張 成， 賈海鋒， 王 劍， 糾松濤， 王夢琦

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇南京 210095)

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利用鉀吸收基因表達(dá)評價葡萄葉面噴施鉀肥效果和噴施濃度

張 成， 賈海鋒*， 王 劍， 糾松濤， 王夢琦

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇南京 210095)

【目的】葉面噴施鉀肥可以快速、 高效地為葡萄補(bǔ)充鉀營養(yǎng)，促進(jìn)葡萄的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于葡萄生產(chǎn)中。本實(shí)驗(yàn)通過對葡萄葉面噴施不同種類及濃度鉀肥，測定葡萄葉片和果實(shí)等生理指標(biāo)變化，以及鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)變化，從生理和基因水平上評價這些鉀肥的噴施效果，為葡萄生產(chǎn)中鉀肥的施用提供一定指導(dǎo)?！痉椒ā勘緦?shí)驗(yàn)以‘夏黑’葡萄為試材，選擇兩個葡萄生長關(guān)鍵時期盛花期和果實(shí)膨大期分別對葡萄葉片噴施0.2%、 0.5%和0.8%三種濃度的K2SO4、 K2CO3、 K2SO4·2MgSO4和KCl。然后對葡萄葉片和新梢的生長率，坐果率，葉綠素含量，單粒重，可溶性固形物等生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)分析4個鉀吸收相關(guān)基因VvHAK13、VvKEA2、VvSIRK和VvSORK的表達(dá)情況。【結(jié)果】葉面噴施4種鉀肥后，葡萄葉片和新梢的生長率，坐果率，葉綠素含量，單粒重，可溶性固形物等各項(xiàng)生理指標(biāo)均有不同程度的提升。鉀肥種類不同，最適噴施濃度不同，同種鉀肥在葡萄盛花期和果實(shí)膨大期的最適噴施濃度也有所不同，四種鉀肥在果實(shí)膨大期的最適噴施濃度普遍高于盛花期。四個鉀吸收相關(guān)基因在噴施不同種類及濃度鉀肥后也表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，總體來講VvKEA2、VvSIRK、VvSORK的表達(dá)上調(diào)，而VvHAK13的表達(dá)下調(diào)。果實(shí)膨大期，需噴施較高濃度的鉀肥，鉀吸收相關(guān)基因才表現(xiàn)出較強(qiáng)烈的響應(yīng)，而在盛花期則只需噴施較低濃度的鉀肥。綜合生理指標(biāo)和基因表達(dá)兩方面結(jié)果,得出4種鉀肥效果依次為K2SO4·2MgSO4>K2SO4>K2CO3>KCl。盛花期K2SO4和K2CO3的最適噴施濃度為0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的最適噴施濃度為0.2%; 果實(shí)膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的最適噴施濃度為0.5%，K2CO3的最適噴施濃度為0.8%。【結(jié)論】葡萄葉面噴施鉀肥可以有效促進(jìn)葡萄葉片和果實(shí)的生長發(fā)育，四種鉀肥的效果依此為: K2SO4·2MgSO4>K2SO4>K2CO3>KCl。盛花期K2SO4和K2CO3的最適噴施濃度為0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的最適噴施濃度為0.2%; 果實(shí)膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的最適噴施濃度為0.5%，K2CO3的最適噴施濃度為0.8%。適宜的噴施濃度可以有效提高鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)，是其提高鉀吸收利用的機(jī)理之一。

葡萄; 葉面噴肥; 鉀肥; 鉀吸收基因; 基因表達(dá)

