廣西牡蠣活性肽抑制卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖及對運(yùn)動(dòng)遷移能力的調(diào)控作用

李超柱，陳艷輝，陳艷華，黎丹戎（.欽州學(xué)院，廣西 欽州 535000；.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 5300；3.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西 南寧 5300）

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廣西牡蠣活性肽抑制卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖及對運(yùn)動(dòng)遷移能力的調(diào)控作用

李超柱1，陳艷輝1，陳艷華2，黎丹戎3，*
（1.欽州學(xué)院，廣西 欽州 535000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021）

摘 要：目的：研究廣西牡蠣活性肽對卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）的增殖及運(yùn)動(dòng)遷移能力的抑制作用。方法：采用四甲基偶氮唑藍(lán)（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法測定廣西牡蠣活性肽作用24 h后對細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的廣西牡蠣活性肽處理后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和集落形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室測定細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)和侵襲遷移能力。結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牡蠣活性肽質(zhì)量濃度在5～80 mg/L范圍內(nèi)抑制SKOV3-PM4的增殖，24 h的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50%，IC50）為35.36 mg/L。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明無細(xì)胞毒性的質(zhì)量濃度為4 mg/L的牡蠣活性肽能抑制SKOV3-PM4的增殖能力，牡蠣活性肽作用SKOV3-PM4細(xì)胞后其侵襲、遷移能力降低，與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論：從牡蠣中分離出的小分子多肽在一定質(zhì)量濃度下對SKOV3-PM4細(xì)胞的生長增殖、運(yùn)動(dòng)遷移具有抑制作用。

關(guān)鍵詞：牡蠣活性肽；卵巢癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；細(xì)胞遷移

引文格式：

李超柱， 陳艷輝， 陳艷華， 等.廣西牡蠣活性肽抑制卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖及對運(yùn)動(dòng)遷移能力的調(diào)控作用［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 199-203.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613036. http://www.spkx.net.cn

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卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，盡管手術(shù)技巧的提高可以最大限度地切除腫瘤，以及鉑類、紫杉醇類和二線化療藥物治療的臨床應(yīng)用，給患者帶來了生機(jī)。但是卵巢癌患者的5 a生存率仍無明顯提高，其原因主要是70%以上的卵巢癌患者初次確診時(shí)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而喪失最佳治療時(shí)機(jī)。腫瘤轉(zhuǎn)移成為卵巢癌患者的主要致死因素［1-3］，因此防治腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移在腫瘤的治療過程中具有重要的意義。

廣西欽州有豐富的海產(chǎn)品，從海洋天然活性物質(zhì)尋找具抗腫瘤作用的物質(zhì)，尤其從海洋生物中的蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)特異、活性獨(dú)特的抗腫瘤活性多肽，篩選和開發(fā)新型的抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防的保健食品，是延長腫瘤患者壽命的重要途徑之一［4］。課題組前期采用動(dòng)物復(fù)合酶為工具酶水解牡蠣蛋白，獲得了分子質(zhì)量為1 000～3 000 D的牡蠣活性肽［5-6］，為了進(jìn)一步探索其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性及作用機(jī)制，本研究以自行構(gòu)建的具有淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3-PM4為實(shí)驗(yàn)對象，通過觀察該活性肽對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，為臨床抗腫瘤轉(zhuǎn)移保健品的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、材料與試劑

卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系（SKOV3-PM4）按參考文獻(xiàn)［7］的方法自行構(gòu)建。

廣西牡蠣活性肽由課題組前期分離獲得，分子質(zhì)量為1 000～3 000 D［5］。

RPMI 1640培養(yǎng)基 美國Hyclon公司；胎牛血清 美國Gibco公司；纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Transwell穿膜小室、人工基膜基質(zhì)凝膠Matrigel 美國Corning Costar公司；四氮甲基偶氮唑藍(lán)（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R超低溫高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣活性肽對細(xì)胞生長影響的檢測

取對數(shù)生長期的SKOV3-PM4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，按每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96 孔板中。細(xì)胞貼壁后，設(shè)置不同質(zhì)量濃度的牡蠣活性肽（質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80 mg/L）和空白對照組（僅加入相應(yīng)體積培養(yǎng)基），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxid，DMSO）100 μL，在酶標(biāo)儀上用測定490 nm波長處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算抑制率及半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50%，IC50）。計(jì)算公式［8］如下。

