於穎+顧其芳+陳敏+張紅芝

摘要：目的 制備用于檢測(cè)肉制品中沙門氏菌熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。方法 設(shè)計(jì)針對(duì)沙門氏菌invA基因的引物，擴(kuò)增特異片段，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并考察該標(biāo)準(zhǔn)品靈敏性及穩(wěn)定性。結(jié)果 成功構(gòu)建含有沙門氏菌invA基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用其建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值（Ct值）與模板的拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系（r2=0.9979），最低可以檢出10 拷貝/反應(yīng)。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)驗(yàn)證具有良好的穩(wěn)定性。用該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌，經(jīng)2h增菌后，可在7h內(nèi)完成對(duì)樣本的檢測(cè)。結(jié)論 所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可用于熒光定量PCR檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌，為考量實(shí)驗(yàn)質(zhì)量提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；熒光定量PCR；沙門氏菌；肉制品；

當(dāng)前，微生物污染引起的食源性疾病已引發(fā)人們的普遍關(guān)注和深入研究。在各類食源性病原菌及危害因子中，沙門氏菌是主要致病因子[1]。根據(jù)我國統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，由沙門氏菌導(dǎo)致的食源性疾病占總數(shù)的10.2%，且以肉制品受污染居多[2，3]。建立有效手段快速檢測(cè)肉制品中沙門氏菌，對(duì)防控和監(jiān)測(cè)這類食源性疾病意義重大。

熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction， qPCR）方法可快速并靈敏地對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，而擁有可靠的標(biāo)準(zhǔn)品保證了檢測(cè)的穩(wěn)定和可重復(fù)性[4]。目前，獲得熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的方法有許多，包括菌液提取模板DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、PCR擴(kuò)增目的片段割膠純化以及構(gòu)建含與目的基因片段相同序列的重組質(zhì)粒等，其中以質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品最為穩(wěn)定，且制備簡(jiǎn)單，使用方便。本研究選擇質(zhì)粒作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)計(jì)選取了沙門氏菌invA基因特異性片段，將其轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，以此保證快速、準(zhǔn)確檢測(cè)肉制品中沙門氏菌，為快速檢測(cè)該致病菌導(dǎo)致的食源性疾病提供技術(shù)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1材料和試劑

1.1.1試驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)采用菌株：鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、阪崎腸桿菌（ATCC 51329）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、宋內(nèi)志賀菌（ATCC 11060）、創(chuàng)傷弧菌（總18-85）、小腸結(jié)腸耶爾森菌（Y1）。ATCC菌株購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，其余菌株為本實(shí)驗(yàn)室收集、鑒定、編號(hào)并保存的菌株。

1.1.2主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)液（上海市疾病預(yù)防控制中心試劑供應(yīng)研究中心）；mericon DNA Bacteria Kit（Qiagen公司）；pMD？ 18-T Vector Cloning Kit、大腸埃希菌DH5α感受肽細(xì)胞（日本TaKaRa公司）；TaqMan？ Environmental Master Mix 2.0，ABI 7900HT熒光定量PCR儀（美國lifetechnologies公司）；NanoDrop2000核酸蛋白儀（賽默飛世爾科技（上海）有限公司）。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)和探針制備

根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌invA基因（GenBank： M90846.1）的高保守序列[5]，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7設(shè)計(jì)引物、探針，并用BLAST檢查序列的特異性。引物序列為：invA-F：5-TCTACATTGACAGAAT-3，invA-R：5- CGAACGTGGCGATAATTTC-3；探針序列：invA-P：5'-FAM-CAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT-TAMRA-3'，克隆質(zhì)粒擴(kuò)增引物：invA-S：5-CGGCAATAGCGTCACCTT-3，invA-AS：5-AGTGCTCGTTTACGACCTG-3。由生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.2細(xì)菌DNA提?。?/p>

按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的說明書提取模板DNA。DNA模板保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化：

對(duì)加入模板DNA、引物、探針的量進(jìn)行優(yōu)化，并選擇最佳退火溫度。在20 μL反應(yīng)體系中， TaqMan？ Environmental Master mix10 μL，引物invA-F和invA-R終濃度為0.75 μM，探針invA-P終濃度為0.2 μM ，模板DNA2 μL，ddH2O補(bǔ)足至反應(yīng)總體積。反應(yīng)條件：95℃變性5s，60℃退火30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行。用SDS2.4軟件（Life technologies）分析結(jié)果。

1.2.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備：

用invA-S和invA-AS引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳以后用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物片段，再連接到pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受肽細(xì)胞中，篩選陽性克隆菌落，經(jīng)PCR及測(cè)序（生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序）來鑒定片段序列。

1.2.5重組質(zhì)粒熒光定量PCR檢測(cè)：

將所制備的重組質(zhì)粒與8株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，其中鼠傷寒沙門氏菌為陽性對(duì)照，其他7株非沙門氏菌（阪崎腸桿菌、大腸埃希菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、宋內(nèi)志賀菌、創(chuàng)傷弧菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌等）為陰性對(duì)照，以檢驗(yàn)所制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品含有沙門氏菌invA基因特異序列。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

提取質(zhì)粒DNA，用核酸蛋白儀測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度，換算成基因的拷貝數(shù)。將制備的重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋至10-3～10-10，作為標(biāo)準(zhǔn)模板溶液，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：

將重組質(zhì)粒置-20℃冷凍保存6個(gè)月，分別在每個(gè)月取出稀釋至100、10-3、10-6進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，考察質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性。

