朱紅芳，潘群，李春霞，王麗瓊

(武漢市武昌醫(yī)院，武漢430063)

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miR-425對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響及其機制

朱紅芳，潘群，李春霞，王麗瓊

(武漢市武昌醫(yī)院，武漢430063)

目的 探討miR-425對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響及其機制。 方法 RT-PCR測定卵巢細胞系SKOV3及正常卵巢細胞系HOSE中miR-425表達水平，將SKOV3細胞分為lent-shmiR-425和lent-shvector組，分別轉(zhuǎn)染lent-shmiR-425和lent-shvector，24 h后行細胞劃痕試驗和Transwell侵襲小室試驗。應用TargetScan預測miR-425與PTEN因子3′端非翻譯區(qū)結(jié)合位點。將SKOV3細胞分成3組:野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組，分別共轉(zhuǎn)染miR-425及野生型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′UTR，miR-425和突變型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′WT，miR-425和對照熒光素酶質(zhì)粒，用熒光素酶試驗檢測各組熒光素酶活性。結(jié)果 在卵巢癌細胞系SKOV3中miR-425相對表達量為2.1，正常卵巢細胞系HOSE為1.0，兩者比較，P<0.05。lent-shmiR-425組劃痕愈合率為27.56%±2.14%，lent-shvector組劃痕愈合率為89.15%±6.24%，兩組比較，P<0.05。lent-shmiR-425組侵襲細胞數(shù)為(75±10)個/200倍視野，lent-shvector組侵襲細胞數(shù)為(160±20)個/200倍視野，兩組比較，P<0.05。TargetScan預測miR-425與PTEN因子3′端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點結(jié)合；野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組熒光素酶活性分別為23.70±0.93、99.27±5.90、104.00±4.02。野生型質(zhì)粒組低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組(P均<0.05)。突變型質(zhì)粒組與陰性對照組比較，P>0.05。結(jié)論 miR-425水平升高可促進卵巢癌細胞遷移和侵襲，其機制可能與miR-425靶向調(diào)節(jié)PTEN表達有關(guān)。

卵巢腫瘤；miR-425；遷移；侵襲

卵巢癌被認為是腫瘤致死性疾病的第五大元兇[1],其在診斷時往往已進入晚期[2]。如何快速早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌，監(jiān)控其侵襲轉(zhuǎn)移并實施治療，成為卵巢癌治療倍受關(guān)注的問題。微小RNA(miRNA)已被證明是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)因子[3]，其在后轉(zhuǎn)錄水平通過部分綁定到靶標mRNA，導致mRNA降解以及翻譯抑制[4]，精確調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移和免疫反應等[5]。miR-425家族包括miR-425、miR-425-3p和miR-425-5p。miR-425在乳腺癌中的功能已被報道[6]。PTEN是人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙磷酸酶活性的抑癌基因，其異常廣泛存在于人類多種惡性腫瘤中[6]。然而，miR-425在卵巢癌中的表達及其與PTEN基因的關(guān)系，以及在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。2015年2月～2016年2月，本研究著重探討了miR-425對卵巢癌遷移和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細胞系SKOV3和正常人卵巢上皮細胞系HOSE購自武漢大學醫(yī)學院實驗中心。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen，Carksbad，CA，USA),實驗所需一抗(santa公司)，二抗(武漢博士德生物有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Hyclone公司),lent-shmiR-425和lent-shvector(RiboBio公司)。TRIzol(Invitrogen，Carksbad，CA，USA),All-in-One microRNA抽提試劑盒和All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒 (GeneCopoeia, Carlsbad, CA, USA)，ABI Prism7700 System(ABI, Foster City,CA,USA)，SYBR Green Reagents (TaKaRa, Tokyo, Japan)

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SKOV3和HOSE細胞系置于添加了10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。取對數(shù)期SKOV3細胞分成lent-shmiR-425組及l(fā)ent-shvector組，依照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書對兩組分別轉(zhuǎn)染lent-shmiR-425和lent-shvector，最終轉(zhuǎn)染濃度為20 nmol/L。培養(yǎng)24 h后行細胞劃痕及Transwell侵襲小室試驗。

1.3 細胞miR-425基因的相對表達量檢測 采用RT-PCR 法。采用All-in-One microRNA抽提試劑盒提取細胞總miRNA, All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒分離miRNAs。按試劑盒說明書進行qRT-PCR反應。miR-425和U6的引物由GeneCopoeia (Carlsbad, CA, USA)設計,反應體系：1×Taq Buffer 2 μL,25 mmol/L MgCl21.2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.2 μL,10 pmol/μL上游引物0.4 μL,10 pmol/μL下游引物0.4 μL,cDNA模板 1 μL,DEPC水 14.7 μL，2.5 U/μL Taq酶0.1 μL。反應條件：95 ℃ 預變性10 min, 95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，在4 ℃下共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法定量，以U6小核RNA作為內(nèi)參，計算miR-425基因的相對表達量。

1.4 細胞遷移能力的檢測 采用細胞劃痕試驗。將lent-shmiR-425組和lent-shvector組細胞培養(yǎng)于6孔板，待細胞融合后，用無菌槍頭沿直線用力劃直線。計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(遷移前劃痕面積-遷移后劃痕面積)/遷移前劃痕面積×100%。重復3次。劃痕愈合率越高，表示遷移能力越高。

