張莉恒， 王　師， 常亞青， 包振民， 丁　君??

(1.大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連 116023；2.中囯海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

?

夏眠期仿刺參腸組織實時熒光定量PCR分析中內參基因的篩選?

張莉恒1， 王師2， 常亞青1， 包振民2， 丁君1??

(1.大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連 116023；2.中囯海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

摘要：在仿刺參(Apostichopus japonicus)正常時期、夏眠初期和中期，應用實時熒光定量PCR技術，檢測CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh 9個候選內參基因在腸組織中的表達穩(wěn)定性。利用Delta Ct、GeNorm、NormFinder和BestKeeper 4種程序進行統(tǒng)計分析。發(fā)現上述條件中，9個候選內參基因在上述條件中的表達穩(wěn)定性存在一定差異，不同的軟件處理分析，得到的基因穩(wěn)定性排序不完全一致。綜合4種程序的方法，篩選出基因grb2表達最穩(wěn)定，可用作內參基因，其次為基因ro60及dpolm，而表達最不穩(wěn)定的是CA043，不適宜作為內參基因。本研究為仿刺參中基因表達定量分析奠定了基礎，同時為仿刺參中內參基因的選擇提供一定參考依據。

關鍵詞：仿刺參；夏眠；內參基因；熒光定量PCR

引用格式：張莉恒， 王師， 常亞青， 等. 夏眠期仿刺參腸組織實時熒光定量PCR分析中內參基因的篩選[J].中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(7): 35-43.

ZHANG Li-Heng, WANG Shi, CHANG Ya-Qing, et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR of Apostichopus japonicus intestine during different periods of aestivation[J].Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(7): 35-43.

仿刺參(Apostichopusjaponicus)為中國現有海參中最主要的經濟種類，目前已有學者從遺傳育種學、發(fā)育學和免疫學等多個領域對仿刺參進行了研究，隨著分子生物學的發(fā)展，對仿刺參的功能基因等分子生物學領域的研究已成為近年來研究熱點。關于了解基因表達方式、揭示基因功能及闡明基因在生物體發(fā)育過程中的調控機制等研究中，基因表達分析具有至關重要的作用。在基因表達分析方法中，由于實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)具有較高的敏感性和自動化程度、較好的重復性、較快的檢測速度等優(yōu)點，已被廣泛應用[1-7]。利用該方法時，需要采用合適的內參基因對可能存在的差異進行校正及標準化。理想的內參基因是指在各種類型細胞、組織及不同處理條件下均表達恒定，但大量研究表明，大多常用內參基因只在特定細胞或組織、特定條件下表達較穩(wěn)定，而在不同類型細胞、不同發(fā)育階段及不同處理條件下表達具有差異[8-11]，從而使實時熒光定量PCR實驗的準確性受到內參基因選擇的影響。因此，通過比較不同生理條件下、不同類型細胞及不同生長階段等情況下基因的表達水平，選出合適的內參基因使數據得到標準化具有重要意義。近年來，內參基因的選擇已得到研究者的高度重視。常見的內參基因有GAPDH基因、β-actin基因等管家基因[12-15]。目前，國內內參基因相關研究多見于高等動植物[16]，水產動物相關研究較少，主要有楊桂梅等[17]利用抑制差減技術檢測出gapdh和β-肌動蛋白基因在牙鲆(Paralichthysolivaceus)發(fā)育過程中表達水平上可能存在差異；此外，楊愛馥等[18]對仿刺參cytb和β-actin基因表達穩(wěn)定性進行了比較；封利穎等[19]利用實時熒光定量技術對12種候選內參基因在蝦夷扇貝不同組織及不同發(fā)育階段的表達穩(wěn)定性進行了分析；國外學者分析研究了斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[20]、大西洋鮭(Salmosalar)[21]等的內參基因穩(wěn)定性。關于仿刺參夏眠特定條件下內參基因表達穩(wěn)定性的研究尚未見報道。

