腫瘤干細胞；肺腫瘤；A549；分子信標

近年來，我國肺癌發(fā)病率呈快速增長趨勢[1]。目前臨床上尚缺乏特異的、敏感的肺癌早期診斷分子靶標。腫瘤干細胞被認為是腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源,尋找肺癌干細胞有可能成為早期診斷的新突破點[2]。大量研究表明微小RNA(miRNA)廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等，識別肺癌干細胞相關(guān)miRNA并使之成像有可能成為肺癌早期診斷的重要策略[3]。分子信標(MB)是一種分子內(nèi)互補形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光標記的寡核苷酸序列，是一個非常敏感的檢測DNA、RNA和miRNA的方法，已被廣泛用于基因定量分析、疾病診斷和活體成像等研究領(lǐng)域[4]。因此，本研究擬利用miR-155 MB檢測CD133+CD326+肺癌干細胞(LCSCs)中高表達的miR-155并成像LCSCs，為監(jiān)測并發(fā)現(xiàn)LCSCs提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料A549肺腺癌細胞系購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)。選擇6周齡健康裸鼠，由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院動物中心提供。主要試劑：PRMI-1640、DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；重組人胰島素、重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)、牛血清清蛋白(BSA)粉劑購自美國Sigma公司；重組人表皮生長因子(EGF)購自美國Pepro Tech公司；標準胎牛血清(FBS)購自天津灝洋；鼠抗人CD133-PE、CD326-FITC流式抗體購自德國美天旎；山羊抗人CD326一抗購自美國Santa Cruz；兔抗人CD133購自美國abcam；逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自日本 TaKaRa公司；CD133、CD326、OCT-4、Nanog引物，部分堿基經(jīng)過鎖核酸修飾的miR-155 MB，陰性對照隨機序列分子信標(RS MB)即不和任何基因組序列結(jié)合的RS MB由上海生工合成；hsa-miR-155引物購于廣州銳博生物公司；殼聚糖納米(CS)由四川廣漢恒宇新材料公司惠贈。

1.2方法

1.2.1CD133+CD326+細胞的分選及培養(yǎng)CD133+CD326+細胞培養(yǎng)液DMEM/F12的配置：500 mL的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)加入2 g BSA，500 μL(50 μg/μL)重組人胰島素，500 μL(20 ng/μL)EGF，500 μL(10 ng/μL)bFGF，5 mL青霉素-鏈霉素雙抗。根據(jù)本課題組前期研究報道的分選干細胞[2]的方法，對A549細胞進行逆向誘導(dǎo)及紫杉醇富集，富集后根據(jù)抗體說明書，加入相對應(yīng)的鼠抗人CD133-PE和CD326-FITC流式抗體，濃度為1∶11，37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌后，避光流式細胞儀上機分選，分選后置入干細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并進行形態(tài)學觀察。

1.2.2免疫熒光取成球生長的CD133+CD326+細胞懸液，滴在載玻片并進行甩片，800 r/min，離心5 min，4%的多聚甲醛固定10 min，漂洗后滴加0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton)液，洗滌后滴加5%BSA封閉液，37 ℃孵育20 min，加入PBS稀釋的一抗兔抗人CD133和山羊抗人CD326，濃度均為1∶200，于4 ℃冰箱孵育過夜，充分漂洗后加入羊抗兔CD133-FITC及驢抗山羊CD326-CY3二抗，二抗的濃度均為1∶400，37 ℃孵育30 min，漂洗后4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察CD133和CD326的表達并拍照。