1.5 細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell侵襲小室試驗。lent-shmiR-425組和lent-shvector組各取5×104細胞, 種在Transwell小室的碳酸磷脂表面，含10 % FBS的 RPMI1640置于下層作為化學引誘物。孵育24 h后，移走上層細胞。遷移侵染的細胞與4%聚丙烯混合，0.2%結(jié)晶紫染色，顯影并在倒置顯微鏡200倍視野下觀察計數(shù)。隨機取10個視野，實驗重復3次，取平均值。

1.6 生物信息學分析及預測 通過TargetScan(http://www.targetscan.org)、mirDB(http://mirdb.org)及PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)三種生物信息學軟件預測可能靶向作用于PTEN的miRNA。

1.7 miR-425與PTEN靶向關(guān)系的驗證 采用熒光素酶試驗。細胞轉(zhuǎn)染前24 h, 將SKOV3細胞接種于24孔板中，分成野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組及陰性對照組，野生型質(zhì)粒組共轉(zhuǎn)染miR-425及野生型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′UTR，突變型質(zhì)粒組共轉(zhuǎn)染miR-425和突變型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′WT，陰性對照組共轉(zhuǎn)染miR-425和對照熒光素酶質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行熒光活性檢測。獨立重復試驗3次，每次6個復孔。以海腎熒光素光吸收值作為內(nèi)參。螢光素酶活性=螢火蟲熒光素光吸收值/海腎熒光素光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 不同細胞系中miR-425的表達比較 在卵巢癌細胞系SKOV3中miR-425相對表達量為2.1，在正常卵巢細胞系HOSE中miR-425相對表達量為1.0，兩者比較，P<0.05。

2.2 各組細胞遷移和侵襲能力比較lent-shmiR-425組與lent-shvector組miR-425表達量分別為0.16和1.98,提示lent-shmiR-425沉默表達成功。24h后，lent-shmiR-425組劃痕愈合率為27.56%±2.14%，lent-shvector組劃痕愈合率為89.15%±6.24%，兩組比較，P<0.05。lent-shmiR-425組侵襲細胞數(shù)為(75±10)個/200倍視野，lent-shvector組侵襲細胞數(shù)為(160±20)個/200倍視野，兩組比較，P<0.05。

2.3 各組熒光素酶活性比較 野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組分別為23.70±0.93、99.27±5.9、104.00±4.02。野生型質(zhì)粒組顯著低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組(P均<0.05)。突變型質(zhì)粒組與陰性對照組相比，P>0.05。

3 討論

卵巢癌是起源于上皮細胞的惡性腫瘤。因發(fā)現(xiàn)時往往是晚期及惡性程度高，卵巢癌預后不佳、進展較快。明確卵巢癌的惡性腫瘤生物學特征及其機制對設計新的治療藥物和手段具有重要意義。

miRNA是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA前體，經(jīng)過Dicer加工后的一類非編碼的小分子RNA(18～25個核苷酸)，通過與靶基因的種子區(qū)序列相互配對抑制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，廣泛存在于真核生物體中。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種腫瘤組織包括卵巢癌中均有特異性的表達譜，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個階段，且每一個階段都有相應的基因發(fā)生改變，同時也有調(diào)控這些基因的miRNA發(fā)生變化。已有研究表明，miR200c、miR141、miR199a、miR145、miR130和miR101等miRNA對卵巢癌細胞生長過程均有不同程度的調(diào)控[7]。另有研究表明，miR-425可以調(diào)控乳腺癌細胞的增殖、提高肺癌細胞的侵襲性。本研究結(jié)果顯示，在卵巢癌細胞系中miR-425高表達，在SKOV3中轉(zhuǎn)染lent-shmiR-425下調(diào)miR-425表達，行細胞劃痕及遷移試驗，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-425表達后卵巢癌細胞遷移和侵襲能力減弱。提示miR-425促進卵巢癌遷移和侵襲，起促癌作用。

PTEN是腫瘤抑制子家族中的一員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，廣泛參與包括細胞增殖、再生、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程。PTEN定位于染色體10q23，可通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶等多種信號轉(zhuǎn)導途徑，調(diào)控細胞周期和遷移[8]。有研究認為，PTEN基因敲除導致的胃癌可被miR-236介導的cyclinD1/cdc25A信號通路調(diào)控。有研究顯示，miR-205通過靶向作用于PTEN調(diào)節(jié)人類鼻咽癌的抗輻射性。本研究通過TargetScan預測到miR-425與PTEN因子3′端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點。雙熒光素酶試驗發(fā)現(xiàn)，野生型質(zhì)粒組熒光素酶活性低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組，證實miR-425與PTEN是靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。本研究首次在卵巢癌中研究miR-425的表達及對卵巢癌遷移和侵襲的影響，是對miRNA在卵巢癌細胞中表達譜的有益補充，是對卵巢癌腫瘤生物學行為的進一步揭示，有可能成為一種新的治療分子靶標。

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王麗瓊(E-mail:liqiongwang@21cn.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.011

R737.31

A

1002-266X(2016)45-0037-03

2016-06-08)