本研究首次通過對仿刺參轉錄組數據分析，選擇了9個候選內參基因，利用Delta Ct、GeNorm、NormFinder及BestKeeper 4種方法比較各候選內參基因在仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中的表達穩(wěn)定性，選擇出不同生理條件下穩(wěn)定表達的內參基因，旨在探究仿刺參基因表達定量分析中內參基因的選擇問題，為海參功能基因表達中內參基因的選擇提供了參考。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物試驗所用仿刺參取自大連黑石礁海域，分為3個時間點進行取樣，即仿刺參正常時期(2013-07-01)、夏眠初期(2013-09-11)和夏眠中期(2013-10-09)。每個時期取3頭，取其腸道組織，收集到1.5mL離心管內，投入液氮中迅速冷凍，存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器DEPC水；Trizol；氯仿；3mol/L NaAc(pH=5.2)；75%乙醇；異丙醇；Nuclease-free水；1×TAE；瓊脂糖；10mmol/L dNTP；Oligo(dT)18 Primer；Recombinant RNase Inhibitor；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)；SYBR Green Master(Rox)；移液槍(Eppendorf)；高速勻漿機(IKEA)；PCR儀(Bio-RAD)；純水系統(tǒng)(Milliore)；高速冷凍離心機(Eppendorf)； Nanoview(GE)；瓊脂糖電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)(SIM)；制冰機；渦旋振蕩儀；超凈無菌工作臺；Qubit核酸濃度測定儀；高壓滅菌鍋；LightCycler實時熒光定量PCR儀480Ⅱ。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取仿刺參不同夏眠時期的9個個體腸組織的RNA均用TRIzol Reagent(Invitrogen,CA，USA)提取，且所有操作均在低溫且無RNA酶的條件下進行。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性，使用Nanoview(GE)檢測RNA的純度和濃度，選用A260/A280值為1.8～2.2的RNA進行后續(xù)實驗。結束檢測后將RNA放置-80℃冰箱凍存。

（2）缺乏針對工業(yè)控制網絡安全防御的相關技術手段。由于工業(yè)控制網絡對于運行的連續(xù)性與響應時間等方面的要求較高，有別于信息網絡的要求，研究針對工業(yè)控制網絡的安全防御理論及技術非常必要。

1.2.2 cDNA合成取2μgRNA，向其中加入1μL Oligo dT，并加入DEPC水補至體系為12.5μL，整個過程要求在冰上進行，然后將其置于預熱至65℃的PCR儀中孵育5min，迅速取出置于冰上。向上述反應物中加入4μL的5×Reaction Buffer、0.5μL的20URNasein、2μL的10mmol/L dNTP及1μL的200U M-MVL Reverse Transcriptase，混勻后置于42℃ 90min，70℃ 10min孵育以滅活反轉錄酶。

1.2.3 實時熒光定量PCRQPCR反應是20μL體系、2μL的稀釋20倍的cDNA、4μL的2μmol/L引物S、4μL的2μmol/L引物A及10μL的SYBR Green Mastermix。將上述反應液混勻離心后，置于LightCycler實時熒光定量PCR儀480Ⅱ系統(tǒng)中，每個基因設置3個生物重復和3個技術重復。按照以下條件進行PCR擴增：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s。各引物最佳退火溫度下反應1min，40次循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，0.5℃/10s降至60℃，60℃1min。PCR儀檢測熒光信號強度的時間設定在擴增反應的退火過程中。為了排除引物二聚體及非特異性擴增產物對基因表達定量的影響，在PCR反應結束后進行了熔解曲線分析，溫度從95℃以0.5℃/10s速率緩慢降至60℃，連續(xù)采集樣品的熒光信號以獲取熔解曲線。

1.2.4 候選內參基因選擇及引物設計所有候選內參基因序列由本實驗室通過仿刺參轉錄組Illumina測序技術(Hiseq2000)測定而得。測序獲得仿刺參轉錄組數據，將序列與Swissprot蛋白數據庫比對，得到基因注釋，同時比較分析各基因的表達水平，最后共選出10個候選內參基因用來分析基因表達穩(wěn)定性，包括CA043(Uncharacterized protein C1orf43 homolog)、dpolm(dna-directed dna/rna polymerase mu)、ro60(60 kda ss-a ro ribonucleoprotein)、grb2(growth factor receptor-bound protein 2)、hiat1(hippocampus abundant transcript 1 protein)、nlrc4(nlr family card domain-containing protein 4)、farp1(FERM, RhoGEF and pleckstrin domain-containing protein 1)、cyc(cytochrome c)、gapdh(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。利用Primer5.0軟件設計引物，見表1。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.5 普通PCR檢測擴增產物為了檢測cDNA的質量、擴增產物是否準確及其是否具有特異性，在進行實時熒光定量PCR之前，先通過普通PCR驗證。普通PCR反應的10μL體系包括1μL的cDNA、1μL的Primer-F、1μL的Primer-R、0.8μL的10mmol/L dNTP、1μL的10×PCR buffer、0.1μL的rTaq酶及5.1μL的ddpO。將上述體系反應物置于程序：95℃預變性2min后，按照95℃，30s；60℃，30s；72℃，15s的反應程序進行30個循環(huán)，終延伸72℃,5min后置于4℃保存。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.6 數據處理和分析數據處理與分析采用Excel 2003和4種常用的內參穩(wěn)定性評價軟件，包括Delta Ct、geNorm (http：//medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/)[22]，NormFinder[23]和BestKeeper[24]軟件，根據各軟件說明對候選內參基因在仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中的表達穩(wěn)定性進行分析。具體操作如下：設定不同樣本中某一內參基因Ct值最小者表達量為1，在Excel 2003中標準化處理其他樣品