1.2.3干性基因檢測根據(jù)干細胞相關(guān)基因Oct-4、Nanog、CD133、CD326序列設(shè)計qRT-PCR引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，引物均由上海生工合成，序列如下：GAPDH上游5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′，下游5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′；CD326上游5′-AGT AAA AGT TTG CGG ACT GCA C-3′，下游5′-CTG GAA ATA ACC AGC ACA ACA A-3′；CD133上游5′-TCT CTA TGT GGT ACA GCC G-3′，下游5′-TGA TCC GGG TTC TTA CCT G-3′；Nanog上游5′-ATT TGC GGC CGC ATG AGT GTG GGT CTT C-3′，下游5′-CGG GAT CCT CAT ATT TCA CCT GGT GGA G-3′；Oct-4上游5′-AAG CTG CTG AAA CAG AAG AGG-3′，下游5′-ACA CGG TTC TCA ATG CTA GTC-3′。常規(guī)Trizol試劑提取A549、CD133+CD326+細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA及qRT-PCR操作均按照Takara試劑說明書操作。每個目的基因及內(nèi)參做3個復(fù)孔。以GAPDH基因為內(nèi)參基因，以CD133、CD326、Nanog、Oct-4作為目的基因，以A549細胞相對應(yīng)的表達量為1，計算CD133+CD326+細胞中干性相關(guān)基因的表達相對于A549細胞的倍數(shù)關(guān)系，實驗重復(fù)3次。

1.2.4裸鼠成瘤實驗雄性裸鼠18只，分為6組，每組3只，分別注射A549細胞數(shù)目為1×104、1×105和1×106，注射CD133+CD326+細胞數(shù)目為1×103、1×104和1×105。選取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好且能傳代的A549及CD133+CD326+細胞，無菌PBS充分洗滌后計數(shù)細胞數(shù)目，于小鼠右下背部皮下注射相對應(yīng)數(shù)目的CD133+CD326+細胞及A549細胞，每只總體積為150 μL。隨后每3天觀察細胞成瘤情況。

1.2.5激光共聚焦檢測對miR-155的識別成像功能及熒光強度分析取對數(shù)生長期的A549、LCSCs種板于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿內(nèi)，參考本課題組前期研究文獻[5]方法，按照WCS∶WMB質(zhì)量比為7∶1的比例將MB和CS混合，漩渦震蕩60 s，室溫靜置30 min，自組裝方法合成CS-mir-155 MB及CS-RS MB，miR-155 MB和RS MB的終濃度為200 nmol/L，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育120 min，無菌PBS充分漂洗后加入300 μL Hoechst 33342染細胞核，37 ℃ 20 min，漂洗后加入200 μL無菌PBS，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。拍照后，每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入1 mL細胞裂解液，使細胞充分裂解。取96孔黑板，每組加入100 μL細胞裂解液，設(shè)置6個復(fù)孔，Varioskan Flash多功能酶標儀檢測各組Cy5的熒光強度。

1.2.6qRT-PCR驗證常規(guī)Trizol試劑提取A549、LCSCs總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA及qRT-PCR操作均按照Takara試劑說明書操作。每個目的基因及內(nèi)參做3個復(fù)孔。以U6基因為內(nèi)參基因，以miR-155作為目的基因，以A549細胞miR-155表達量為1，計算LCSCs中miR-155的表達相對于A549細胞的倍數(shù)關(guān)系，實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1A549及CD133+CD326+細胞形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察到普通A549細胞為貼壁生長狀態(tài)，細胞形態(tài)為多角形、梭形。分選的CD133+CD326+細胞在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)后成球形生長，每個細胞球可見到由幾個到幾十個細胞融合而成球，細胞膜圓整，細胞質(zhì)折光度較好，見圖1。

A：A549細胞；B：CD133+CD326+細胞。

圖1A549細胞及CD133+CD326+細胞形態(tài)學觀察(×200)

圖2免疫熒光檢測CD133+CD326+細胞中CD133和CD326的表達(×400)

2.2免疫熒光結(jié)果分選的成球干細胞既有表達CD133的綠色熒光信號，又有表達CD326的紅色熒光信號，二者在細胞膜和細胞質(zhì)都有表達，藍色表示細胞核染色，見圖2。

2.3干性基因檢測結(jié)果成球生長的CD133+CD326+細胞高表達干性基因CD133、CD326、OCT-4和Nanog，為普通A549細胞的3.27、3.39、6.01、3.42倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分選的CD133+CD326+細胞具有干細胞特性，見圖3。