作為喜鉀植物，葡萄對鉀營養(yǎng)的需求巨大，葉面噴肥鉀肥具有技術(shù)簡單、 用量少、 見效快、 利用率高等優(yōu)點(diǎn)，在葡萄生產(chǎn)中逐漸被廣泛應(yīng)用[1-3]。鉀素在提高葡萄抗逆性、 抗病性，促進(jìn)果實(shí)發(fā)育，提高產(chǎn)量，增進(jìn)品質(zhì)等方面作用顯著[4-7]，如Alt1ndili等[8]報道葡萄噴施1%2%的KNO3可以顯著提高葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量，鄭秋玲等[9]研究表明葉面噴施KH2PO4能使赤霞珠葡萄枝條中可溶性糖及淀粉的含量分別提高74.7%和27.7%。近年來，葡萄全基因的測序?yàn)榛蛐畔?yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了全新的思路和條件[10-12]，初建青等利用葡萄N代謝相關(guān)基因的表達(dá)信息判斷施肥效果[13-14]，王晨等利用葡萄花果發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)信息描繪了葡萄物候期，并用來指導(dǎo)葡萄精確施肥[15]。葡萄生長發(fā)育不僅受營養(yǎng)狀況影響，還受各種外界環(huán)境的影響，基因信息可以精準(zhǔn)反映植物營養(yǎng)吸收、 轉(zhuǎn)運(yùn)、 代謝等生理狀態(tài)。通過分析葡萄葉面噴施鉀肥后其葉、 花、 果等生理指標(biāo)的變化以及鉀吸收、 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，我們可以從宏觀和微觀兩個層面全面而精準(zhǔn)地評價不同鉀肥的作用效果，并篩選出適合葡萄葉面噴施的鉀肥種類及濃度。本文擬通過葡萄葉面噴施鉀肥實(shí)驗(yàn)，從葡萄新梢生長、 葉片生長、 葉綠素含量、 坐果率、 果實(shí)單粒重、 可溶性固形物等生理指標(biāo)，以及4個鉀吸收相關(guān)基因: 鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體13(probable K+transporter 13,HAK13)、 鉀離子反向轉(zhuǎn)運(yùn)體2(K+efflux antiporter 2,KEA2)、 shaker家族內(nèi)向整流鉀離子通道(inward rectifying shaker-like K+channel,SIRK)、 shaker家族外向整流鉀離子通道(shaker-like potassium channel,SORK)的表達(dá)量兩方面綜合分析，評價不同種類鉀肥及其濃度的作用效果，以期為葡萄生產(chǎn)中鉀肥的施用提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料來源

本研究所用實(shí)驗(yàn)材料為5年生‘夏黑’(V.vinifera×V.labruscaSumerblack)葡萄，由江蘇省農(nóng)博園提供。 K2SO4、 K2CO3、 KCl購自南京化學(xué)試劑有限公司，K2SO4·2MgSO4購自青海中信國安科技發(fā)展有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京基天生物技術(shù)有限公司。熒光定量染料SYBR GreenⅠ購自上海浦迪生物科技有限公司。所用引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(表1)。

1.2試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)采用兩個噴施時期和三個噴施濃度，以噴清水為對照。噴施時期為盛花期(2014年5月25日)和果實(shí)膨大期(2014年7月16日)，三個噴施濃度為0.2%、 0.5%、 0.8%的K2SO4、 K2CO3、 K2SO4·2MgSO4和KCl溶液(質(zhì)量比)。選長度和粗度基本一致的葡萄植株，于上午7點(diǎn)對葡萄葉面和葉背分別噴施鉀肥，噴施量以葉面滴水為度。每個處理3棵葡萄，分別于噴施后0、 6、 12、 24和48 h采第15個節(jié)位長枝條上的第9、 10節(jié)位的成熟葉片，液氮處理后-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生理指標(biāo)測定每個處理隨機(jī)選取10個枝條，分別于處理前和處理10天后測量新梢長度和成熟葉的長與寬，計算新梢生長率和葉片大小增長率。盛花期噴施鉀肥后，每個處理隨機(jī)選取10個花序，統(tǒng)計花蕾數(shù)，待坐果后統(tǒng)計坐果數(shù)，計算坐果率。坐果率(%)=(坐果數(shù)/花蕾數(shù))×100。

噴施處理10天后采第15個節(jié)位長枝條上的第9、 10節(jié)位的成熟葉片測定葉綠素含量。測定和計算方法參考郝再彬等[16]和葉濟(jì)寧[17]的方法。

果實(shí)成熟時(8月10日)，每處理隨機(jī)選取10穗葡萄，用電子天平(0.01g)稱量單果重，并用可溶性固形物含量濃度檢測儀(LH-T32，杭州陸恒生物)測量葡萄可溶性固形物含量。