表1　9個候選內參基因引物序列及相關信息

Note: ①Unigene; ②Annotation; ③Primer sequence(5’-3’); ④Length of amplified product

此內參基因的表達量，即此內參基因想其他樣本中的相對表達量為2-ΔCt(ΔCt=各樣本Ct值-最小Ct值)，將數據結果按格式要求導入GeNorm軟件，該軟件能夠計算各候選內參基因的平均表達穩(wěn)定值M以及分析內參基因標準化因子的配對差異，從而篩選出表達較穩(wěn)定的內參基因以及所需內參基因的最適數目。NormFinder軟件與geNorm軟件類似，而BestKeeper軟件則輸入原始數據即可。

2　結果與分析

2.1 仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織總RNA提取

圖1　總RNA

2.2 候選內參基因引物特異性分析

普通PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。結果如圖2所示，在100～200bp之間，基因CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh擴增片段條帶清晰，片段長度與預期片段大小一致，且條帶單一、不含雜帶與引物二聚體；同時對各候選內參基因引物進行qRT-PCR分析，結果發(fā)現各候選內參基因的熔解曲線均為顯著的單一峰(見圖3)。綜合分析，說明9個候選內參基因引物均具有較高特異性，可用于后續(xù)的qRT-PCR分析；同時發(fā)現每個樣品擴增曲線具有較好的重復性，這說明qRT-PCR的分析結果準確可信。

(1：CA043；2：dpolm；3：ro60；4：grb2;5：hiat1；6：nlrc4；7：farp1；8：cyc；9：gapdh；M為DNA標記M is DNA Marker.)

圖29 個候選內參基因PCR 擴增產物

Fig.2PCR products of 9 candidate reference genes

圖3　9對候選基因引物的熔解曲線

2.3 內參基因穩(wěn)定性評價分析

2.3.1 geNorm軟件評價分析結果仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個候選內參基因的表達穩(wěn)定性見圖4。geNorm軟件是依據表達穩(wěn)定度平均值(M)的大小對內參基因進行評價，M值越小，說明內參基因表達越穩(wěn)定；反之，則表明內參基因表達穩(wěn)定性差。經過geNorm軟件的評價分析發(fā)現，在仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個候選內參基因的表達穩(wěn)定性的平均值M從大到小依次為CA043>gapdh>farp1>cyc>nlrc4>hiat1>dpolm>ro60=grb2(見圖4a)，由此可見，穩(wěn)定性最好的基因為ro60和grb2，其平均表達穩(wěn)定性M值均為0；而基因CA043與gapdh穩(wěn)定性最差，其平均表達穩(wěn)定性M值分別為1.59和1.42。除基因CA043外，其他8個候選內參基因M值均小于1.5，在此條件下可作為內參基因。此外，geNorm軟件通過分析標準化因子配對差異值，來確定所需內參基因的最適數目，當標準化因子配對差異(pairwise variations)值低于0.15，即Vn(n+1)<0.15時，說明有n個基因可以作為實時熒光定量分析的內參基因，不需要選擇使用數量大于等于n+1個基因作為內參基因。如圖4b所示，本研究中標準化因子配對差異值均大于0.15，但是以V3/4最小，即在此之后增加更多的內參基因也不能降低標準化因子配對差異值(Vn/n+1)，所以理想的內參基因數目應選為3個，建議選用基因grb2、ro60和dpolm作為內參基因。

(其中a為選內參基因表達穩(wěn)定度的平均值，b為內參基因標準化因子的配對差異分析。a is Average expression stability M, b is Pairwise Variations.)

