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      多酚化合物體外模擬消化的穩(wěn)定性分析

      2016-08-10 07:24:28王謝祎翟宇鑫戴濤濤劉繼延劉成梅南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西南昌330047江西齊云山食品有限公司江西贛州34000
      食品科學(xué) 2016年13期
      關(guān)鍵詞:高效液相色譜

      李 俶,王謝祎,翟宇鑫,戴濤濤,陳 軍,*,劉繼延,劉成梅(.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047;.江西齊云山食品有限公司,江西 贛州 34000)

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      多酚化合物體外模擬消化的穩(wěn)定性分析

      李 俶1,王謝祎1,翟宇鑫1,戴濤濤1,陳 軍1,*,劉繼延2,劉成梅1
      (1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047;2.江西齊云山食品有限公司,江西 贛州 341000)

      摘 要:選取7 種不同種類的酚類化合物,研究體外模擬胃腸道消化對(duì)其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明:不同酚類化合物在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性不同。高效液相色譜分析結(jié)果顯示,胃消化過程對(duì)酚酸類化合物的影響較小,其含量無顯著變化,但類黃酮化合物在胃消化過程中穩(wěn)定性較差,兒茶素含量下降了16.6%、表兒茶素含量下降了約6%。經(jīng)模擬腸液處理后,除阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸外,其他酚類化合物含量均顯著降低,此外,綠原酸在腸液消化過程中生成了新的物質(zhì)。體外模擬胃腸液消化對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的作用結(jié)果有所不同,模擬胃液消化對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品含量均無顯著影響,模擬腸液消化后,僅表兒茶素、沒食子酸含量分別降低為76.96%和50.30%,其他酚類化合物含量均無顯著變化。

      關(guān)鍵詞:酚類化合物;體外模擬消化;高效液相色譜

      引文格式:

      李俶, 王謝祎, 翟宇鑫, 等.多酚化合物體外模擬消化的穩(wěn)定性分析[J].食品科學(xué), 2016, 37(13): 1-5.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613001. http://www.spkx.net.cn

      LI Ti, WANG Xieyi, ZHAI Yuxin, et al.Stability of polyphenols during in vitro digestion[J].Food Science, 2016, 37(13): 1-5.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613001. http://www.spkx.net.cn

      多酚化合物是廣泛存在于植物中的次級(jí)代謝產(chǎn)物,在植物中的含量僅次于木質(zhì)素[1],普遍存在于水果、蔬菜、堅(jiān)果和谷物中[2-5]。多酚化合物具有多種生物活性,如抗氧化性[5-7]、抗菌[8-11]、抗癌[12-14]等。

      大量的研究表明,自由基和脂質(zhì)過氧化是引起心血管疾病、癌癥、腫瘤及衰老的重要原因[15]。植物中的多酚化合物可以有效清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化[16]。經(jīng)常食用富含多酚化合物的水果和蔬菜可以減小患心腦血管疾病、癌癥、糖尿病、衰老等退行性疾病的概率[17-18]。

      多酚化合物雖然具有多種生理活性,但是其對(duì)溫度、pH值、氧氣和光較為敏感,這些因素都會(huì)顯著地影響多酚化合物的穩(wěn)定性,降低多酚化合物的生物利用度,進(jìn)而降低其在人體內(nèi)的生物活性。此外,任何一種生物活性物質(zhì)在發(fā)揮其作用之前,都要經(jīng)過人體的胃腸道消化,而消化也會(huì)對(duì)多酚化合物的生物活性產(chǎn)生影響。目前對(duì)多酚化合物大部分的研究主要集中在對(duì)某一植物或其提取液總多酚含量及其抗氧化性的影響方面,但是關(guān)于消化對(duì)多酚單體影響的研究目前較少。因此,本實(shí)驗(yàn)選取了果蔬中常見的幾種酚類化合物,研究體外模擬胃腸道消化對(duì)其穩(wěn)定性的影響,為多酚化合物保健食品的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供一些理論參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      標(biāo)準(zhǔn)品表兒茶素、兒茶素、沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸(純度>99.9%) 阿拉丁試劑(上海)有限公司。

      胃蛋白酶(≥250 U/mg)、胰蛋白酶(8×USP)、牛膽酸鈉 美國Sigma公司;MD44透析袋 北京索萊寶公司;NaCl、NaHCO3、HCl均為分析純,乙腈、乙酸均為色譜純 西隴化工股份有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      HH-4型恒溫?cái)?shù)顯水浴搖床 金壇市城西曉陽電子儀器廠;AR1140型分析天平 美國Oahus公司;安捷倫1260型高效液相色譜 美國Agilent公司;SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國Waters公司。