測得的各項(xiàng)生理數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行方差分析。

1.3.2 RNA的提取與CDNA的合成‘夏黑’葡萄葉片總RNA的提取、 消化參照張彥蘋等[18]和Chang等[19]的方法。mRNA的純化采用Promega公司生產(chǎn)的PloyATtract? mRNA Isolation System IV試劑盒進(jìn)行。cDNA合成以mRNA為模板，引物P01反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，引物P02延伸加帽子，空氣加熱條件下42℃保溫1 h，75℃保溫10 min，冰上冷卻2min后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR應(yīng)用Bio-Rad My-IQ 2熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時定量。反應(yīng)體系按SYBR GreenⅠ(TOYOBO)說明書進(jìn)行。以葡萄看家基因UBI作為內(nèi)參。擴(kuò)增體系含1 μL cDNA，上下游引物各0.8 μL(引物信息詳見表1)，10 μL反應(yīng)MIX，7.4 μLddH2O，總體系20μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性1 min，95℃變性10 s，Tm退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán); 反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及融解曲線。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用LinRegPCR[21]和Excel軟件分析，采用2-△△CT計算方法，以0 h為對照進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

表1　熒光定量PCR引物

2　結(jié)果與分析

2.1葉面噴施不同濃度鉀肥對坐果率的影響

鉀肥可以促進(jìn)葡萄花果發(fā)育，對葡萄坐果率有重要影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葉面噴施四種鉀肥對葡萄坐果率的影響均達(dá)到了顯著水平。其中K2SO4·2MgSO4效果最佳，在0.2%的噴施濃度下坐果率高達(dá)48.3%，比對照增長19.8%。K2SO4效果次之，其噴施濃度為0.5%時坐果率最高，為46.33%，比對照提高14.9%。K2CO3和KCl效果最差，其噴施濃度均為0.5%時坐果率最高，分別為43.63%和43.30%，分別比對照提高8.1%和7.4%(表2)。

表2　不同鉀肥不同噴施濃度下葡萄的坐果率(%)

注(Note): 數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達(dá)到5%顯著水平 Values followed by different letters mean significant difference among treatments at 5% level.

2.2葉面噴施不同濃度鉀肥對葉片和新梢生長的影響

葡萄葉片和新梢是葡萄的重要營養(yǎng)器官，葉面噴肥可以直接作用于葉片和新梢，對其生長有著巨大影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示盛花期和果實(shí)膨大期噴施鉀肥均可以顯著影響葉片和新梢的生長。四種鉀肥均以K2SO4·2MgSO4效果最佳，其在盛花期噴施濃度為0.2%時葉片增長率和新梢增長率最高，果實(shí)膨大期噴施濃度為0.5%時葉片增長率最高，噴施濃度為0.2%時新梢增長率最高。K2CO3效果次之，其在盛花期的噴施濃度為0.5%時新梢和葉片的增長率最高，在果實(shí)膨大期的噴施濃度為0.8%時新梢和葉片增長率最高。K2SO4和KCl效果最差，這兩種鉀肥在盛花期的噴施濃度為0.2%時新梢和葉片的增長率較高，而在果實(shí)膨大期的噴施濃度為0.5%時新梢和葉片的增長率較高(表3)。

表3　不同鉀肥不同噴施濃度下葡萄葉片和新梢增長率(%)

注(Note): 數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達(dá)到5%顯著水平 Values followed by different letters mean significant difference among treatments at 5% level.

2.3葉面噴施不同濃度鉀肥對葉片葉綠素含量的影響

四種鉀肥在不同噴施濃度下對葡萄葉片葉綠素含量的影響均達(dá)到了顯著水平。其中K2SO4·2MgSO4效果最顯著，盛花期噴施濃度為0.2%時葉綠素含量最高，果實(shí)膨大期噴施濃度為0.5%時葉綠素含量最高。K2SO4和K2CO3效果次之，盛花期兩種鉀肥噴施濃度均為0.5%時葡萄葉片葉綠素含量最高，果實(shí)膨大期K2SO4噴施濃度為0.5%時葉綠素含量最高，K2CO3噴施濃度為0.8%時葉綠素含量最高。KCl效果最差，其在盛花期和果實(shí)膨大期的噴施濃度均為0.5%時葉綠素含量最高(表4)。

表4　不同鉀肥不同噴施濃度下葉片葉綠素含量(mg/g, FW)

注(Note): 數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達(dá)到5%顯著水平 Values followed by different letters mean significant difference among treatments at 5% level.