圖4GeNorm軟件分析候選基因在仿刺參不同夏眠時期腸組織的表達穩(wěn)定性

Fig.4Average expression stability values of the candidate reference genes in intestine of

japonicus during different aestivation analyzed by GeNorm

2.3.2 Delta Ct方法評價分析結果根據實時熒光定量PCR結果，利用Delta Ct方法對仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析，結果見圖5。由圖5可知9個候選內參基因平均穩(wěn)定性值從大到小排序為CA043>gapdh>cyc>farp1>nlrc4>hiat1>dpolm>ro60=grb2，基因grb2和ro60穩(wěn)定性較高，平均表達穩(wěn)定性值均為0.205，之后依次為基因dpolm、hiat1、nlrc4、farp1、cyc、gapdh，基因CA043表達穩(wěn)定性最差，其平均表達穩(wěn)定性值為0.44。

2.3.3 NormFinder 軟件評價分析結果NormFinder軟件分析內參基因的原理與GeNorm軟件相似，都是根據基因平均表達穩(wěn)定值的大小評估，穩(wěn)定值越小，基因表達的穩(wěn)定性越高。但是該軟件不能預測內參基因組合的數目。經NormFinder軟件評價分析發(fā)現，NormFinder分析結果與GeNorm分析結果基本一致(見圖6)?；騞polm平均表達穩(wěn)定值最小，為0.04，可作為候選內參基因；其次為基因grb2與ro60，平均穩(wěn)定值均為0.072；同樣基因CA043平均穩(wěn)定值最高，為0.408。

2.3.4 BestKeeper軟件評價分析結果BestKeeper軟件與GeNorm、NormFinder軟件原理不同，該軟件是根據標準差(SD)與調節(jié)系數標準差SD[±X-fold]對基因表達穩(wěn)定性進行評判，其值越小則表示基因表達越穩(wěn)定。經過BestKeeper軟件評估分析，仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個候選內參基因的表達穩(wěn)定性見圖7與表2。由表2和圖7可知，與geNorm和NormFinder軟件分析結果不同，BestKeeper軟件分析結果以基因CA043表達最為穩(wěn)定，SD為0.76；同時基因grb2、ro60及dpolm表達穩(wěn)定性仍排列在前四名，其SD值分別為1.01、1.17、1.20；而表達最不穩(wěn)定的內參基因為farp1，SD值為1.40。

圖5　Delta Ct法分析候選基因在仿刺參不同夏眠時期腸組織的表達穩(wěn)定性

圖6　利用NormFinder評價內參候選基因仿刺參不同夏眠時期腸組織的表達穩(wěn)定性

圖7　利用BestKeeper評價內參候選基因在仿刺參不同夏眠時期腸組織的表達穩(wěn)定性

參數Parameters基因GenesCA043dpolmro60grb2hiat1nlrc4farp1cycgapdhGeoMeans[CP]22.9827.4128.2126.7426.2727.2327.3124.8226.99ARMean[CP]23.0027.4428.2426.7626.3127.3327.4324.9527.03Min[CP]22.0425.5726.5525.0324.4624.8024.7822.0824.17Max[CP]24.9729.3031.4928.8528.5031.7633.5030.2929.72SD[±CP]0.761.201.171.011.202.142.192.171.40CV[%CP]3.304.384.143.764.577.847.988.715.16Min[X-fold]-1.92-3.59-3.16-3.26-3.51-5.37-5.78-6.70-7.05Max[X-fold]3.973.729.724.344.6923.0773.0944.336.67SD[±X-fold]1.672.302.252.012.304.424.564.512.63

本研究利用Delta Ct、geNorm、Normfinder和BestKeeper 4種軟件綜合分析篩選出仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中表達相對穩(wěn)定的內參基因。表3顯示，基因grb2表達最穩(wěn)定，其次為ro60基因及dpolm基因，而基因CA043表達穩(wěn)定性較差。因此，可選基因grb2、ro60及dpolm作為內參基因。

