王娜　范玉琛　王凱

250012 濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科；山東大學(xué)肝病研究所

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白細(xì)胞介素-10在慢性乙型肝炎患者中的表達(dá)及臨床意義

王娜范玉琛王凱

250012 濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科；山東大學(xué)肝病研究所

【摘要】目的探討慢性乙型肝炎患者不同臨床免疫分期白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-10及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor，TNF)-α的表達(dá)規(guī)律及臨床意義。方法采用回顧性方法共納入慢性乙型肝炎患者197例，其中免疫耐受期40例、免疫清除期97例、低復(fù)制期26例和再活動期(HBeAg陰性慢性乙型肝炎)34例，選擇18例健康志愿者為正常對照。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測血漿IL-10、IL-6和TNF-α水平，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法檢測外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中IL-10、IL-6和TNF-α的mRNA水平。結(jié)果慢性乙型肝炎患者血漿和PBMCs中IL-10、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均高于正常對照組(P< 0.05)。慢性乙型肝炎患者血漿IL-10蛋白及mRNA水平與血清ALT、AST和IL-6呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，與 TNF-α呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。免疫清除期患者血漿IL-10水平和PBMCs IL-10 mRNA水平明顯高于免疫耐受期和低復(fù)制期患者(P<0.05)，再活動期患者PBMCs IL-10 mRNA水平明顯高于免疫耐受期(P<0.05)。結(jié)論IL-10在慢性乙型肝炎的免疫病程中具有重要作用。

【主題詞】肝炎，乙型，慢性；免疫分期；白細(xì)胞介素-10; 白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81201287, 81171579, and 81371832), Key Project of Chinese Ministry of Science and Technology (2012ZX10002007 and 2013ZX10002001), and Science and Technology Development Plan of Shandong Province (2014GSF118068)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染嚴(yán)重威脅人類健康，全世界大約有3.5～4.0億HBV攜帶者。HBV急性感染后，若機(jī)體免疫功能不全，可發(fā)展為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)。根據(jù)免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，CHB一般可分為4個不同的臨床分期，即免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期和再活動期，再活動期又成為HBeAg陰性的CHB，由于其特有的臨床特點(diǎn)近年來逐漸引起重視[1]。白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-10是一種免疫和炎癥抑制因子，可參與Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的重要因素[2]。本研究通過檢測CHB患者不同臨床免疫分期IL-10及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)，探討IL-10在CHB免疫分期進(jìn)展中的作用及臨床意義。

1對象與方法

1.1研究設(shè)計(jì)本研究采用回顧性方法共納入197例CHB患者，包括免耐受期40例、免疫清除期97例、低復(fù)制期26例和再活動期34例，均為2013年10月至2015年3在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科住院或門診就診的患者。我們還選擇了18例健康志愿者作為正常對照。

1.2病例選擇參照2010 年《慢性乙型肝炎防治指南》[1]，根據(jù)慢性乙型肝炎的自然病史將病例組分為4組：免疫耐受期組(HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、血清HBV DNA載量>106IU/ml、既往1年內(nèi)至少3次檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)≤ 40 U/L、肝臟B超未見肝實(shí)質(zhì)回聲增粗或肝硬化征像)、免疫清除期組(HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、血清HBV DNA載量>2 000 IU/ml、ALT>40 U/L)、低復(fù)制期組(HBsAg陽性、HBeAg陰性、HBeAb陽性、血清HBV DNA載量<100 IU/ml、1年內(nèi)至少3次檢測血清ALT≤ 40 U/L)及HBeAg陰性CHB(HBsAg陽性、HBeAg陰性、HBeAb陽性、血清HBV DNA載量>2 000 IU/ml、ALT>40 U/L)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并人類免疫缺陷病毒感染或者其他類型肝炎病毒感染，自身免疫性肝炎，代謝性肝病，嚴(yán)重的酗酒史，妊娠，以及患有肝細(xì)胞癌。研究方案遵守赫爾辛基宣言，保護(hù)受試者權(quán)利，所有研究對象在研究開始前遵循知情同意的原則，自愿入組，所有研究計(jì)劃均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3標(biāo)本采集采取所有入組患者治療前晨起空腹靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，于室溫下2 000 rpm、離心5 min。分離上層血漿于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。用TriZol法提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板。取少量樣品于分光光度計(jì)下檢測RNA濃度及OD260/280，其余置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4血漿中IL-10、IL-6和TNF-α水平檢測采用ELISA法檢測血漿IL-10、IL-6和TNF-α水平。檢測試劑盒均購自美國Abcam公司，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將標(biāo)本平衡至室溫，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本和對照，每空內(nèi)分別加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品或者待測樣本，室溫下孵育2 h,棄去液體，洗板4次，甩干；然后在各孔中加入抗生物素抗體100 μl，室溫下孵育1 h，棄去液體，洗板4次，甩干。加入100 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，室溫孵育45 min，棄去液體，洗板4次，甩干。每孔加入100 μl顯色液，室溫避光孵育20 min，加入50 μl終止液終止反應(yīng)，立即用全自動酶標(biāo)儀在450 nm處檢測每孔的吸光度并自動換算為濃度值。