1.2.8肉制品樣本的檢測(cè)

采集市售肉制品樣本35份，稱取25g剪碎后加入225mL 胰大豆肉湯培養(yǎng)基，置37℃增菌2h。吸取待測(cè)樣本1mL于離心管中，經(jīng)13000×g離心5分鐘，吸棄上清，再加入1mL滅菌去離子水重懸沉淀[6]。隨后提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。同時(shí)與培養(yǎng)分離方法作對(duì)照。

2. 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建結(jié)果

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒提取DNA得到沙門氏菌的質(zhì)粒DNA，長(zhǎng)度為577bp。將測(cè)序結(jié)果與Genbank中沙門氏菌invA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，符合率達(dá)100%。（見圖1）經(jīng)測(cè)，質(zhì)粒DNA的濃度為78 ng/μL，轉(zhuǎn)換得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的原始濃度為2.0×1010 copies/μL。

2.2 重組質(zhì)粒熒光定量PCR分析：

對(duì)已構(gòu)建的重組質(zhì)粒和8株菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖2。重組質(zhì)?？墒占矫黠@的熒光信號(hào)，Ct值為18.64。陽性對(duì)照菌株（鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株）也可見明顯熒光擴(kuò)增信號(hào)指數(shù)期，Ct值為20.23。其他菌株作為陰性對(duì)照均未見明顯擴(kuò)增信號(hào)。由此可見，成功構(gòu)建含有沙門氏菌invA基因特異序列的重組質(zhì)粒。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

將重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋，制成1×101～1×108 copies/反應(yīng)濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。由拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和Ct值對(duì)應(yīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)與Ct值之間存在對(duì)應(yīng)線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r？=0.9979，斜率為-3.2548，PCR的擴(kuò)增效率為102.88%在可接受范圍內(nèi)，且方法誤差較小，最低可以檢出10 copies/反應(yīng)的沙門氏菌。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

將保存1-6個(gè)月的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品取出，分別對(duì)經(jīng)稀釋后1010、107、104濃度水平的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)Ct值，由表1可知，構(gòu)建的重組質(zhì)粒在6個(gè)月內(nèi)測(cè)定值無顯著差異。

2.5 肉制品樣本的檢測(cè)

對(duì)35份樣本分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和分離培養(yǎng)方法的檢測(cè)，結(jié)果均檢出有3份樣品受沙門氏菌污染。由建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線上可得知，三份樣本的細(xì)菌濃度分別為2.4×106copies/μL 、4.3×105copies/μL和1.1×106copies/μL。對(duì)比兩種方法，本研究方法在7小時(shí)內(nèi)便能得到檢測(cè)結(jié)果，而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法需4-5天（見表2）。

3. 討 論

沙門氏菌是污染肉制品的主要致病菌之一，我國是肉制品消費(fèi)大國，沙門氏菌污染造成的危害更為嚴(yán)重。目前對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)主要還是通過培養(yǎng)和分離鑒定，但傳統(tǒng)方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，且需花費(fèi)大量人力、物力，使用TaqMan探針進(jìn)行的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)因其靈敏、快速、特異性等優(yōu)點(diǎn)受到研究者的親睞[7-9]。在熒光定量PCR反應(yīng)中，利用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)測(cè)得的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將目的樣本基因的檢測(cè)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行判讀，從而獲得靶基因的量。穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品為熒光定量PCR提供了可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而同樣的反應(yīng)條件使樣本基因與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的擴(kuò)增效率，同時(shí)也減少了樣本模板基因抽提對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。因此，要保證檢測(cè)結(jié)果的一致性和可重復(fù)性必須構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒具有環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)，將其作為標(biāo)準(zhǔn)品可長(zhǎng)期保存，具有良好的穩(wěn)定性[10]。相較于菌液提取DNA模板，無須多次制作，減少了每次實(shí)驗(yàn)的步驟，且保證初始濃度一致，使用更為便捷。

本研究沙門氏菌invA基因?yàn)榛A(chǔ)，選擇特異性片段，該基因主要編碼沙門氏菌吸附和侵襲上皮細(xì)胞的表面蛋白——侵襲蛋白，并決定其致病能力，且是沙門氏菌A-E群中高度保守基因 [11-12]。通過設(shè)計(jì)了引物和探針，對(duì)特異性序列進(jìn)行擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體。經(jīng)測(cè)序與GenBank中invA基因進(jìn)行比對(duì)，符合率達(dá)到100%。經(jīng)熒光定量PCR試驗(yàn)，結(jié)果呈陽性，證明成功構(gòu)建了含有invA基因特異片段的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。由其建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)理想的線性關(guān)系，最低能檢測(cè)10 copies/反應(yīng)。通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，不同保存時(shí)間的克隆質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，且適合長(zhǎng)期使用。

使用所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)35份肉制品樣本進(jìn)行的檢測(cè)，在2h增菌以后，結(jié)果顯示與傳統(tǒng)方法結(jié)果的符合率一致，并將檢測(cè)時(shí)間從原來的4-5天縮短至7小時(shí)，大大提高了檢測(cè)的時(shí)效。

綜上所述，使用本研究建立的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR可幫助快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌，且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定。尤其在應(yīng)對(duì)感染性腹瀉等突發(fā)群體事件時(shí)，可快速篩查病原菌，縮短響應(yīng)時(shí)間，為保障食品安全，加強(qiáng)現(xiàn)場(chǎng)處置及時(shí)提供準(zhǔn)確依據(jù)。

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