選取抑制率小于10%的質(zhì)量濃度作為活性測定的質(zhì)量濃度。

1.3.2 細(xì)胞遷移能力的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別接種于6 孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，棄去舊的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2 次，沿孔的縱行直徑劃痕，并在該劃痕左右0.5 cm處各劃1 條。細(xì)胞設(shè)置2 組，分別為4 mg/L牡蠣活性肽處理組和空白對照組。將孔板置于37 ℃，含5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、12、24、48 h將孔板置于顯微鏡下觀察并拍攝圖片記錄劃痕處細(xì)胞的遷移情況。

1.3.3 細(xì)胞生長曲線的繪制

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。各組細(xì)胞接種于24 孔板中，每孔100 μL，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入質(zhì)量濃度為4 mg/L牡蠣活性肽，空白對照組加入等體積培養(yǎng)基。從接種當(dāng)日起，每日同一時(shí)間從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)7 d，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.4 集落形成實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長期的SKOV3-PM4細(xì)胞，以1 000 個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，每孔2 mL，每組平行設(shè)3 個(gè)復(fù)孔；實(shí)驗(yàn)組加入質(zhì)量濃度為4 mg/L牡蠣活性肽，空白對照組加入等體積培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2無菌條件下培養(yǎng)14 d，中途觀察細(xì)胞狀態(tài)換培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)后PBS洗滌3 次，甲醇固定后，PBS洗滌3 次，Giemsa染色，以＞50 個(gè)細(xì)胞做為1 個(gè)集落，光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)集落數(shù)并拍照。

1.3.5 細(xì)胞體外侵襲能力測定

取SKOV3-PM4對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個(gè)/mL，取各組細(xì)胞懸液200 μL分別接種于上層小室內(nèi)，小室下室加入含有 20% 胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)組上層小室中加入質(zhì)量濃度為4 mg/L的牡蠣活性肽，空白對照組加入等體積培養(yǎng)基。37℃、5% CO2無菌孵育24 h后取出濾膜，擦去Matrigel膠，甲醇固定20 min，Giemsa染色。顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對各實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用±s表示；組間比較用方差分析，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細(xì)胞生長的影響

多肽作用24 h后MTT法檢測的結(jié)果（表1）表明，在5～80 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細(xì)胞增殖具有抑制作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，成劑量依賴性（P＜0.05）。牡蠣活性肽作用于SKOV3-PM4細(xì)胞24 h的IC50值為35.36 mg/L。

注：*.與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）。下同。

由圖1可知，從第2天起，加入牡蠣活性肽的SKOV3-PM4細(xì)胞生長狀態(tài)受到明顯抑制，4～7 d的細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對照組（P＜0.05），表明牡蠣活性肽具有抑制SKOV3-PM4細(xì)胞增殖的功能。

2.2 牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細(xì)胞遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測空白對照組和牡蠣活性肽處理組（4 mg/L）中SKOV3-PM4細(xì)胞在0、12、24、48 h時(shí)的遷移狀況。由圖2可知，牡蠣活性肽能抑制SKOV3-PM4細(xì)胞的遷移，經(jīng)處理后的SKOV3-PM4細(xì)胞遷移能力較弱，成時(shí)間依賴性。

2.3 牡蠣活性肽對SKOV3-PM4細(xì)胞集落形成能力的影響

細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，加入牡蠣活性肽（4 mg/L）的細(xì)胞集落形成數(shù)為（168.33±11.63） 個(gè)，明顯低于空白對照組的（259.67±65.83） 個(gè)（P＜0.05）。

2.4 牡蠣活性肽對細(xì)胞體外侵襲能力

由圖4可知，加入牡蠣活性肽（4 mg/L）的細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（13±2）個(gè)，明顯低于空白對照組的（46.0±4.6）個(gè)，說明經(jīng)牡蠣活性肽處理的SKOV3-PM4體外侵襲能力顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)在牡蠣酶解的過程中存在大量的小分子活性肽，牡蠣活性肽具有分子質(zhì)量小、毒性低、活性高、易于穿透腫瘤細(xì)胞等特點(diǎn)，越來越多的研究顯示，牡蠣活性肽有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，如余杰等［9］檢測牡蠣活性肽（bioactive peptidesof oyster，BPO）誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，結(jié)果表明：BPO誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的效應(yīng)主要通過對細(xì)胞周期阻滯和激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)；BPO的作用機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡基因Caspase3 mRNA表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞周期（G0/G1期）阻滯有關(guān)。廖共山等［10］發(fā)現(xiàn)牡蠣活性肽BPO G50-Ⅱ在一定濃度下對人舌鱗癌細(xì)胞株（Tca8l13）體外增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。梁盈等［11］報(bào)道從牡蠣分離提取出的牡蠣低分子多肽，對肺癌A549細(xì)胞具有一定的誘導(dǎo)分化作用，能夠改變?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞的惡性形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征。李鵬等［12］從牡蠣中提取得到牡蠣活性肽BPO-1，發(fā)現(xiàn)其對胃癌BGC-823細(xì)胞具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。本研究再次證實(shí)了牡蠣活性肽對卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）的增殖具有明顯的抑制能力。