*:P<0.05，與A549細胞比較。

圖3qRT-PCR檢測A549及CD133+CD326+細胞中干性基因的表達

2.4裸鼠成瘤實驗在注射皮下腫瘤細胞15 d后可看到皮下移植瘤的產(chǎn)生。CD133+CD326+細胞在細胞數(shù)為1×105的數(shù)量下可以成瘤，進一步降低細胞數(shù)目為1×104數(shù)量下仍具備成瘤能力，1×103數(shù)量下細胞未能成瘤；而A549細胞能夠成功致瘤所需細胞數(shù)目為1×106，見表1。

表1　裸鼠皮下移植瘤成瘤實驗

2.5miR-155MB對miR-155的識別成像功能檢測及qRT-PCR驗證在有miR-155 MB存在的條件下，各組細胞均可檢測到較強的紅色熒光信號，大部分定位在細胞質(zhì)，少數(shù)定位在細胞核，其中LCSCs紅色熒光強度最強。而在陰性對照CS-RS MB中未檢測到明顯紅色熒光信號，見圖4A。 A549、LCSCs在CS轉(zhuǎn)染miR-155 MB平均熒光強度分別為27.78和64.64，比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4B。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)A549、LCSCs中均有miR-155的表達，LCSCs的miR-155的表達是A549細胞的2.63倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4C。在熒光強度分析中，LCSCs中miR-155的表達是A549細胞的2.33倍，熒光強弱趨勢與qRT-PCR中miR-155的表達趨勢較一致。

A：激光共聚焦檢測對miR-155的識別并成像(×800)；B：熒光強度分析；C：qRT-PCR檢測。*：P<0.05,與A549細胞比較。

圖4成像后熒光強度分析及qRT-PCR檢測miR-155的表達

3討論

目前我國肺癌發(fā)病率和病死率均居腫瘤首位，大多數(shù)患者確診時已屬ⅢB或Ⅳ期，失去了手術(shù)機會，5年生存率低于20%[6]。肺癌的早期診斷可以使患者能夠在早期得到合理地診治，大大降低治療成本及病死率，因此尋求早期診斷的生物學標志物是提高患者存活率的關(guān)鍵，也是當今肺癌研究的重要任務(wù)。

現(xiàn)有研究表明腫瘤干細胞是所有腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的根源，研究發(fā)現(xiàn)多種實體瘤組織及腫瘤患者血液中存在著腫瘤干細胞，這些腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[7]。因此尋找肺癌干細胞有可能成為早期診斷一個新的突破點，為肺癌的早期診斷提供新方法[8]。如果能夠直接攜帶熒光物質(zhì)靶定肺癌干細胞，將有望達到早期診斷肺癌的目的。

CD133已被研究證實可以作為大多數(shù)實體腫瘤干細胞分離和鑒定的通用分子標記物，其主要特點是在干細胞樣細胞中高表達，而在完全分化細胞中幾乎不表達；但也有研究認為把CD133作為肺癌干細胞的分子標記并不確切，需要聯(lián)合其他標記才有助于肺癌干細胞的檢測，肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤干細胞中也高表達CD326分子，這些細胞特別容易引發(fā)腫瘤[9-10]。因此，本研究基于以上研究背景，根據(jù)本課題組前期采用對A549細胞逆向誘導(dǎo)及紫杉醇富集的方法，從A549細胞系中分選出CD133+CD326+細胞，發(fā)現(xiàn)其在干細胞培養(yǎng)基中呈球形，懸浮生長。通過免疫熒光檢測懸浮的成球細胞均有CD133和CD326的表達，為CD133+CD326+細胞。qRT-PCR結(jié)果表明CD133+CD326+細胞高表達干細胞相關(guān)基因Oct-4、Nanog、CD133、CD326，且較普通A549細胞表達高。裸鼠成瘤實驗表明CD133+CD326+細胞致瘤能力更強，具有干細胞的特征。