2. 4葉面噴施不同濃度鉀肥對葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響

葡萄果實(shí)可溶性固形物含量主要指葡萄果實(shí)中可溶性糖類物質(zhì)的積累量，葡萄單果重則指葡萄單粒果實(shí)的平均重量，這兩項(xiàng)指標(biāo)是評價葡萄果實(shí)品質(zhì)的重要參考。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葡萄葉面噴施不同種類及濃度鉀肥對這兩項(xiàng)指標(biāo)的影響差異較大。K2SO4·2MgSO4效果最顯著，其在盛花期的噴施濃度為0.2%時果實(shí)單粒重和可溶性固形物均達(dá)到最高，在果實(shí)膨大期噴施濃度為0.5%時兩項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到最高。K2SO4和K2CO3效果次之，其中K2SO4在兩個時期的噴施濃度均為0.5%時葡萄果實(shí)單粒重和可溶性固形物達(dá)到最高，而K2CO3在盛花期的噴施濃度為0.5%時果實(shí)單粒重和可溶性固形物含量最高，在果實(shí)膨大期噴施濃度為0.8%時單粒重最高，噴施濃度為0.5%時可溶性固形物含量最高。KCl效果最差，其對單粒重和果實(shí)可溶性固形物的影響均不顯著，甚至對果實(shí)可溶性固形物產(chǎn)生了不利影響，例如在果實(shí)膨大期三個噴施濃度均降低了葡萄果實(shí)的可溶性固形物含量(表5)。

表5　不同鉀肥不同噴施濃度下葡萄單粒重和可溶性固形物含量

注(Note): 數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達(dá)到5%顯著水平 Values followed by different letters mean significant difference among treatments at 5% level.

2.5葉面噴施不同濃度鉀肥對鉀吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5.1 葉面噴施4種鉀肥對VvHAK13表達(dá)的影響VvHAK13屬于高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體KUP/HAK/KT家族，不僅負(fù)責(zé)對K+的吸收，對K+在植物體內(nèi)的運(yùn)輸也有著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葉面噴施4種鉀肥均對VvHAK13的表達(dá)產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，VvHAK13的表達(dá)主要呈現(xiàn)先降低后升高和不斷降低兩種模式。在盛花期，K2SO4和K2CO3的噴施濃度不超過0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的噴施濃度不超過0.2%時，VvHAK13的表達(dá)呈先降低后升高趨勢，超過時，VvHAK13的表達(dá)則呈不斷降低趨勢。在果實(shí)膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的噴施濃度不超過0.5%時VvHAK13的表達(dá)均呈先降低后升高趨勢，超過0.5%時VvHAK13的表達(dá)則呈不斷降低趨勢，而K2CO3在三個噴施濃度下VvHAK13的表達(dá)均呈先降低后升高趨勢(圖1)。

圖1　不同鉀肥不同噴施濃度下VvHAK13的表達(dá)Fig.1　Relative expression of VvHAK13 under different K fertilizers with different spraying concentrations

2.5.2 葉面噴施4種鉀肥對VvKEA2表達(dá)量的影響VvKEA2編碼K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬于CPA2家族，主要參與鉀的裝載，如在液胞中，KEA可能通過質(zhì)子泵介導(dǎo)H+/K+的交換，從而完成鉀的裝載。本研究結(jié)果顯示，兩個時期噴施4種鉀肥均明顯促進(jìn)了VvKEA2的表達(dá)。噴施K2SO4·2MgSO4對VvKEA2表達(dá)的促進(jìn)作用最明顯，K2SO4和K2CO3次之，KCl最差。盛花期K2SO4和K2CO3噴施濃度為0.5%時VvKEA2的表達(dá)量最高，而K2SO4·2MgSO4和KCl的噴施濃度為0.2%時VvKEA2的表達(dá)量最高，在最適噴施濃度下該時期VvKEA2的表達(dá)量呈先提高后降低趨勢。果實(shí)膨大期K2CO3的噴施濃度為0.8%時VvKEA2的表達(dá)量最高，其余三種鉀肥的噴施濃度均為0.5%時VvKEA2的表達(dá)量最高，在最佳噴施濃度下該時期VvKEA2的表達(dá)均隨時間延長不斷提高，說明該時期鉀肥的效果比盛花期更加持久(圖2)。