      1.3 方法

      1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

      各準(zhǔn)確稱取100.00 mg表兒茶素、兒茶素、沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL不同的具塞比色管中,無水乙醇定容至5 mL,混勻備用。

      單一標(biāo)準(zhǔn)品:準(zhǔn)確吸取上述1.00 mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL不同的具塞比色管中,無水乙醇定容至10 mL,配制成2 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液,4 ℃保存待分析。分析前用0.22 μm濾膜過濾。

      混合標(biāo)準(zhǔn)品:準(zhǔn)確吸取上述1.00 mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液混合于同一10 mL具塞比色管中,無水乙醇定容至10 mL,配制成相同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分析前用0.22 μm濾膜過濾。

      1.3.2 高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)條件

      HPLC儀:Agilent 1260 Infinity,色譜柱:SunFire C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:A液(乙腈-0.5%乙酸水(1∶1,V/V))、B液(0.2%乙酸水),紫外檢測波長:280 nm,流動(dòng)相流速:0.7 mL/min,柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表1。

      表 1 HPLC色譜條件Table 1 HPLC chromatographic conditions時(shí)間/min A液體積分?jǐn)?shù)/% B液體積分?jǐn)?shù)/% 0 10 90 10 15 85 15 15 85 20 25 75 50 55 45 55 100 0 60 90 10

      1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

      精確移取1.3.1節(jié)所制備的各標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中,用超純水定容,進(jìn)樣前以0.22 μm濾膜過濾。以峰面積為縱坐標(biāo),樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各多酚化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表2。

      表 2 各多酚化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 2 Linear regressionequations of 7 phenolic compounds組分 回歸方程 R2相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/% 加樣回收率/%表兒茶素 y=9 474.3x-70.47 0.999 3 0.56 98.2兒茶素 y=8 622.2x-389.77 0.998 4 1.06 99.1綠原酸 y=21 450x-380.63 0.999 8 0.37 100.3咖啡酸 y=37 954x-761.79 0.999 0 1.21 103.7阿魏酸 y=44 374x-435.02 1.000 0 0.08 105.1沒食子酸 y=33 262x-181.82 0.999 7 0.72 97.5對(duì)羥基苯甲酸 y=17 213x-17.196 1.000 0 0.20 100.8

      1.3.4 體外模擬胃腸道消化[19-20]

      模擬人體腸道溫度和酸堿度環(huán)境,測定消化對(duì)所選單一標(biāo)準(zhǔn)品和混合標(biāo)準(zhǔn)品的影響。體外模擬消化過程分為兩個(gè)階段:模擬胃液消化和模擬腸道消化。

      以0.1 mol/L HCl溶液配制4 mg/mL胃蛋白酶溶液,以0.1 mol/L NaHCO3溶液配制胰液膽汁混合液(2 mg/mL胰液、12 mg/mL膽汁)。

      模擬胃液消化:分別于兩個(gè)10 mL具塞比色管中加入4 mL 9 mg/mL的NaCl溶液和4 mL 4 mg/mL的活性胃蛋白酶溶液,混勻,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值至2.0~2.5。加入1 mL 2 mg/mL各標(biāo)準(zhǔn)品溶液或混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于37 ℃、100 r/min水浴振蕩1 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積后凍干,以超純水定容至10 mL。HPLC分析前用0.22 μm濾膜過濾。

      模擬腸液消化:用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)上述胃液pH 6.5~7.0,于37 ℃、100 r/min水浴振蕩45 min,加入活性胰液-膽汁混合液1.8 mL,調(diào)節(jié)pH 7.0~7.5,進(jìn)行模擬腸液消化2 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積后凍干,超純水定容至10 mL。分析前用0.22 μm濾膜過濾。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 線性關(guān)系考察

      如圖1所示,梯度洗脫后混合標(biāo)準(zhǔn)品得到了較好的分離。比較單一標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間,可確定混合標(biāo)準(zhǔn)品中各物質(zhì)的洗脫順序,其中包括酚酸:苯甲酸類(沒食子酸、對(duì)羥基苯甲酸)、肉桂酸類(綠原酸、咖啡酸、阿魏酸);類黃酮類(兒茶素、表兒茶素)共7 種酚類單體樣品。

      2.2 體外消化對(duì)單一多酚化合物的作用結(jié)果

      注:同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05);表中數(shù)據(jù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。下同。