表3　9個候選內參基因穩(wěn)定度排序

3　討論

夏眠是仿刺參特有的重要生理習性，由學者Mitsukuri于日本首次發(fā)現[25]。夏眠期間仿刺參會產生一系列的生理生態(tài)變化，主要表現為活動降低、停止攝食、體質量減輕、消化道退化萎縮、代謝降低等。這一生理習性在一定程度上影響了仿刺參的質量及產量。因此，研究夏眠過程中仿刺參的代謝生理調控機制，以期望打破夏眠這一生理習性，對能夠更好的實現仿刺參的經濟價值具有重要意義。另外，由于夏眠是仿刺參的特殊生理習性，能夠準確的取到各夏眠時期仿刺參樣品具有一定的難度。目前，關于夏眠期間仿刺參內參基因選擇的研究尚未見報道，本文首次比較了9個候選基因在仿刺參正常時期、夏眠前期及夏眠中期腸組織中的表達穩(wěn)定性，以期望得到表達穩(wěn)定的內參基因，為以后關于仿刺參夏眠過程中代謝調控機制的研究提供參考。

對于實時熒光定量PCR研究而言，選擇合適的內參基因是其能夠準確分析基因表達穩(wěn)定性的前提。通常理想的內參基因是指在不同類型細胞或組織器官、不同發(fā)育階段及各種處理條件下均穩(wěn)定表達[26]。但實際上幾乎不存在能同時滿足這些條件的基因，目前所研究的基因在不同類型的細胞、組織器官及實驗條件下表達均存在差異[27-29]。因此，研究者可以特定驗條件對內參基因的穩(wěn)定性進行分析。本研究即對仿刺參夏眠這一特殊生理條件下的腸道組織進行內參基因的穩(wěn)定性的分析。

之前大量學者多以文獻中報道過的常用管家基因作為候選內參基因來進行基因表達穩(wěn)定性分析。而本研究首次通過由本實驗室對仿刺參轉錄組進行Illumina測序，獲得仿刺參轉錄組數據，將序列與Swissprot蛋白數據庫比對，得到基因注釋，同時比較分析各基因的表達水平，從而獲得CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh共9個候選內參基因用來分析基因表達穩(wěn)定性。其中基因grb2，即生長因子受體結合蛋白2，具有促進細胞增殖、細胞生長及細胞分化等功能，在多個信號通路中擔任著“接力棒”的角色，目前已成為研究最為透徹的接頭蛋白。董迎輝等[30]擴出泥蚶grb2基因的全長cDNA序列，并研究分析了其組織表達、生物信息學及發(fā)育階段表達特征；周維霞等[31]研究發(fā)現基因grb2的表達與胰腺癌的生物學行為密切相關。此外，grb2基因在哺乳動物中已被證實是調控生長以及胚胎發(fā)育相關信號通路的重要基因，基于夏眠期間仿刺參的生理生態(tài)變化的表現，這一結論與本研究得到的grb2基因表達最穩(wěn)定的結果一致。Eli Eisenberg等[32]認為CA043基因可用作內參基因；ro60參與了RNA聚合酶III啟動子的轉錄的生物過程；基因polm在人、牛、小鼠等中是保守的；Neil Romberg等[33]研究表明nlrc4的突變可導致小腸結腸炎；BinQuan Zhuang等[34]研究發(fā)現基因farp1能促進脊柱運動神經元樹突的生長；基因cyc即為細胞色素C，具有增強細胞氧化與誘導細胞凋亡作用；基因gapdh為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶是糖酵解反應中的一個酶。封利穎等[19]利用實時熒光定量技術對12種候選內參基因在蝦夷扇貝不同組織及不同發(fā)育階段的表達穩(wěn)定性進行了分析，并得到基因cyc和gapdh可作為內參基因，本研究結果與其不同。為了能夠更充分了解各基因的相關信息，上述基因有待于進一步深入研究。