2.5.3 葉面噴施4種鉀肥對VvSIRK表達(dá)量的影響VvSIRK屬于Shaker鉀離子通道中內(nèi)向整流K+通道基因，主要負(fù)責(zé)鉀離子的低親和吸收。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示葉面噴施K2CO3對VvSIRK的影響最為明顯，其次是K2SO4·2MgSO4、 K2SO4和KCl。葉面噴肥處理后VvSIRK在兩個時期的表達(dá)均呈先升高后降低趨勢。盛花期四種鉀肥的噴施濃度均為0.2%時VvSIRK的表達(dá)量達(dá)到最高。果實(shí)膨大期K2SO4·2MgSO4的噴施濃度為0.2%時VvSIRK的表達(dá)量最高，K2SO4和KCl的噴施濃度為0.5%時VvSIRK的表達(dá)量最高，而K2CO3的噴施濃度為0.8%時VvSIRK的表達(dá)量最高。相比于其他3個基因，VvSIRK的表達(dá)受到低濃度鉀肥的影響較為明顯，尤其在盛花期，幾種鉀肥均在0.2%的噴施濃度下使VvSIRK的表達(dá)量達(dá)到最高(圖3)。這可能與SIRK屬于低親和鉀離子吸收通道，主要負(fù)責(zé)低濃度鉀離子的吸收有關(guān)。

2.5.4 葉面噴施4種鉀肥對VvSORK表達(dá)量的影響

圖2　不同鉀肥不同噴施濃度下VvKEA2的表達(dá)Fig.2　Relative expression of VvKEA2 under different K fertilizers with different spraying concentrations

圖3　不同鉀肥不同噴施濃度下VvSIRK的表達(dá)Fig.3　The expression of VvSIRK under different K fertilizers with different spraying concentrations

VvSORK屬于Shaker鉀離子通道中外向整流K+通道，在植物地上部K+的積累中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葉面噴施K2SO4·2MgSO4對VvSORK的影響最明顯，其次是K2SO4、 K2CO3和KCl。盛花期K2SO4和K2CO3的噴施濃度為0.5%時VvSORK的表達(dá)量最高，K2SO4·2MgSO4和KCl的噴施濃度均為0.2%時VvSORK的表達(dá)量最高。果實(shí)膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的噴施濃度均為0.5%時VvSORK的表達(dá)量最高，而K2CO3的噴施濃度為0.8%時VvSORK的表達(dá)量最高。盛花期噴施K2SO4和KCl后VvSORK的表達(dá)量先升高后降低，而在果實(shí)膨大期噴施后VvSORK的表達(dá)量則隨時間延長不斷升高。噴施K2CO3和K2SO4·2MgSO4后，VvSORK表現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)模式，噴施K2CO3后VvSORK的表達(dá)量先升高后降低再升高，而噴施K2SO4·2MgSO4后VvSORK的表達(dá)則先降低，隨后又開始大幅度升高(圖4)。

圖4　不同鉀肥不同噴施濃度下VvSORK的表達(dá)Fig.4　The expression of VvSORK under different K fertilizers with different spraying concentrations

3　討論

鉀是植物細(xì)胞中最豐富的離子，在植物的生長和發(fā)育中起重要作用，如促進(jìn)酶的活化、 蛋白質(zhì)合成、 光合作用，維持滲透壓、 調(diào)節(jié)葉片和氣孔運(yùn)動和細(xì)胞伸長等[20-25]。葡萄鉀吸收、 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究主要集中在根際施鉀對葡萄漿果及葡萄酒品質(zhì)的影響上[26-30]，對于葡萄葉面噴施鉀肥相關(guān)理論的研究尚且不多。葉面噴施鉀肥技術(shù)已經(jīng)在棉花[31-33]、 小麥[34]、 馬鈴薯[35]等作物上得到了廣泛應(yīng)用和深入研究，研究結(jié)果均表明葉面噴施鉀肥可以有效提高作物的產(chǎn)量、 品質(zhì)、 抗病性等。本研究表明對葡萄葉面噴施鉀肥不僅可以促進(jìn)葡萄葉片和新梢的營養(yǎng)生長，為后期果實(shí)的發(fā)育提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)，也可提高葡萄的坐果率和單粒重、 可溶性固形物等品質(zhì)指標(biāo)，有助于提升葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量。