1.5外周血單個核細(xì)胞IL-10、IL-6和TNF-α mRNA的檢測IL-10、IL-6和TNF-α基因引物參考既往文獻(xiàn)，以β-actin為內(nèi)參，上海生工生物工程有限公司合成。實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時定量PCR(real-time PCR, RT-PCR) 96孔板，反應(yīng)體系20 μl：SYBR Green Premix 10 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物0.4 μl，加高壓滅菌蒸餾水8.2 μl至終體積20 μl，瞬離后置于Roche RT-PCR儀中。IL-10的上游引物：5′-ATGCTTCGAGATCTCCGAGA -3’，下游引物：5’-AAATCGATGACAGCGCCGTA -3’。IL-6的上游引物：5’-ACCCCTGACCCAACCACAAAT -3’，下游引物：5’-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTT -3’。TNF-α的上游引物：5’-AAGCCTGTAGCCCATGTTGT -3’，下游引物：5’-CAGATAGATGGGCTCATACC -3’。β-actin的上游引物：5’-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG -3’，下游引物：5’-CTTCATGAGGTAGTCAGTCAGGTC -3’。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃45 s，72℃l min，45個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)體系充分混勻后，離心3000 rpm 3 min，在RT-PCR 儀機(jī)器上應(yīng)用LightCycler 480軟件進(jìn)行分析。通過溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定基因擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。β-actin作為內(nèi)參計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較釆用Kmskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩組間比較采用Mann -Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性分析用Spearman秩和相關(guān)分析。雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1入組患者一般情況和臨床特點(diǎn)本研究共納入197例CHB患者,年齡40(28～47.5)歲，男性147例，女性50例；健康對照者18例年齡34.5(29.7～-41.5)歲，男性14例，女性4例；兩組患者在年齡、性別均無差異。不同臨床免疫分期患者ALT、AST、TBIL和 ALB水平均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2慢性乙型肝炎和健康對照組IL-10及其相關(guān)細(xì)胞因子的比較CHB患者IL-10、IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平均高于正常對照組(P<0.05)。HBeAg陽性組患者血漿IL-10水平明顯高于HBeAg陰性組(Z=-2.591，P=0.01)。而HBVDNA陽性和HBVDNA陰性的慢性乙型肝炎患者血漿IL-10水平和PBMCsIL-10 mRNA水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-1.915,P=0.099；Z=-1.648,P=0.055)。

2.3慢性乙型肝炎患者血漿IL-10蛋白及mRNA水平與IL-10相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)分析Spearman秩和相關(guān)分析結(jié)果表明，在基因水平，CHB患者PBMCsIL-10 mRNA與IL-6蛋白及mRNA水平呈明顯正相關(guān)(r=0.165，P<0.05;r=0.344，P<0.01)，與血漿TNF-α蛋白及mRNA呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.153，P<0.05;r=-0.306，P<0.01)。在蛋白水平，CHB患者血漿IL-10水平與IL-6蛋白及mRNA水平呈明顯正相關(guān)(r=0.514，P<0.01;r=0.400，P<0.01)，和血漿TNF-α蛋白及mRNA呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.363，P<0.01;r=-0.249，P<0.01)。詳見表1。