目前常用于評價分析內參基因穩(wěn)定性的生物學軟件有GeNorm、NormFinder及BestKeeper 3種，如果單獨選擇其中一種生物學軟件分析候選內參基因的表達穩(wěn)定性以篩選最佳內參基因，得到的結果并不理想[35]。因此本研究利用基于Excel 2003平臺的Delta Ct、GeNorm、NormFinder及BestKeeper 4種軟件對仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期條件下腸道組織中的9個候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行了分析。結果表明，經過Delta Ct、GeNorm及NormFinder軟件分析的結果基本一致，基因grb2、ro60及dpolm表達穩(wěn)定性排序均為前3，GeNorm與NormFinder軟件的區(qū)別是前者能夠確定合適內參基因組合的數目，而后者只能得到表達最穩(wěn)定的基因。與上述3種方法分析結果不同，BestKeeper軟件分析結果為基因CA043最為穩(wěn)定，其他基因穩(wěn)定性排序也與另外3種分析方法差異，這可能是由于BestKeeper軟件的原理是直接將原始數據Ct值輸入到程序中，這樣計算出的數據會產生虛假的變化[36-37]。綜合分析，合適的內參基因組合數目為3個，分別為基因grb2、ro60及dpolm；并篩選出了在仿刺參夏眠期條件下的表達最穩(wěn)定的內參基因為grb2。

4　結語

本研究首次嘗試研究仿刺參在夏眠這一特殊生理條件下評價分析候選內參基因表達穩(wěn)定性。為使實驗結果更具說服力，利用Delta Ct、GeNorm、NormFinder和BestKeeper 4種生物學軟件，綜合系統(tǒng)地比較仿刺參正常時期、夏眠初期及夏眠中期腸道組織的Real-time PCR數據，篩選出了適合研究仿刺參夏眠期條件下的基因表達的內參基因組合數目是3個，其中表達最穩(wěn)定的內參基因為grb2。研究結果為仿刺參夏眠相關基因表達分析中的內參基因的選擇提供了實驗依據,同時也對仿刺參不同組織及不同實驗條件處理下內參基因的篩選提供了參考資料。

參考文獻：

[1]Bustin S A, Benes V, Nolan T, et al. Quantitative real-time RT-PCR-a perspective[J]. J Mol Endocrinol, 2005, 34(3): 597-601.

[2]Kubista M, Andrade J M, Bengtsson M, et al. The real-time poly-merase chain reaction[J]. Mol Aspects Med, 2006, 27(2-3): 95-125.

[3]VanGuilder H D, Vrana K E, Freenman W M. Twenty-five years quantitative PCR for gene expression analysis[J]. Biotechniques, 2008, 44(5): 619-626.

[4]岳志芹, 汪俊, 梁成珠, 等. 實時定量RT-PCR方法檢測太平洋牡蠣中的諾沃克樣病毒[J]. 海洋科學, 2008, 32(8): 1-4.

Zhiqin Yue, Jun Wang, Chengzhu Liang, et al. Detection of norwalk-like virus in oyster by real-time quantitative RT-PCR [J]. Marine Sciences, 2008, 32(8): 1-4.

[5]吳紹強, 李海艷, 林祥梅, 等. 貝類派琴蟲實時熒光定量PCR檢測方法的建立和應用[J]. 漁業(yè)科學進展, 2009, 30(5): 58-63.

Shaoqiang Wu, Haiyan Li, Xiangmei Lin, et al. Establishment and application of real-time PCR method for detection ofPerkinsussp. in bivalves[J]. Progress in Fishery Sciences, 2009, 30(5): 58-63.

[6]Wang H, Song L S, Li C H, et al. Cloning and characterization of a novel C-type lectin from Zhikong scallopChlamysfarreri[J]. Molecular Immunology, 2007, 44(5): 722-731.

[7]錢曦, 華雪銘, 黃旭雄, 等. 異育銀鯽c型溶菌酶全長cDNA序列的生物信息學分析及其組織表達分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2008, 24(4): 337-347.

Xi Qian, Xueming Hua, Xuqiong Huang, et al. Molecular cloning of full-length c-type lysozyme fromCarassiusauratusgibelioand its tissue-specific expression and bioinformatic analysis[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 24(4): 337-347.

[8]Bustin S A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J]. J Mol Endocrinol, 2000, 25(2): 169-193.

[9]Thellin O, Zoriz W, Lakaye B, et al. Housekeeping genes as internal standards: Use and limits[J]. J Bitech, 1999, 75(2-3): 291-295.

[10]Radoni A, Thulke S, Mackay I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 313: 856-862.

[11]Bas J W Dekkers, Leo Willems, George W Bassel, et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in arabidopsis and tomato seeds[J]. Plant Cell Physiol, 2012, 53(1): 28-37.

[12]Pugnale P, Latorre P, Rossi C， et al. Real-time multi-plex PCR assay to quantify hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells[J]. J Virol Methods, 2006, 133(2): 195-204.