葡萄生長發(fā)育不同時期對營養(yǎng)的需求有所差異，因此各時期的施肥效果也不同，其中施肥效果最好的時期應(yīng)為植物營養(yǎng)的最大效率期[41]。據(jù)Abha等的研究報道，在葡萄坐果30天后葉面噴施K2SO4，隨著K2SO4濃度的增大，葡萄果實(shí)可溶性固形物總量及總糖含量明顯增加[42]。馬文娟等[43]、 張志勇等[44]研究顯示，果實(shí)膨大期葡萄鉀累積量最大，該時期葡萄漿果快速生長、 糖分快速積累，此時施用鉀肥，既可滿足葡萄成熟對鉀的需求，又有助于提高葡萄品質(zhì)。Pratelli等研究發(fā)現(xiàn)VvSIRK在葡萄果實(shí)快速發(fā)育時期具有較高的表達(dá)量[45]，說明該時期葡萄植株需要從外界吸收較多的鉀元素，以滿足葡萄漿果快速膨大對營養(yǎng)元素的需求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究較為相似。在葡萄果實(shí)膨大期噴施鉀肥效果更佳，且肥效更加持久。在果實(shí)膨大期噴施鉀肥后，葡萄葉片和果實(shí)各項(xiàng)生理指標(biāo)提升幅度明顯高于盛花期，該時期三個重要鉀吸收基因VvSIRK、VvKEA2、VvSORK在最佳噴施濃度下均能保持較長時間的高表達(dá)水平，且表達(dá)量隨時間延長不斷升高，說明該時期噴施鉀肥比盛花期噴施具有更高更持久的肥效。此外，果實(shí)膨大期葡萄對鉀肥噴施液濃度要求更高，例如KCl和K2SO4·2MgSO4在該時期的最適噴施濃度為0.5%，而在盛花期則為0.2%。

本實(shí)驗(yàn)中所選的4個鉀吸收相關(guān)基因所編碼的蛋白是葡萄鉀離子吸收、 轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道或載體，其表達(dá)量反映了葡萄植株中鉀離子吸收運(yùn)輸?shù)幕钴S程度，葉面噴施鉀肥后，這些基因表達(dá)越活躍，說明其對鉀的吸收效率越高，因此也越有利于葡萄葉片和果實(shí)等的生長發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一觀點(diǎn)，鉀吸收基因的表達(dá)和葡萄生理指標(biāo)的變化具有較高的一致性，葉面噴施鉀肥后，基因響應(yīng)劇烈、 持續(xù)時間長的，葉片和果實(shí)等生理指標(biāo)提升也更明顯。這也證明了利用基因表達(dá)水平評價鉀肥肥效的有效性。實(shí)驗(yàn)中噴施K2CO3和K2SO4·2MgSO4后VvSORK呈現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)模式，其表達(dá)量先下降后上升，或者先上升后下降再上升。Lacombe等的研究表明植物中SORK通道受到細(xì)胞內(nèi)外pH的強(qiáng)烈影響[46]，而K2CO3溶液呈弱堿性，K2SO4·2MgSO4溶液呈弱酸性，這可能是造成VvSORK獨(dú)特表達(dá)模式的原因。這種現(xiàn)象也提示我們在對作物進(jìn)行葉面噴肥的時候，肥料噴施液的pH也會影響植物對肥料的吸收效果，應(yīng)當(dāng)給予充分考慮。此外，VvHAK13和其他三個鉀吸收相關(guān)基因不同，其表達(dá)受到了葉面噴施鉀肥的抑制。Maser等，Ahn等[47-48]的研究表明缺鉀可誘導(dǎo)KUP /HAK/KT家族高親和性成員的表達(dá)，可能是因?yàn)槿扁洉r，KUP /HAK/KT家族高親和性成員參與到不同組織或細(xì)胞間K+的轉(zhuǎn)運(yùn)以平衡K+的分布。然而當(dāng)K+供應(yīng)充分時，其轉(zhuǎn)運(yùn)、 平衡K+的作用降低，這可能是造成葉面噴施鉀肥后VvHAK13表達(dá)量降低的原因。缺鉀可以誘導(dǎo)VvHAK13的表達(dá)，這一特性使得VvHAK13可被當(dāng)作“信號基因”用來預(yù)測葡萄對鉀素的需求程度。當(dāng)該基因表達(dá)量較高時，說明葡萄植株缺少鉀元素，則可以通過葉面噴施鉀肥快速補(bǔ)充鉀元素。當(dāng)其表達(dá)量較低時，則說明葡萄植株中鉀元素充足，不需補(bǔ)充鉀素。然而鉀素對VvHAK13的抑制可能涉及更為復(fù)雜的機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