2.4慢性乙型肝炎患者血漿IL-10蛋白及mRNA水平與肝功能指標(biāo)的關(guān)系CHB患者血漿IL-10蛋白及mRNA水平與血清ALT呈明顯正相關(guān)(r=0.265，P<0.01；r=0.394，P<0.01)，血漿IL-10蛋白及mRNA水平與血清AST水平呈明顯正相關(guān)(r=0.184，P=0.01；r=0.290，P<0.01)。此結(jié)果顯示，CHB患者IL-10的表達(dá)水平與肝臟損傷程度密切相關(guān)。血漿IL-10蛋白及mRNA水平與ALB、TBIL水平不具有相關(guān)性(P>0.05)。詳見表1。

表1　慢性乙型肝炎患者血漿IL-10表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)以及IL-10相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)分析

2.5慢性乙型肝炎患者免疫分期中IL-10及其相關(guān)細(xì)胞因子在蛋白及mRNA水平的比較Kruskal-Wallis 分析顯示，血漿IL-10及 mRNA在不同免疫分期組中有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在蛋白水平，免疫清除期患者血漿IL-10水平明顯高于免疫耐受期(P=0.027)和低復(fù)制期(P=0.032)，血漿IL-10水平在再活動期和免疫耐受期(P=0.515)、再活動期與免疫清除期(P=0.390)、再活動期和低復(fù)制期(P=0.359)、免疫耐受期與低復(fù)制期(P=0.730)無明顯差異。在基因水平，免疫清除期PBMCsIL-10mRNA明顯高于免疫耐受期(P<0.001)和低復(fù)制期(P=0.022)，再活動期PBMCsIL-10mRNA明顯高于免疫耐受期(P=0.01)，PBMCsIL-10 mRNA水平在再活動期與免疫清除期(P=0.462)、再活動期與低復(fù)制期(P=0.422)、免疫耐受期與低復(fù)制期(P=0.430)無明顯差別。血漿IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平在不同免疫分期組中的變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表2。

表2　慢性乙型肝炎患者免疫分期中血漿IL-10、IL-6和TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平

3討論

IL-10是一種單鏈糖蛋白，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，是體內(nèi)重要的抗炎細(xì)胞因子。研究表明，IL-10可能參與影響HBV感染的臨床轉(zhuǎn)歸, 高水平IL-10不利于HBV的清除, 可能與HBV感染慢性化有關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示CHB患者血漿IL-10水平和PBMCsIL-10 mRNA 水平均高于健康對照組，提示IL-10參與了CHB的發(fā)生發(fā)展過程。我們還檢測了IL-10相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的基因和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在CHB患者中，IL-6和TNF-α表達(dá)也比健康對照組明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了IL-10在CHB發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者血漿IL-10水平和PBMCsmRNA水平與血清ALT和AST水平呈明顯正相關(guān)，高度提示IL-10可參與CHB患者肝臟的炎癥損傷過程。IL-10表達(dá)水平與IL-6水平呈明顯正相關(guān)，與TNF-α呈明顯負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步揭示了IL-10可能通過細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控參與肝臟的免疫炎癥損傷。

我們還進(jìn)一步研究了IL-10與HBV病毒復(fù)制的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組患者血漿IL-10蛋白水平明顯高于HBeAg陰性組，而HBV DNA與IL-10表達(dá)水平無明顯相關(guān)。這些結(jié)果提示，IL-10與病毒復(fù)制無明確關(guān)系，這也與既往研究一致，一般認(rèn)為，HBV本身并不會直接引起細(xì)胞和炎癥損傷。而HBeAg表達(dá)水平與IL-10似乎有一定的關(guān)聯(lián)，可能與HBeAg導(dǎo)致CHB患者外周血Thl/Th2型細(xì)胞因子失衡有關(guān)[5]，還需要進(jìn)一步研究。