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱與細(xì)胞的功能密切相關(guān)，因此檢測細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力在發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、特別是癌癥的轉(zhuǎn)移生物學(xué)等領(lǐng)域都具有重要研究意義［13-16］。到目前為止，用于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力評估的主要實(shí)驗(yàn)方法有：體外組織移植、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種較常用的簡單的檢測細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的方法，適合用于檢測貼壁生長的腫瘤細(xì)胞的遷移能力［17-19］。Transwell小室又稱插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，分為上下兩室，中間是一層帶有微孔的聚碳酸酯膜，孔徑大小規(guī)格不等，介于0.1～12.0 μm之間，膜上的微孔可作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的通道，也是上下室中細(xì)胞之間物質(zhì)交換以及信息傳遞的通道［20］。由于該實(shí)驗(yàn)可以較好模擬腫瘤細(xì)胞生長和信息交換的環(huán)境，本研究選用技術(shù)成熟的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)研究卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠程度提供一定的保障。

卵巢癌發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期，并伴隨著局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，病人的預(yù)后差，病死率位于婦科腫瘤的首位［21-23］。目前對于卵巢癌，尤其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者無特效藥物，因此從天然產(chǎn)物中篩選出活性高、毒性低的抗腫瘤化合物，具有重要且現(xiàn)實(shí)的意義［24-25］。從本研究結(jié)果可知，牡蠣活性肽對卵巢癌細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，為了證實(shí)牡蠣活性肽對腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力不是由于其毒性所導(dǎo)致，因此選取無細(xì)胞毒性的質(zhì)量濃度為4 mg/L的牡蠣活性肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且證實(shí)該質(zhì)量濃度下的牡蠣活性肽能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞Transwell小室侵襲能力和細(xì)胞遷移能力，推測牡蠣活性肽可能是卵巢癌淋巴轉(zhuǎn)移的潛在抑制劑。本研究以具有淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞株為基礎(chǔ)，探討新型牡蠣活性肽影響腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用，為研發(fā)新型抗腫瘤轉(zhuǎn)移的小分子保健食品提供一條新的途徑。但是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，牡蠣活性肽抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613036

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0199-05

收稿日期：2015-08-02

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014GXNSFAA118066）

作者簡介：李超柱（1957—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物有機(jī)化學(xué)。E-mail：lcz1657@163.com

*通信作者：黎丹戎（1963—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物抗腫瘤活性分子篩選與作用機(jī)制。E-mail：danrongli@163.com

Bioactive Peptide Derived from Oyster Meat from Guangxi Region， China Inhibits Proliferation and Migration of Human Ovarian Carcinoma Cells with Directional High Lymphatic Metastasis

LI Chaozhu1， CHEN Yanhui1， CHEN Yanhua2， LI Danrong3，*
（1.Qinzhou University， Qinzhou 535000， China； 2.Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University， Nanning 530021， China；3.Institute of Life Science， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China）

Abstract:Objective: To study the inhibitory effect of bioactive peptide derived from oyster meat Guangxi region，China on the proliferation and migration of human ovarian carcinoma cells with directional high lymphatic metastasis （SKOV3-PM4 cells）. Methods: The 3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide （MTT） assay was performed to study the inhibitory effect of the bioactive peptide on cell proliferation in 24 h. The proliferative ability of SKOV3-PM4 cells was detected by cell counting method and colony formation test.The ability of cell migration and invasion was examined by cell wound scratch assay and matrigel invasion assay.Results: MTT results showed that the bioactive peptide could inhibit the proliferation of SKOV3-PM4 within the concentration range of 5-80 mg/L and that half inhibition concentration （IC50） in 24 hours was 35.36 mg/L.The cell growth curve and cell colony formation showed that the proliferative ability of SKOV3-PM4 cells was significantly inhibited （P < 0.05）.Compared with control cells， after being treated with 4 mg/L （non-cytotoxic concentration） the bioactive peptide， the migration and invasion capability of SKOV3-PM4 was also significantly decreased （P < 0.05）.Conclusion: The bioactive peptide derived from oyster from Guangxi region can inhibit the proliferation and migration of SKOV3-PM4 cells within a certain concentration range.

Key words:bioactive peptide derived from oyster； ovarian cancer； lymphatic metastasis； cell migration