葡萄葉面噴施鉀肥可以有效促進(jìn)葡萄葉片和果實(shí)的生長發(fā)育，四種鉀肥的效果依此為: K2SO4·2MgSO4>K2SO4>K2CO3>KCl。盛花期K2SO4和K2CO3的最適噴施濃度為0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的最適噴施濃度為0.2%; 果實(shí)膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的最適噴施濃度為0.5%，K2CO3的最適噴施濃度為0.8%。

適宜的噴施濃度可以有效提高鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)，是其提高鉀吸收利用的機(jī)理之一。

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Effectiveness and concentration of foliar-application of potassium fertilizers on grapevine evaluated by expression of potassium uptake related genes

ZHANG Cheng, JIA Hai-feng1*, WANG Jian1, JIU Song-tao, WANG Meng-qi1

(CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

【Objectives】 Foliar application of potassium(K) fertilizer has been widely adopted in grape production as an effective K supplement measurement. In this study, four types of K compounds were sprayed in three different concentrations at full-blooming stage and berry expansion stage of grapes, to study the responses of the physiological traits and the expression variation of K uptake related genes, and to evaluate the effectiveness of these K fertilizers and concentrations for practical grape production. 【Methods】 Grapevine cv.‘Summer Black’ (hybrid ofV.vinifera×V.labrusca) vines were used as experimental material, 0.2%, 0.5% and 0.8% solutions of K2SO4, K2CO3, K2SO4·2MgSO4and KCl were sprayed at the full-bloom stage and berry expansion stage. The growth rate of leaves and shoots, fruit setting rate, leaf chlorophyll content, single berry weight and total soluble solid content were measured, and the expression variation of the four K uptake related genes,VvHAK13,VvKEA2,VvSIRKandVvSORKwere analyzed using real-time quantitative PCR. 【Results】 All the foliar applications of K fertilizers are effective to improve the physiological indexes to different extents, and K2SO4·2MgSO4shows the best result, following are K2SO4, K2CO3, KCl. The optimum spraying concentrations are 0.2%-0.5% at full blooming stage and 0.5%-0.8% at berry expansion stage. Relatively higher K fertilizer concentration is required at berry expansion stage than at full blooming stage. The four K uptake related genes show different expression responses to the treatments. In general, the expression ofVvKEA2,VvSIRKandVvSORKare up-regulated, but that ofVvHAK13 down-regulated. In berry expansion stage, the four K uptake related genes show more remarkable responses to spraying concentrations of 0.5%-0.8%, but do the same to spraying concentration of 0.2%-0.5% at full-bloom stage.【Conclusions】 Spraying K fertilizer is effective to up-regulate the expression of K-related genes, which are reflected by the increased physiological indexes. Among the four tested fertilizers, K2SO4·2MgSO4shows the best result, following are K2SO4, K2CO3and KCl. Spraying concentration of 0.2%-0.5% is recommended in full-bloom stage and 0.5%-0.8% in the berry expansion stage of grape.

grapevine; foliar application; potassium fertilizer; potassium uptake gene; gene expression

2015-05-27接受日期: 2016-01-25

國家自然科學(xué)基金(31401847); 江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140707); 國家博士后基金(2014M561663); 中央高校特別資助(KJQN201541)資助。

張成(1988—)， 男， 河南南陽人， 碩士， 主要從事果樹營養(yǎng)研究。 E-mail: 2013104041@njau.edu.cn

E-mail: jiahaifeng@njau.edu.cn

S601; S663.1

A

1008-505X(2016)04-1091-11