CHB的自然史是一個動態(tài)過程，可經(jīng)歷免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期和HBeAg陰性慢性乙型肝炎(再活動期)共四個不同的臨床免疫階段[1]。免疫耐受期和低復(fù)制期為相對穩(wěn)定的狀態(tài)，一般不需要進(jìn)行抗病毒治療。而免疫清除期和再活動期為免疫激活狀態(tài)，此時機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動清除病毒過程，肝臟反復(fù)炎癥，需要進(jìn)行抗病毒治療[6]。HBeAg陰性的CHB患者更易進(jìn)展為肝硬化和原發(fā)性肝癌，對抗病毒治療的持久應(yīng)答率更低[1]。我們發(fā)現(xiàn)，免疫清除期血漿IL-10水平和PBMCsIL-10 mRNA 水平均高于免疫耐受期和低復(fù)制期, 再活動期PBMCsIL-10 mRNA水平明顯高于免疫耐受期，提示在CHB感染中，IL-10可能與免疫激活有關(guān)?？赡苁且?yàn)樵贑HB感染過程中大量細(xì)胞炎癥因子釋放，進(jìn)而刺激IL-10的表達(dá)用以抑制細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)CHB免疫清除期IL-10水平明顯升高，IL-10表達(dá)水平與疾病免疫分期和炎癥程度密切相關(guān)，IL-10在CHB的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

4參考文獻(xiàn)

[1]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎治指南(2010年版).中華肝臟病雜志,2011,19:13-24. doi: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.01.007.

[2]Xu L, Yin W, Sun R, et al. Kupffer Cell-Derived IL-10 Plays a Key Role in Maintaining Humoral Immune Tolerance in Hepatitis B Virus-Persistent Mice . Hepatology， 2014，59:443-452. doi: 10.1002/hep.26668.

[3]何文敏,蘇毅. IL-10和IL-17在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝硬化合并腹腔感染中的研究進(jìn)展. 世界華人消化雜志,2014,22:333-339. doi: http://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v22.i3.333.

[4]Gong Y, Zhao C, Zhao P, et al. Role of IL-10-Producing Regulatory B Cells in Chronic Hepatitis B Virus Infection . Dig Dis Sci， 2015，60:1308-1314. doi: 10.1007/s10620-014-3358-1.

[5]韓亞萍,李軍,蔣龍鳳，等.HBeAg導(dǎo)致慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡.中華肝臟病雜志, 2013,21:584-589. doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2013.08.006.

[6]Gish RG, Given BD, Lai CL, et al. Chronic hepatitis B: Virology, natural history, current management and a glimpse at future opportunities . Antiviral Res，2015，121:47-58. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.06.008.

通信作者：王凱， Email：wangdoc2010@163.com; wangdoc876@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.023

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81201287、81171579、81371832)，國家十二五科技重大專項(xiàng)(2012ZX10002007、2013ZX10002001)，山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GSF118068)

(收稿日期：2015-11-21)

Interleukin-10 is associated with immune phases of patients with chronic hepatitis B

WangNa,FanYuchen,WangKai

DepartmentofHepatology,QiluHospitalofShandongUniversity;InstituteofHepatology,ShandongUniversity,Jinan250012,ChinaCorrespondingauthor:WangKai，Email：wangdoc2010@163.com，wangdoc876@126.com

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression of interleukin(IL)-10 and its associated cytokines in different immune phases of patients with chronic hepatitis B. MethodA total of 197 patients with chronic hepatitis B were included, including 40 for immune tolerance(IT)phase, 97 immune clearance (IC) phase, 26 low replication (LR) phase, and 34 for HBeAg negative hepatitis B (ENH) phase. The level of IL-10, IL-6 and TNF-α in plasma was determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The level of IL-10, IL-6 and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was determined using quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsThe plasma levels of IL-10, IL-6 and TNF-α in chronic hepatitis B patients were significantly higher than healthy controls (all P< 0.05), as well as mRNA levels of these cytokines shared the same condition. The plasma level of IL-10 and IL-10 mRNA level in PBMCs were significantly correlated with ALT, AST and IL-6 (P<0.05)and negatively correlated with TNF-α (P< 0.05).The levels of plasma IL-10 and IL-10 mRNA in patients with immune clearance phase was significantly higher than patients with immune tolerance phase and low replication phase(P<0.05). IL-10mRNA in patients with HBeAg negative hepatitis B phase was higher than that with immune tolerance phase (P< 0.05). ConclusionIL-10 might contribute to immune phases of chronic HBV infection.

【Key words】Hepatitis B, chronic; Immune phases; Interleukin 10; Interleukin 6;Tumornecrosis factor-α