miRNA是一類內(nèi)源性、單鏈非編碼小分子RNA，通過調(diào)控信號通路對腫瘤細胞的發(fā)生、增殖、凋亡、侵襲等重要生物學過程發(fā)揮作用[11]。miR-155是miRNA中常見的一種小分子RNA，與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后等密切相關(guān)[12]?，F(xiàn)有研究表明，miR-155在肺癌組織中顯著高表達，檢測肺組織內(nèi)的miR-155表達水平能區(qū)分肺癌患者與非肺癌患者，而且肺癌組織中miR-155高表達的患者，其生存期更短[13]。表明肺癌細胞或肺癌干細胞中高表達的miR-155分子有可能成為肺癌早期診斷的分子靶標。本研究也發(fā)現(xiàn)miR-155在分選的CD133+CD326+肺癌干細胞中高表達。

MB是一個非常敏感的檢測DNA、RNA和miRNA的方法，為通過識別基因分子并成像腫瘤細胞提供了可能。殼聚糖為一種天然陽離子多糖，而基因分子本身帶有負電荷，二者可以通過靜電作用自組裝方式形成核殼結(jié)構(gòu)，并被廣泛用于介導(dǎo)質(zhì)粒、siRNA等基因轉(zhuǎn)染，CS已作為理想的基因載體廣泛應(yīng)用于細胞和動物水平實驗[14]。因此，本研究利用CS作為miR-155 MB載體，激光共聚焦檢測表明在有miR-155 MB存在的條件下，A549、LCSCs中可檢測到較強的紅色熒光信號，且以LCSCs紅色熒光強度最強，而陰性對照RS MB未檢測到明顯紅色熒光信號。熒光強度分析表明以肺癌干細胞中熒光信號最強，同時通過qRT-PCR進一步檢測表明用CS轉(zhuǎn)染MB后的熒光強弱趨勢與qRT-PCR中miR-155的表達趨勢較一致，表明可以利用miR-155 MB通過檢測細胞高表達的miR-155并成像肺癌干細胞，可以有效地達到識別腫瘤干細胞的目的，從而為肺癌的早期診斷提供新思路、新方法。

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doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.003

*基金項目：國家高技術(shù)發(fā)展研究計劃“863”項目(2007AA02Zl29)；國家自然科學基金面上項目(81071786)。

作者簡介：朱海振(1984-)，住院醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤干細胞、miRNA研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：tssh18018@126.com；▲ 共同通訊作者，E-mail：czt05@163.com。

[中圖分類號]R734.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2036-04

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-21)

Using molecular beacon for detecting microRNA and imaging lung cancer stem cells research*

Zhu Haizhen1,Geng Tao1,Li Xuetao2,Lin Sheng3,Han Jing2,Jiang Feilong2,ChenGuangpeng2,TanShisheng1△,ChenZhengtang2▲

(1.DepartmentofOncology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.InstituteofCancer,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;3.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the miR-155 in the CD133+ CD326+ cells(LCSCs) and imaging them by using the miR-155 molecular beacon (MB).MethodsA549 cells were cultured in the serum-free stem cell medium and treated by paclitaxel until new spheroids emerged;then we sorted the CD133+ CD326+ cells by flow cytometry and identified their stem characteristics.Chitosan nanoparticles(CS) were adopted to deliver the miR-155 MB.The laser confocal microscopy was used to detect and image the miR-155 in LCSCs.The miR-155 expression level was verified by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR).ResultsThe LCSCs formed the sphere in stem cell culture medium,the stem genes (CD133,CD326,OCT-4,Nanog) expression levels were 3.27，3.39，6.01，3.42 times higher than those of A549 cells(P<0.05).1×104 cells formed the subcutaneous transplanted tumors.The red fluorescence was detected in the A549 and LCSCs when CS transfect the miR155 MB,and the fluorescent signal of LCSCs was the highest(P<0.05).The fluorescence intensity was proximately consistent with the level of miR-155 expression determined by qRT-PCR.ConclusionUsing the miR-155 MB could detect the miR-155 in the LCSCs and image them.It might be a new idea for monitoring the lung cancer stem cell.

[Key words]neoplastic stem cell；lung neoplasms；A549;molecular beacon