[13]Regis S, Grossi S, Lualdls, et al. Diagnosis of pelizae-us merzbacher disease: detection of proteoLipid protein gene copy number by real-time PCR[J]. Neurogenetics, 2005, 6(2): 73-78.

[14]Nguyen van N, Taglineger K, Helps C R, et al. Measurement of cytokine mRNA expression in intestinal biopsies of cats with inflammatory enteropathy using quantitative real-time RT-PCR[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2006, 113(3/4): 404-414.

[15]Tsui N B, Loym. Molecular analysis of circulating RNA in plasma[J]. Methods Mol BIOL, 2006, 336: 123-134.

[16]袁偉, 萬建紅, 楊悅儉. 植物實時熒光定量PCR內參基因的特點及選擇[J]. 植物學報, 2012, 47(4): 427-436.

Wei Yuan, Jianhong Wan, Yuejian Yang. Characterization and selection of reference genes for real-time quantitative RT-PCR of plant[J]. Chinese Bulletin of Botany, 2012, 47(4): 427-436.

[17]楊桂梅, 鮑寶龍, 任大明. 3-磷酸甘油醛脫氫酶、β-肌動蛋白和18S rRNA作為相對定量的內標在牙鲆發(fā)育階段的穩(wěn)定性比較[J]. 上海水產大學學報, 2005, 14(1): 84-88.

Guimei Yang, Baolong Bao, Daming Ren. Comparison between ribosomal 18S rRNA, GAPDH and β-actin genes as internal standard for quantitative comparison of mRNA levels in development of flounder,Paralichthysolivaceus[J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 2005, 14(1): 84-88.

[18]楊愛馥, 周遵春, 董穎, 等. 仿刺參cytb和β-actin基因表達穩(wěn)定性比較[J]. 中囯農業(yè)科技導報, 2010, 12(1): 78-84.

Aifu Yang, Zunchun Zhou, Ying Dong, et al. Stability comparison of cytb and β-actin gene expression in Sea cucumber(Apostichopusjaponicus)[J]. Journal of Agricultural Science and Techology, 2010, 12(1): 78-84.

[19]Liying Feng, Qian Yu, Xue Li, et al. Identification of reference genes for qRT-PCR analysis in Yesso scallopPatinopectenyessoensis[J]. PLOS ONE, 2013, 8(9): 1-10.

[20]Small B C, Murdock C A, Biodeau-Bourgeois A L, et al. Stability of reference genes for real-timr PCR analyses in channel catfish(Ictaluruspunctatus)tissues under varying phyisiological conditions[J]. Compara-tive Biochemistry and Physiology Part B, 2008, 151(3): 296-304.

[21]Ingerslev H C, Pettersen E F, Jakobsen R A, et al. Expreesion profling and validation of reference gene candidates in immune revevant tissues and cells from Alantic salmon (Salmosalar)[J]. Molecular Immunology, 2006, 43(8): 1194-1201.

[22]Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J]. Genome Biology, 2002， 3(7): 1-12.

[23]Andersen C L, Jensen J, Orntoft T F. Normalization ofReal-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identifygenes suited for normalization, applied to bladderandcoloncancer data sets[J]. Cancer Research, 2004， 64(15): 5245-5250.

[24]Pfaffl M W, Tichopad A, Prgomet C, et al. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper-Excelbased tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters, 2004, 26(6): 509-515.

[25]Mitsukuri K. Notes on the habits and life history ofStichopusjaponicusSelenka[J]. Annot Zool Japan, 1903, 5: 1-21.

[26]Hu R B, Fan C M, Fu Y F. Reference gene selection in plant real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR)[J]. J Agric Sci Technol, 2009, 11(6): 30-36.

[27]Lee P D, Sladek R, Greenwood C M T, et al. Control genes and variability: Absence of ubiquitous reference transcripts in diverse mammalian expression studies[J]. Genome Res, 2002, 12: 292-297.

[28]Tang R Y, Dodd A, Lai D, et al. Validation of zebrafish (Daniorerio) reference genes for quantitative Real-time RT-PCR normalization[J]. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica, 2007， 39(5): 384-390.

[29]Long X Y, Wang J R, Ouellet T, et al. Genome-wide identification and evaluation of novel internal control genes for Q-PCR based transcript normalization in wheat[J]. Plant Molecular Biology, 2010， 74(3): 307-311.