      如圖2和表3所示,模擬胃腸液消化對(duì)不同的酚類化合物作用效果不同。模擬胃液消化對(duì)酚酸類化合物(綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸和對(duì)羥基苯甲酸)的影響較小,各酚酸類化合物含量無顯著變化,但對(duì)類黃酮類化合物影響較明顯,二者含量顯著降低,其中兒茶素含量下降最明顯,降幅為16.60%,表兒茶素次之,降幅約為6%。除阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸外,模擬腸道消化對(duì)其他酚類單體含量均有顯著影響(P<0.05),各酚類化合物在腸液中含量依次為:阿魏酸=對(duì)羥基苯甲酸>咖啡酸>表兒茶素>兒茶素>綠原酸>沒食子酸,但與模擬胃液消化后各酚類單體含量相比,模擬腸液消化后下降幅度由高到低依次為:沒食子酸(71%)>綠原酸(35%)>表兒茶素(16%)= 咖啡酸(16%)>兒茶素(9%)>對(duì)羥基苯甲酸=阿魏酸(0%)。由以上結(jié)果可知,模擬腸液消化對(duì)沒食子酸、綠原酸的作用效果比類黃酮類化合物明顯;類黃酮類化合物中的兒茶素的含量在模擬腸液消化過程中變化最小,即在所選7 種酚類化合物中,沒食子酸和綠原酸在模擬腸液中最不穩(wěn)定,而阿魏酸和對(duì)羥基苯甲酸最穩(wěn)定。

      如圖2所示,綠原酸在模擬腸液環(huán)境中除了自身含量下降的同時(shí)還生成了新的物質(zhì),即產(chǎn)生了新的吸收峰。據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道,腸液環(huán)境中綠原酸含量下降的同時(shí)常伴隨異構(gòu)化生成新綠原酸或隱綠原酸。

      Tenore等[22]發(fā)現(xiàn)44.4%和91.8%的兒茶素在胃、腸消化液中含量有所損失,他們認(rèn)為是由于兒茶素對(duì)胃腸道的酸堿pH值敏感而引起的,腸道堿性環(huán)境和溶解氧引起了兒茶素二聚體自氧化,而VC具有的顯著抗氧化性,可增強(qiáng)兒茶素在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性,減少其損失。任淑萌[23]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的阿魏酸降解速度較慢,且在趨于中性條件下穩(wěn)定性最高,轉(zhuǎn)化速率常數(shù)最低,酸性條件下其穩(wěn)定性有所降低,堿性條件下最低。

      2.3 體外模擬消化對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的作用結(jié)果

      酚類化合物單體間由于結(jié)構(gòu)不同易發(fā)生空間阻礙或相互作用,進(jìn)而影響其穩(wěn)定性和生物活性等。胃腸液消化環(huán)境較復(fù)雜,影響因素眾多,酚類化合物在消化過程中結(jié)構(gòu)和含量都會(huì)發(fā)生一定的變化。為了進(jìn)一步研究酚類化合物在胃腸液消化環(huán)境中存在的相互影響,本實(shí)驗(yàn)將所選多酚標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合,以混合標(biāo)準(zhǔn)品形式進(jìn)行胃腸液消化,以觀察酚類化合物間結(jié)構(gòu)與含量在模擬胃腸液中的變化,結(jié)果見圖3。

      表4胃腸液消化后混合標(biāo)準(zhǔn)品含量變化Table 4 Changesin theamountsofmixed standards after in vitro gastrointestinal digestion組分 初始 模擬胃液消 模擬腸液添加量/%化后含量/%消化后含量/%表兒茶素 100.00a101.25±1.46a76.96±2.68b兒茶素 100.00a100.75±1.31a100.80±4.87a綠原酸 100.00a109.31±6.70a103.27±1.11a咖啡酸 100.00a107.43±2.69a102.70±5.93a阿魏酸 100.00a105.04±1.86a106.77±2.31a沒食子酸 100.00a102.10±0.74a50.30±1.89b對(duì)羥基苯甲酸 100.00a103.98±1.08a103.85±3.30a

      如圖3和表4所示,與單一標(biāo)準(zhǔn)品作用效果比較,模擬胃腸道消化對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的作用效果有所不同。模擬胃液消化對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品影響較小,各酚類化合物含量均無顯著變化,模擬腸液消化對(duì)各酚類化合物影響則不同,兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸含量均無顯著變化,表兒茶素、沒食子酸含量均下降顯著(P<0.05),降幅分別為23.03%、49.70%。以上結(jié)果表明,酚類化合物單體混合后,胃腸道消化對(duì)其作用均有一定程度的降低,單體進(jìn)行模擬胃液消化時(shí),兒茶素及表兒茶素含量下降顯著,而混合標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過模擬胃液消化后,含量均未下降,即混合酚類化合物在模擬胃液消化過程中穩(wěn)定性提高;同樣,混合標(biāo)準(zhǔn)品在模擬腸液內(nèi)的穩(wěn)定性也有所提高,除兒茶素和沒食子酸外,其他5 種酚類化合物含量未發(fā)生變化。由以上結(jié)果可知,混合標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)于單一標(biāo)準(zhǔn)品在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性得到了一定程度的提高,這可能是由于酚類化合物單體之間形成一定的相互作用,增加了其在胃腸液內(nèi)的穩(wěn)定性。

      本課題組前期研究[24]發(fā)現(xiàn)菠蘿皮中4 種多酚單體的抗氧化性與兩兩組合之后的多酚單體的抗氧化性不同,其理論值和實(shí)際值有差異,多酚物質(zhì)之間存在拮抗和加成作用,Heo等[25]研究了12 種多酚物質(zhì)之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)之間存在加成和拮抗作用,因此,本實(shí)驗(yàn)推測多酚之間的相互作用保護(hù)了其穩(wěn)定性,同時(shí)Green等[26]發(fā)現(xiàn)在綠茶水提液中加入柑橘汁后,其兒茶素類均表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性,這可能也是由于柑橘汁中富含的黃酮醇、黃烷酮類或萜烯等物質(zhì)與兒茶素類進(jìn)行相互作用,增加了其穩(wěn)定性,抑制兒茶素類在高pH值條件下形成游離自由基形式,從而減少了兒茶素類物質(zhì)的損失。因此本實(shí)驗(yàn)中混合標(biāo)準(zhǔn)品的消化穩(wěn)定性也與標(biāo)準(zhǔn)品之間發(fā)生的相互作用有關(guān)。

      3 結(jié) 論

      不同酚類化合物在模擬胃腸道消化過程中穩(wěn)定性不同。模擬胃液對(duì)酚酸類化合物的影響較小,其含量無顯著變化,但類黃酮化合物在模擬胃液消化過程中穩(wěn)定性較差,兒茶素含量下降16.6%,表兒茶素含量約下降6%。經(jīng)模擬腸液處理后,除阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸外,其他酚類化合物含量均顯著下降,此外,綠原酸經(jīng)模擬腸液消化后還生成了新的物質(zhì)。

      模擬胃腸液對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的作用結(jié)果與單一標(biāo)準(zhǔn)品有所不同。模擬胃液消化對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品含量均無顯著影響,模擬腸液消化后,僅表兒茶素、沒食子酸含量分別降低為76.96%和50.30%,其他酚類化合物含量均無顯著變化。

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      DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613001

      中圖分類號(hào):TS201.2

      文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

      文章編號(hào):1002-6630(2016)13-0001-05

      收稿日期:2015-07-15

      基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(31460394);江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20121BBF60039)

      作者簡介:李俶(1971—),女,教授,博士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的提取與應(yīng)用。E-mail:liti@ncu.edu.cn

      *通信作者:陳軍(1986—),男,副研究員,博士,研究方向?yàn)槭称罚ê镔|(zhì))資源的開發(fā)利用。E-mail:chen-jun1986@hotmail.com

      Stability of Polyphenols during in Vitro Digestion

      LI Ti1, WANG Xieyi1, ZHAI Yuxin1, DAI Taotao1, CHEN Jun1,*, LIU Jiyan2, LIU Chengmei1
      (1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;2.Jiangxi Qiyunshan Food Co.Ltd., Ganzhou 341000, China)

      Abstract:The aims of this study were to investigate the stability of 7 polyphenols during in vitro digestion.The changes in seven polyphenol standards at different phases of gastrointestinal (GI) digestion were estimated by an HPLC method.The results showed that no significant changes were observed in phenolic acid compounds in gastric digestion; however,flavonoids compounds decreased significantly.Except ferulic acid and р-hydroxy benzoic acid, the amounts of all phenolic compounds investigated were decreased significantly in intestinal phase and at the same time, chlorogenic acid were transformed into new compounds.The mixed standards had no significant changes during gastric digestion.However,epicatechin and gallic acid were significantly reduced to 76.96% and 50.30%, respectively after intestinal digestion, while 5 other phenolic compounds did not change noticeably.

      Key words:polyphenols; in vitro digestion; high performance liquid chromatography (HPLC)

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