[30]董迎輝, 項翔, 姚韓韓, 等. 泥蚶(Tegillarcagranosa)生長因子受體結合蛋白2(GRB2)基因的克隆與表達分析[J]. 海洋與湖沼, 2013, 44(4): 937-943.

Yinghui Dong, Xiang Xiang, Hanhan Yao, et al. Cloning and expression of growth factor receptor-bound 2 inTegillarcagranosa[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2013, 44(4): 937-943.

[31]周維霞, 蔣曉紅, 楊勇, 等. 人類真核延伸因子1A2與生長因子受體結合蛋白2在胰腺癌組織中的表達及臨床病理意義[J]. 世界華人消化雜志, 2014, 22(14): 2049-2054.

Weixia Zhou, Xiohong Jiang, Yong Yang, et al. Expression and clinical pathological significance ofeukaryotic elongation factor 1A2 and growth factor receptor-bound 2 in pancreatic carcinoma[J]. World Chinese Journal of Digestology, 2014, 22(14): 2049-2054.

[32]E li Eisenberg, Erez Y. Human housekeeping genes, revisited[J]. Trends in Genetics, 2013, 29(10): 569-574.

[33]Neil Romberg, Khatoun A Moussawi, Carol Nelson-Williams, et al. Mutation of NLRC4 causes a syndrome of enterocolitis and autoinflammation[J]. Nature Genetics, 2014, 46: 1135-1139.

[34]BinQuan Zhuang, YouRong Sophie Su, Shanthini Sockanathan. FARP1 promotes the dendritic growth of spinal motor neuron subtypes through transmembrane semaphorin6A and plexinA4 signaling[J]. Neuron, 2008, 61(6): 359-372.

[35]Mascia T, Santovito E, Gallitelli D, et al. Evaluation of reference genes for quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction normalization in infected tomato plants[J]. Molecular Plant Pathology, 2010, 11(6): 805-816.

[36]Khanlou K M, Van Bockstaele E. A critique of widely used normalization software tools and an alternative method to identify reliable reference genes in red clover (TrifoliumpratenseL. ) [J]. Planta, 2012, 236(5): 1381-1393.

[37]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and he 2-ΔΔCt method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

責任編輯朱寶象

基金項目：?國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2012AA10A412)；遼寧省農業(yè)攻關及成果產業(yè)化項目(2015203003)資助

收稿日期：2015-03-05；

修訂日期：2016-05-05

作者簡介：張莉恒(1990-)，女，碩士生，主要從事水產養(yǎng)殖研究。E-mail:shiqudeyoushang@126.com ??通訊作者：E-mail： dingjun1119@dlou.edu.cn

中圖法分類號：S917

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)07-035-09

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150051

Selection of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR ofApostichopusaponicusIntestine During Different Periods of Aestivation

ZHANG Li-Heng1, WANG Shi2, CHANG Ya-Qing1, BAO Zhen-Min2, DING Jun1

(1.The Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China′s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding (MGB), Ministry of Education, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：Apostichopus japonicus is the most important economic species in China. Its special physiological habit is aestivation. There have been many studies on breeding, development, immunology and others, molecular biological research has become important. Domestic reference gene-related research is more in higher plants and animals than in aquatic animal. The study on the stability of reference gene in aestivation has not been reported. From transcriptome data analysis, we selected nine candidate refe-rence genes. In normal times, and at beginning of aestivation and in the mid of aestivation, With quantitative real-time PCR, we assessed the expression stability of nine candidate reference genes (CA043, dpolm, ro60, grb2, hiat1, nlrc4, farp1, cyc and gapdh) in intestinal tissues of A. japonicus. The stability of nine candidate reference genes analyzed by the 4 procedures (Delta Ct, GeNorm, NormFinder and BestKeeper). In conclusion, through the different software, the stability of candidate reference genes were not entirely consistent. The most stable gene was grb2, which can be used as the reference. The stability of ro60 and dpolm was the second; and the least stable was CA043. This study was the first to evaluate and analyze the expression stability of candidate reference genes in aestivation, laid a foundation for the further quantitative analysis of gene expression in A. japonicus.

Key words:Apostichopus japonicus; aestivation; reference gene; quantitative real-time PCR

Supported by the National High Technology Researchand PevelopmEnt Program (2012AA10A412); Industrialization Project of Agricultural Research and Achievements in Liaoning Province (2015203003)